引用本文： 于垚, 陳飛, 沈吟. 新型光敏蛋白PsCatCh2.0治療視網膜退行性疾病的長期有效性和安全性研究. 中華眼底病雜志, 2022, 38(7): 584-592. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210607-00293 復制
視網膜退行性疾病是一類慢性和致盲性疾病，主要包括視網膜色素變性和其他遺傳性視網膜疾病（IRD），目前尚無有效治療方法，最終可導致患者視力完全喪失[1-3]。隨著生物學技術發展，光遺傳學技術在治療IRD上出現新的策略，其結合視網膜視覺形成所需的光信號，利用光驅動細胞的超極化或去極化反應，模擬視覺信號[4-5]。2003年有學者首次將陽離子內流的微生物光敏蛋白Channelrhodopsin-2表達于視網膜色素變性模型rd1小鼠的視網膜上，提示光敏蛋白可讓退行性病變視網膜獲得感光能力并在一定程度上恢復視覺功能的可行性[6]。但根據國際非電離輻射防護委員會標準，應用于視網膜上的光強度不超過相應波長的安全閾值[7]，并且視覺恢復需高時空分辨率。上述兩大特點要求光敏蛋白同時具有對視網膜安全的高光敏感性和滿足高時空分辨的快動力學特征。PsChR是來源于亞心形扁藻類且天然對Na+、Ca2+通透性高的光敏蛋白[8]，在其基礎上進行相應位點的突變更容易獲得Ca2+通透性更高的光敏蛋白。德國維爾茲堡大學生物中心高世強教授實驗室利用DNA定點突變技術獲得PsChR L115C突變體（PsCatCh），其后又在此基礎上融合提高細胞膜表達效率的序列（T）和內質網信號輸出序列（E）形成PsCatCh2.0[9-10]。PsCatCh2.0的Ca2+通透性是CatCh的4倍左右，光敏感性可以提升到波長470 nm的安全范圍內。但其應用于視覺恢復的有效性和安全性研究國內鮮見報道。為此，本研究觀察了光敏蛋白長期應用于視覺恢復的有效性和安全性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗動物分組與玻璃體腔注射重組腺相關病毒（rAAV）2/2-巨細胞病毒啟動子（CMV）-PsCatCh2.0-增強型綠色熒光蛋白（EGFP）
健康雄性C57BL/6J小鼠12只，鼠齡4～6周，體重15～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；雄性rd1小鼠24只，鼠齡4～6周，體重15～22 g，暨大-港大腦功能與健康聯合實驗室徐穎教授惠贈。均飼養于醫院動物中心（許可證號：SYXK鄂2015-0027）標準（12 h明/12 h暗循環）無特定病原體級環境，并獲得武漢大學人民醫院動物倫理委員會許可［倫理編號：WDRM動（福）第20190113號］。新型光敏蛋白PsCatCh2.0由德國維爾茲堡大學生物中心高世強教授惠贈。
rd1小鼠隨機分為rd1實驗組、rd1對照組；C57BL/6J小鼠作為C57對照組。rd1實驗組小鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮和12 mg/kg甲苯噻嗪全身麻醉，微量注射儀（美國Drummond公司）連接玻璃微電極，于小鼠眼球鼻側角鞏膜緣下1 mm處穿刺玻璃體腔注射1.5 μl重組病毒，2周后顳側重復注射1.5 μl。rd1對照組、C57對照組小鼠不做任何處理。
1.2 膜片鉗實驗技術記錄表達PsCatCh2.0-EGFP的視網膜神經節細胞（RGC）光電流及對光反應頻率
rd1實驗組小鼠玻璃體腔注射重組病毒1年后，深度麻醉處死，摘除眼球置于含95% O2+5% CO2混合氣體的細胞外液中，去除眼前節，迅速分離視網膜和鞏膜，進行視網膜切片，膜片鉗實驗技術記錄RGC的光電流及對光反應頻率。