白細胞介素-23受體過表達對實驗性自身免疫性葡萄膜炎小鼠輔助性T細胞17/調節性T細胞平衡的影響_《中華眼底病雜志》

作者：

吳怡媛 , 陳思思 , 楊超 , 魏瑞華 ,  粘紅

天津醫科大學眼科醫院、眼視光學院、眼科研究所國家眼耳鼻喉疾病臨床醫學研究中心天津市分中心天津市視網膜功能與疾病重點實驗室, 天津 300384;

關鍵詞：

Th17細胞 T淋巴細胞，調節性實驗性自身免疫性葡萄膜炎白細胞介素-23受體

DOI：

10.3760/cma.j.cn511434-20210809-00428

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目的初步探討白細胞介素（IL）-23受體（IL-23R）過表達對實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型小鼠輔助性T細胞17（Th17細胞）/調節性T細胞（Treg細胞）平衡的影響。方法 8周齡雌性C57BL/6J小鼠12只，隨機分為LV-Ctrl組、LV-IL-23R組，每組各6只。兩組小鼠經尾靜脈分別注射 LV-Ctrl、LV-IL-23R慢病毒；注射后7 d采用光感受器間維生素A類結合蛋白_1-20主動免疫構建EAU小鼠模型。免疫后13 d開始，每2天使用間接檢眼鏡觀察小鼠眼底并進行臨床評分。免疫后30 d，蘇木精-伊紅染色觀察小鼠視網膜組織病理學改變。酶聯免疫吸附測定檢測兩組小鼠血清中IL-17水平；流式細胞儀檢測Th17細胞和Treg細胞比例；實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測IL-23R、IL-17、維甲酸相關孤兒受體γt（RORγt）、IL-10和叉頭狀轉錄因子p3（Foxp3） mRNA相對表達量。組間比較采用重復測量方差分析、獨立樣本Mann-Whitney U檢驗和獨立樣本t檢驗。結果與LV-Ctrl組比較，LV-IL-23R組小鼠視網膜炎癥反應更重。免疫后13 d，LV-IL-23R組、LV-Ctrl組小鼠眼底炎癥評分差異無統計學意義（t=－2.001，P=0.058）；免疫后15～29 d，LV-IL-23R組小鼠眼底炎癥評分均高于LV-Ctrl組，差異有統計學意義（t=－4.429、－6.578、－7.768、－10.183、－6.325、－7.304、－4.841、－6.872，P＜0.001）。組織病理學檢查顯示，與LV-Ctrl組比較，LV-IL-23R組眼底炎性細胞浸潤增多，視網膜結構破壞更為嚴重，組織病理學評分顯著升高，差異有統計學意義（t=－4.339，P=0.001）。與LV-Ctrl組比較、LV-IL-23R組小鼠脾臟中IL-23R mRNA相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（Z=2.087，P=0.037）；T細胞中IL-17、RORγt mRNA相對表達量增加，IL-10、Foxp3 mRNA相對表達量降低，差異均有統計學意義（t=－6.313、－5.922、4.844、7.572，P=0.003、0.004、0.008、0.002）。與LV-Ctrl組比較、LV-IL-23R組小鼠血清中IL-17水平明顯升高，差異有統計學意義（t=－5.423，P=0.002）；脾臟和淋巴結中Th17細胞比例明顯升高，Treg細胞比例顯著降低，差異有統計學意義（t=－4.290、3.700，P=0.002、0.006）。結論 IL-23R過表達可促使EAU小鼠的Th17/Treg失衡，加重EAU臨床及病理表現。

引用本文： 吳怡媛, 陳思思, 楊超, 魏瑞華, 粘紅. 白細胞介素-23受體過表達對實驗性自身免疫性葡萄膜炎小鼠輔助性T細胞17/調節性T細胞平衡的影響. 中華眼底病雜志, 2022, 38(5): 389-395. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210809-00428 復制