細胞外液：125.0 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、1.0 mmol/L MgSO4、2.0 mmol/L CaCl2、1.25 mmol/L NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3、20.0 mmol/L 葡萄糖；細胞內液：115.0 mmol/L CsCH3O3、20.0 mmol/L CsCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L乙二醇四乙酸、10.0 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、4.0 mmol/L三磷酸腺苷鎂鹽、0.4 mmol/L三磷酸鳥苷二鈉鹽、10.0 mmol/L磷酸肌酸，用CsOH將pH調整為7.2。應用水平微電極拉制儀Sutter P-1000（美國Sutter Instrument公司）拉制的記錄玻璃微電極（美國Sutter Instrument公司）電阻為5～7 MΩ。膜片鉗系統為德國Heka公司的EPC10，給光系統為加拿大Mightex公司的外置光纖。
1.3 視網膜免疫熒光染色、視網膜鋪片及RGC計數
重組病毒注射1年后，深度麻醉處死各組小鼠，摘除眼球。每組隨機選取3只眼球制作視網膜冰凍切片，行視網膜免疫熒光染色。冰凍切片機（德國萊卡公司）將視杯視神經矢狀切成厚14 μm的切片。膠質纖維酸性蛋白（GFAP）抗體（兔，1∶1 000，丹麥DAKO公司），谷氨酰胺合成酶（GS）抗體（鼠，1∶5 000，美國Millipore公司），綠色熒光蛋白（GFP）（雞，1∶2 000）、AP2α抗體（兔，1∶1 000）（英國Abcam公司），Chx10抗體（羊，1∶500，美國Exalpha公司）、Calbindin抗體（兔，1∶5 000，瑞士SWANT公司）。二抗Alexa Fluor 488標記驢抗雞IgG（1∶500）、Alexa Fluor 594標記驢抗兔IgG（1∶500）、Alexa Fluor 594標記驢抗鼠IgG（1∶500）、Alexa Fluor 594標記驢抗羊IgG（1∶500）（美國Jackson公司）孵育，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育后封片，激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司，LSM880）拍照觀察熒光表達情況。
每組隨機選取6只眼球行視網膜鋪片及RGC計數。去除眼前節后，4%多聚甲醛固定30 min，鈍性分離視網膜。將視網膜置于4%牛血清白蛋白（武漢Goodbio Technology公司）和0.5% Triton X-100 溶液（美國Sigma公司）中，4 ℃封閉過夜。4 ℃孵育Brn3a抗體（兔，1∶800，美國Synaptic System公司）和GFP抗體 24 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗視網膜后置于Alexa Fluor 594標記驢抗兔IgG和Alexa Fluor 488標記驢抗雞IgG室溫孵育2 h，PBS漂洗后用抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下拍照并觀察重組病毒的轉染效率。以視盤為中心，將視網膜分為顳上、顳下、鼻上、鼻下4個象限，每個象限從距視盤1/6、1/2、5/6半徑處劃分為中央、中間、周邊3區，熒光顯微鏡10×40倍視野下，每個象限的每個分區各隨機選取3點，按序拍照（圖1），采用Image J圖像分析軟件計數RGC。每個視野實際面積為0.097 2 mm2，計算并比較3組小鼠視網膜單位面積RGC的數量。
圖1
小鼠視網膜鋪片全景熒光顯微鏡像。矩形框所示為視網膜鋪片拍攝區域Brn3a 標尺：50 μm
1.4 視網膜蘇木精-伊紅（HE）染色評估各組小鼠視網膜厚度
每組隨機選取3只眼球，PBS漂洗后4%多聚甲醛固定24 h。石蠟包埋，沿平行于視神經的矢狀軸做厚5 μm切片。HE染色，封片后光學顯微鏡下觀察。每只眼球選取1張有視神經的切片，采用Image J圖像分析軟件測量距視神經200 μm兩側的內層視網膜厚度。
1.5 原位末端標記法（TUNEL）觀察各組小鼠視網膜細胞凋亡情況