自身免疫性葡萄膜炎是一種常見的致盲性眼病，其病因及發病機制尚不完全明確^[1]。CD4⁺T細胞在自身免疫性葡萄膜炎中發揮主導作用，其中，輔助性T細胞17（Th17）通過分泌白細胞介素（IL）-17等多種炎性因子，調節固有免疫和適應性免疫反應，是自身免疫性葡萄膜炎的主要致病細胞群^[2-4]；而調節性T細胞（Treg）特異性表達叉頭狀轉錄因子p3（Foxp3），主要分泌IL-10等抑炎因子，抑制機體對自身抗原的免疫反應^[5-6]。研究證實，Th17細胞與Treg細胞的平衡是維持眼內免疫穩態的基礎，該平衡決定了自身免疫性葡萄膜炎的發展和轉歸^[7-8]。目前研究認為，IL-23是維持Th17細胞穩定性和致病性的關鍵細胞因子^[9-10]，IL-23與Th17細胞表面的IL-23受體（IL-23R）結合，促進Th17細胞分泌IL-17、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等炎性因子^[4]。研究發現，IL-23R/IL-17軸在自身免疫性關節炎、炎性腸病等多種自身免疫性疾病中發揮致病作用^[11-12]；在Vogt-Koyanagi-Harada綜合征患者的外周血單個核細胞中，IL-23R的表達水平顯著升高^[13]，提示IL-23R可能參與了自身免疫性葡萄膜炎的發生和發展。但IL-23R對自身免疫性葡萄膜炎的具體作用及機制尚不明確。因此，本研究以實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）為研究對象^[14]，采用慢病毒介導IL-23R過表達，初步探討IL-23R對EAU疾病進程的影響和對Th17/Treg平衡的調控作用。現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人胚胎腎細胞系293T（美國ATCC細胞庫）；IL-23R過表達質粒pReceiver-Lv201-IL-23R及其對照質粒（美國Gene-Copoeia公司）；輔助包裝質粒pSPAX2和pMD2.G（美國Addgene公司）；LipoFiter^TM （上海漢恒生物有限公司）；聚乙二醇8000、Dulbecco改良Eagle培養基（美國Gibco公司）；光感受器間維生素A類結合蛋白_1-20（IRBP_1-20）多肽片段（上海生物工程股份有限公司合成）；結核分枝桿菌H37RA（美國Difco公司）；百日咳毒素、弗氏不完全佐劑（美國Sigma公司）；RPMI1640培養基、胎牛血清（美國Hyclone公司）；小鼠IL-17酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、重組鼠IL-23蛋白（美國R&D公司）；RNA提取試劑盒（美國EZBioscience公司）；逆轉錄試劑盒、SYBR Green 2× Master Mix（美國Thermo公司）；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）、布雷菲爾得菌素A（BFA）、鈣離子霉素（美國Sigma公司）；固定劑、破膜劑、TruStain FcX? PLUS封閉劑、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗小鼠IL-17流式抗體（FITC-IL-17）、巰基化藻紅蛋白（PE）標記的抗小鼠CD4流式抗體（PE-CD4），FITC標記的抗小鼠CD4流式抗體（FITC-CD4）、PE標記的抗小鼠Foxp3流式抗體（PE-Foxp3）（美國Biolegend公司）；7900HTFAST實時聚合酶鏈反應（PCR）儀（愛普拜斯應用生物系統貿易上海有限公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 實驗動物分組、EAU模型建立及T細胞分離

健康雌性C57BL/6J小鼠12只，鼠齡8～10周，體重約20 g，無特定病原體級（北京維通利華實驗動物技術有限公司）。實驗前排除眼部疾病及其他異常。飼養環境及實驗操作符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得天津醫科大學動物管理及使用委員會批準（批準號：TJYY2019110117）。

采用隨機數字表法將小鼠分為LV-Ctrl組、LV-IL-23R組，每組各為6只。小鼠尾靜脈分別注射200 μl滴度為1×10⁸ TU/ml的對照慢病毒或IL-23R過表達慢病毒^[15-16]。注射后7 d，兩組小鼠腹腔注射800 ng百日咳毒素，于小鼠單后足和脊柱兩側皮下注射含有200 μg IRBP_1-20、0.8 mg結核分枝桿菌H37RA和不完全弗氏佐劑的乳化劑，建立EAU模型，免疫當天記作0 d。免疫后30 d，取小鼠脾臟和淋巴結研磨并過濾，將濾液加入尼龍柱密封，37 ℃培養1 h，完全培養基沖洗尼龍柱，得到T細胞懸液。

1.3 小鼠視網膜炎癥臨床觀察及組織病理學檢查

免疫后13 d開始，每2天行間接檢眼鏡檢查，參照Caspi^[17]評分標準對炎癥反應程度進行評分。免疫后30 d，深度麻醉處死小鼠，摘除眼球作石蠟病理切片，沿視盤矢狀面制作5 μm厚度切片，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察視網膜病變情況。參照Caspi^[17]評分標準進行組織病理學評分。

1.4 實時定量PCR（qRT-PCR）檢測小鼠脾臟中IL-23R及T細胞中IL-17、維甲酸相關孤兒受體γt（RORγt）、IL-10和Foxp3 mRNA相對表達量

分離各組小鼠脾臟后剪取部分脾臟組織研磨，提取脾臟總RNA；提取各組小鼠T細胞總RNA；將RNA逆轉錄合成cDNA，以磷酸甘油醛脫氫酶為內參照。采用Premier 5.0軟件設計正向、反向引物（表1）。反應體系：SYBR Green 2× Master Mix 4 μl，正反向引物各1 μl，cDNA模板2 μl；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸1 min，40個循環。相對表達式計算使用相對量化方程2^?ΔΔCt。

表1 引物序列

表選項

下載CSV

檢測因子	正向引物（5’→3’）	反向引物（5’→3’）
IL-23R	CAGAGGACATCCTGCTTCAGGTA	GATGGCCAAGAAGACCATTCC
IL-17	CCTGGCGGCTACAGTGAAG	TTTGGACACGCTGAGCTTTG
RORγt	CCTCAGCGCCCTGTGTTTT	GCATGCAGCTTTTGCCTGTT
IL-10	GATGCCCCAGGCAGAGAA	CACCCAGGGAATTCAAATGC
Foxp3	CATTGGTTTACTCGCATGTTCG	TGTGGCGGATGGCATTCTT
GAPDH	CATGGCCTTCCGTGTTCCTA	GCGGCACGTCAGATCCA
注：IL：白細胞介素；ROR：維甲酸相關孤兒受體；Foxp3：叉頭狀轉錄因子p3；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶

1.5 ELISA法檢測小鼠血清中IL-17水平

免疫后30 d，摘除各組小鼠眼球，收集靜脈血，離心后吸取上層血清。參照小鼠IL-17 ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠血清中IL-17水平。

1.6 流式細胞儀檢測Th17、Treg細胞比率

Treg細胞檢測：T細胞中加入破膜固定液，4 ℃避光過夜；TruStainFcX? PLUS封閉細胞表面Fc受體，加入FITC-CD4和PE-Foxp3抗體，4 ℃避光孵育2 h染色。Th17細胞檢測：T細胞與經射線處理的抗原提呈細胞共培養，加入10 mg/ml IRBP_1-20和10 ng/ml IL-23刺激，8 d后收集共培養細胞，于含有50 ng/ml PMA、1 μg/ml BFA和1 μg/ml鈣離子霉素的培養基中刺激4～6 h，破膜固定，封閉，FITC-IL-17和PE-CD4抗體標記。

1.7 統計學方法

采用SPSS26.0軟件行統計學分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，偏態分布的計量資料以M（IQR）表示。采用Shapiro-Wilk檢驗數據正態性，組間均數以Levene檢驗方差齊性。組間差異比較采用獨立樣本t檢驗、獨立樣本Mann-Whitney U檢驗或重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

qRT-PCR結果顯示，LV-Ctrl組、LV-IL-23R組小鼠脾臟中IL-23R mRNA相對表達量分別為1.00（1.00）、9.87（2.79）；LV-IL-23R組小鼠IL-23R mRNA相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（Z=2.087，P=0.037）。

LV-Ctrl組，免疫后13～15 d，視網膜血管輕微炎癥和視盤水腫；17～21 d，疾病逐漸加重，血管擴張，周圍可見白色滲出，視網膜彌漫性點狀浸潤，21 d炎癥達到高峰；22～29 d，炎癥逐漸緩解至基本消退。LV-IL-23R組，視網膜血管紆曲、擴張伴血管鞘，視網膜大面積水腫，點狀浸潤增多并形成大量線狀炎性浸潤灶。免疫后13 d，LV-IL-23R組、LV-Ctrl組小鼠眼底炎癥評分差異無統計學意義（t=－2.001，P=0.058）；免疫后15～29 d，LV-IL-23R組小鼠眼底炎癥評分均高于LV-Ctrl組，差異有統計學意義（t=－4.429、－6.578、－7.768、－10.183、－6.325、－7.304、－4.841、－6.872，P＜0.001）（圖1）。

圖1 LV-Ctrl組、LV-IL-23R組（n=6）小鼠免疫后不同時間點眼底炎癥臨床評分比較。與LV-Ctrl組比較，^**P＜0.01。IL-23R：白細胞介素-23受體

圖選項

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