每組隨機選取3只眼球制作冰凍切片，0.5% Triton X-100破膜液充分浸潤組織，PBS漂洗3次后，加入50 μl TUNEL反應混合溶液（碧云天生物技術研究所），37 ℃孵育1.5 h，DAPI復染8 min后封片。熒光顯微鏡下觀察、拍照，以紅色熒光為凋亡細胞。
1.6 蛋白印跡免疫法（Western blot）檢測各組小鼠視網膜中核因子（NF）-κB p65蛋白相對表達量
每組隨機選取3只眼球，RIPA裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。每孔加入25 μg蛋白，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，電轉至硝酸纖維素膜（0.3 A，60 min），5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，NF-κB p65（兔，1∶1 000，美國CST公司），甘油醛脫氫酶（兔，1∶3 000，Antigene生物技術有限公司）孵育過夜，抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔（1∶5 000，武漢賽維爾生物科技有限公司）室溫孵育1.5 h，三羥甲基氨基甲烷緩沖液洗膜3次，增強化學發光，GelView 6000Plus儀器（廣州博鷺騰生物科技有限公司）拍照。
1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測各組小鼠視網膜中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素-6（IL-6）、B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白（Bax）mRNA相對表達量
每組隨機選取6只眼球，Trizol（美國Ambian公司）一步法提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將mRNA逆轉為cDNA。由武漢擎科生物公司合成引物（表1）。
表1
檢測因子引物序列
1.8 統計學方法
采用Graphpad Prism 8.0軟件行統計學分析。計量數據以均數±標準差（
）表示。組間RGC密度、內層視網膜厚度、炎癥因子表達量、Bax mRNA含量的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
PsCatCh2.0-EGFP質粒結構包含2個酶切位點KpnI和BamHI，抗氨卞青霉素Amp篩選基因和EGFP報告基因（圖2）。
圖2
PsCatCh2.0-EGFP質粒圖譜。EGFP：增強型綠色熒光蛋白
注射重組病毒后1年，波長470 nm、光強度2.5×1016 photons/（cm2·s）刺激條件下，表達PsCatCh2.0的RGC產生的電流約為30 pA，且可很好地響應至少32 Hz的高頻率閃光刺激（圖3）。視網膜鋪片結果顯示，rAAV2/2- CMV-PsCatCh2.0-EGFP轉染到RGC的轉染率為（12.81±0.71）%。激光共聚焦顯微鏡觀察發現，PsCatCh2.0-EGFP與RGC呈共定位表達；少量與無長突細胞共定位，幾乎不與水平細胞、雙極細胞共定位（圖4）。
圖3
rd1小鼠注射重組病毒后表達PsCatCh2.0的RGC對光反應情況。3A示視網膜切片熒光顯微鏡像，熒光、明場及疊加示意圖 標尺：20 μm；3B示波長470 nm，光強度2.5×1016 photons/ （cm2·s）刺激條件下，表達PsCatCh2.0的RGC對光反應電流；3C示上述相同光強條件下，表達PsCatCh2.0的RGC對不同頻率（2、4、8、16、32 Hz）的閃光刺激下的電流響應。RGC：視網膜神經節細胞；GCL：神經節細胞層；INL：內核層
圖4
rd1實驗組小鼠玻璃體腔注射rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP 1年后視網膜免疫熒光染色像。4A示RGC標記物Brn3a及GFP共染色（白箭示共標細胞）；4B示無長突細胞標記物AP2α及GFP共染色（白箭示共標細胞）；4C示雙極細胞標記物Chx10與GFP共染色；4D示水平細胞標記物Calbindin與GFP共染色。PsCatCh2.0-EGFP與RGC呈共定位表達，少量與無長突細胞共定位，幾乎不與水平細胞、雙極細胞共定位 標尺：20 μm。rAAV：重組腺相關病毒；CMV：巨細胞病毒啟動子；GFP：綠色熒光蛋白；EGFP：增強型GFP；DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚
注射重組病毒后1年，rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組小鼠RGC密度分別為（1 856.52±149.49）、（1 923.83±137.58）、（2 417.76±57.09）個/mm2。rd1實驗組小鼠RGC密度低于rd1對照組，但差異無統計學意義（F=2.25，P＞0.05）；rd1實驗組、rd1對照組小鼠RGC密度均低于C57對照組，差異有統計學意義（F=6.32，P＜0.05）（圖5）。光學顯微鏡觀察發現，C57對照組可見3個核層，從內向外依次是神經節細胞層（GCL）、內核層（INL）和外核層（ONL）。rd1實驗組、rd1對照組小鼠外核層缺失，剩余兩細胞核層仍可分辨，但可見內叢狀層明顯變薄，INL到GCL為內層視網膜的范圍（圖6）。rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組小鼠內層視網膜厚度分別為（52.79±1.15）、（53.39±2.33）、（62.33±2.50）μm。rd1實驗組、rd1對照組小鼠內層視網膜厚度比較，差異無統計學意義（F=0.30，P＞0.05）；rd1實驗組、rd1對照組小鼠內層視網膜厚度均低于C57對照組，差異有統計學意義（F=6.57，P＜0.05）（圖7）。
圖5
各組小鼠全視網膜鋪片熒光顯微鏡像。5A～5C分別示rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組。rd1實驗組、rd1對照組小鼠RGC密度低于C57對照組 Brn3a 標尺：20 μm。RGC：視網膜神經節細胞
圖6
各組小鼠視網膜光學顯微鏡像。6A～6C分別示rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組。與C57對照組相比，rd1實驗組與rd1對照組小鼠視網膜厚度明顯變薄，外核層缺失，剩下兩層細胞核結構可分辨，但內叢狀層明顯變薄。蘇木精-伊紅 標尺：20 μm。GCL：神經節細胞層；INL：內核層；ONL：外核層
圖7
各組小鼠（n=3）內層視網膜厚度比較。rd1實驗組、rd1對照組小鼠內層視網膜厚度數均低于C57對照組。 *P＜0.05
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，rd1實驗組小鼠視網膜GS、GFAP熒光強度均略弱于rd1對照組（圖8）。qPCR檢測結果顯示，rd1實驗組小鼠視網膜TNF-α mRNA相對表達量高于C57對照組（F=15.67，P＜0.002）；rd1實驗組小鼠視網膜IL-6 mRNA相對表達量略高于C57對照組，差異無統計學意義（F=3.15，P＞0.05）；rd1實驗組小鼠視網膜TNF-α、IL-6 mRNA相對表達量均低于rd1對照組，差異有統計學意義（F=5.91、5.78，P＜0.05）（圖9）。Western blot檢測結果顯示，rd1實驗組小鼠視網膜NF-κB p65蛋白相對表達量低于rd1對照組，差異有統計學意義（F=4.61，P＜0.05）（圖10）。
圖8
各組小鼠視網膜冰凍切片熒光顯微鏡像。8A、8B分別示rd1實驗組、rd1對照組GS染色；8C、8D分別示rd1實驗組、rd1對照組GFAP染色。rd1實驗組小鼠視網膜GS、GFAP熒光強度均弱于rd1對照組 標尺：20 μm。GS：谷氨酰胺合成酶；GFP：綠色熒光蛋白；GFAP：膠質纖維酸性蛋白；DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚；INL：內核層；GCL：神經節細胞層
圖9
各組小鼠（n=3）視網膜TNF-α、IL-6 mRNA相對表達量比較。rd1實驗組小鼠視網膜TNF-α和IL-6的mRNA表達量均明顯低于rd1對照組，但高于C57對照組。*P＜0.05，**P＜0.01。TNF：腫瘤壞死因子；IL：白細胞介素
圖10
各組小鼠（n=3）視網膜NF-κB p65蛋白相對表達情況。10A示電泳圖；10B示NF-κB p65蛋白相對表達量比較。C57對照組小鼠視網膜NF-κB p65蛋白相對表達量明顯低于rd1實驗組和rd1對照組，rd1實驗組小鼠視網膜NF-κB p65蛋白相對表達量低于rd1對照組。*P＜0.05。NF：核因子；GAPDH：甘油醛脫氫酶
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，rd1實驗組小鼠視網膜中呈紅色熒光的凋亡細胞數量少于rd1對照組；C57對照組小鼠視網膜中僅有少量凋亡細胞（圖11）。qPCR檢測結果顯示，rd1實驗組小鼠視網膜Bax mRNA相對表達量低于rd1對照組，但高于C57對照組，差異有統計學意義（F=7.52、6.51，P＜0.01）（圖12）。
圖11
各組小鼠視網膜冰凍切片熒光顯微鏡像。11A～11C分別示rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組。rd1實驗組小鼠視網膜中呈紅色熒光的凋亡細胞數量少于rd1對照組；C57對照組小鼠視網膜中僅少量凋亡細胞（白箭） 標尺：20 μm。ONL：外核層；INL：內核層；GCL：神經節細胞層
圖12
各組小鼠（n=6）視網膜Bax mRNA相對表達量比較。rd1實驗組Bax的含量低于rd1對照組，而高于C57對照組。**P＜0.01。Bax：B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白
3 討論
隨著光遺傳學技術的不斷發展，對光敏蛋白的光敏感性和動力學要求也逐步提高[11]。微生物光敏蛋白具有快速動力學，響應頻率可達20 Hz以上，但光敏感性低，應用時會造成視網膜的光毒性損害[12]。哺乳動物光敏蛋白雖然光敏感性高，但動力學不足，對光響應頻率僅僅只有2 Hz，無法滿足高時空分辨率[2]。針對上述問題，可以應用基因工程學技術構建新型的光敏蛋白來提升光敏蛋白的生物學特性。由于哺乳動物光敏蛋白是有7層跨膜結構的G蛋白偶聯受體，結構復雜，目前暫無有效的策略來提升動力學性能。針對微生物光敏蛋白的改造主要有三種策略，一是進行單位點或者多位點突變，如CoChR H94E/L112C/K264T的三位點突變體，光敏感性可以提升到1012 photons/（cm2·s），但關閉時間常數延長到了723 ms，對光響應頻率不足10 Hz[13]；二是篩選激活光譜紅移的光敏蛋白，如Rea-ChR（red activatable ChR），但往往導致光敏蛋白的響應電流較低[7]；三是增加光敏蛋白通道Ca2+的通透性，從一價Na+為主改變為Ca2+、Na+為主的光敏蛋白，是一種提升光敏感性、增大電流、不減慢動力學特征的改造策略[14]。本研究使用的高Ca2+通透性PsCatCh2.0通過策略三改造得到，在快動力學的基礎上光敏感性得到較大提高。
光遺傳學恢復視覺功能的策略與基因治療相似，均采用rAAV作為載體攜帶目的基因轉染到靶細胞上[3,15-16]。基因治療需要根據患者缺陷基因來定制個性化序列，一般只能針對常染色體隱性遺傳的基因突變，而光遺傳學則是根據靶向細胞不同選擇不同的光敏蛋白，是一種普適性的基因治療策略[17]。但基于rAAV2/2、CMV作為啟動子在視網膜轉染效率上偏低，而且根據進針位置不同導致在視網膜上轉染也不均勻，呈現進針側轉染效率高而對側偏低的情況，本研究選擇兩次注射重組病毒（鼻側、顳側）的方式有效地解決了這一問題。雖然rAAV作為攜帶目的基因最常用的載體，具有免疫原性低、非致病性、廣泛宿主性、很少整合至宿主細胞基因組、可長期表達等優點[18-21]。但兩次玻璃體腔注射病毒的劑量增加一倍，且PsCatCh2.0在細胞膜上表達效率進一步提高，長期在體內表達的安全性是首要問題。
本研究結果顯示，rd1實驗組小鼠玻璃體腔注射rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP病毒1年后，表達PsCatCh2.0-EGFP的RGC依然可以在波長470 nm、低于視網膜安全閾值的光強6.4×1014 photons/（cm2·s）下被激活，而且可以很好響應高頻率光刺激（32 Hz），說明新型光敏蛋白PsCatCh2.0具有恢復視網膜退行性疾病視覺功能的潛在有效性。有研究表明，眼內注射rAAV2/2-GFP后視網膜內可持續檢測到轉基因產物，注射7.5個月后視網膜內仍有較高的GFP表達[22]，相比而言PsCatCh2.0-EGFP在視網膜也表現出持續的過表達性能。在rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP玻璃體腔注射轉染視網膜1年后，我們通過視網膜鋪片發現RGC轉染效率仍有（12.81±0.70）%，但較短期而言下降明顯，漏標到其他細胞如無長突細胞的問題仍存在。rd1小鼠出生后即表現為視網膜退行性病變，出生28 d視網膜光感受器消失而INL和GCL層仍存在，持續性炎癥是導致視網膜退行性病變的機制之一[23]。長期轉染表達rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP是否會影響rd1小鼠視網膜的炎性反應、是否會影響退行性病變進程，這對應用PsCatCh2.0恢復視覺功能的安全性至關重要。因此，本研究進一步觀察發現，rd1實驗組小鼠在注射rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP病毒1年后，實際年齡為13個月左右，其視網膜厚度與rd1對照組小鼠相比未見明顯差異，而且RGC的數量也未見明顯減少。這說明rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP并未加重rd1小鼠視網膜退行性病變進程。
小膠質細胞是視網膜的主要免疫細胞，在視網膜退行性病變模型中，rd1小鼠出生14～28 d，光感受器變性會導致表達Ki-67和CD68的CD11b+或IBA1+的小膠質細胞向光感受器細胞遷移[24]。通過突觸吞噬作用和促進Müller細胞激活以促進光感受器細胞的死亡[25]。為了確定新型光敏蛋白PsCatCh2.0轉染后是否影響視網膜細胞凋亡過程，我們對視網膜切片進行了凋亡染色評估，rd1實驗組小鼠Tunel陽性細胞數量低于rd1對照組；同時，細胞凋亡相關因子Bax mRNA表達也下降。膠質細胞活化和炎性反應繼發并貫穿在rd1小鼠視網膜光感受器退化進程中[26]，GFAP是星形膠質細胞活化的標志物，在視網膜中主要標記Müller細胞，Müller細胞活化是視網膜細胞損傷和死亡最敏感的指標，在視網膜炎癥反應中起重要作用[11,27]。小膠質細胞可促進炎癥因子TNF-α和IL-6的產生，誘導過量炎癥，加速神經元死亡[24,28]。rd1實驗組小鼠注射重組病毒1年后，TNF-α、IL-6 mRNA表達量較rd1對照組降低，且NF-κB p65蛋白表達量也低于rd1對照組。NF-κB p65在細胞炎癥、免疫應答中起重要作用，參與細胞炎性因子刺激的調控[29]。rd1實驗組小鼠視網膜炎癥水平較rd1對照組小鼠低，表明rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP病毒長期表達可能影響了視網膜膠質細胞功能，導致炎性通路NF-κB p65蛋白表達下降，進一步影響炎性因子TNF-α和IL-6的表達，抑制了細胞炎性反應。
本研究結果證明新型光敏蛋白PsCatCh2.0利用rAAV2/2轉染至視網膜1年后仍有表達，且表達PsCatCh2.0-EGFP的RGC具有良好的對光反應，并未對退行性病變小鼠的視網膜產生明顯的毒性作用。因此，新型微生物光敏蛋白PsCatCh2.0是一個值得繼續深入研究的性能良好、對視網膜安全的光遺傳學工具蛋白。
視網膜退行性疾病是一類慢性和致盲性疾病，主要包括視網膜色素變性和其他遺傳性視網膜疾病（IRD），目前尚無有效治療方法，最終可導致患者視力完全喪失[1-3]。隨著生物學技術發展，光遺傳學技術在治療IRD上出現新的策略，其結合視網膜視覺形成所需的光信號，利用光驅動細胞的超極化或去極化反應，模擬視覺信號[4-5]。2003年有學者首次將陽離子內流的微生物光敏蛋白Channelrhodopsin-2表達于視網膜色素變性模型rd1小鼠的視網膜上，提示光敏蛋白可讓退行性病變視網膜獲得感光能力并在一定程度上恢復視覺功能的可行性[6]。但根據國際非電離輻射防護委員會標準，應用于視網膜上的光強度不超過相應波長的安全閾值[7]，并且視覺恢復需高時空分辨率。上述兩大特點要求光敏蛋白同時具有對視網膜安全的高光敏感性和滿足高時空分辨的快動力學特征。PsChR是來源于亞心形扁藻類且天然對Na+、Ca2+通透性高的光敏蛋白[8]，在其基礎上進行相應位點的突變更容易獲得Ca2+通透性更高的光敏蛋白。德國維爾茲堡大學生物中心高世強教授實驗室利用DNA定點突變技術獲得PsChR L115C突變體（PsCatCh），其后又在此基礎上融合提高細胞膜表達效率的序列（T）和內質網信號輸出序列（E）形成PsCatCh2.0[9-10]。PsCatCh2.0的Ca2+通透性是CatCh的4倍左右，光敏感性可以提升到波長470 nm的安全范圍內。但其應用于視覺恢復的有效性和安全性研究國內鮮見報道。為此，本研究觀察了光敏蛋白長期應用于視覺恢復的有效性和安全性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗動物分組與玻璃體腔注射重組腺相關病毒（rAAV）2/2-巨細胞病毒啟動子（CMV）-PsCatCh2.0-增強型綠色熒光蛋白（EGFP）
健康雄性C57BL/6J小鼠12只，鼠齡4～6周，體重15～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；雄性rd1小鼠24只，鼠齡4～6周，體重15～22 g，暨大-港大腦功能與健康聯合實驗室徐穎教授惠贈。均飼養于醫院動物中心（許可證號：SYXK鄂2015-0027）標準（12 h明/12 h暗循環）無特定病原體級環境，并獲得武漢大學人民醫院動物倫理委員會許可［倫理編號：WDRM動（福）第20190113號］。新型光敏蛋白PsCatCh2.0由德國維爾茲堡大學生物中心高世強教授惠贈。
rd1小鼠隨機分為rd1實驗組、rd1對照組；C57BL/6J小鼠作為C57對照組。rd1實驗組小鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮和12 mg/kg甲苯噻嗪全身麻醉，微量注射儀（美國Drummond公司）連接玻璃微電極，于小鼠眼球鼻側角鞏膜緣下1 mm處穿刺玻璃體腔注射1.5 μl重組病毒，2周后顳側重復注射1.5 μl。rd1對照組、C57對照組小鼠不做任何處理。
1.2 膜片鉗實驗技術記錄表達PsCatCh2.0-EGFP的視網膜神經節細胞（RGC）光電流及對光反應頻率
rd1實驗組小鼠玻璃體腔注射重組病毒1年后，深度麻醉處死，摘除眼球置于含95% O2+5% CO2混合氣體的細胞外液中，去除眼前節，迅速分離視網膜和鞏膜，進行視網膜切片，膜片鉗實驗技術記錄RGC的光電流及對光反應頻率。細胞外液：125.0 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、1.0 mmol/L MgSO4、2.0 mmol/L CaCl2、1.25 mmol/L NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3、20.0 mmol/L 葡萄糖；細胞內液：115.0 mmol/L CsCH3O3、20.0 mmol/L CsCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L乙二醇四乙酸、10.0 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、4.0 mmol/L三磷酸腺苷鎂鹽、0.4 mmol/L三磷酸鳥苷二鈉鹽、10.0 mmol/L磷酸肌酸，用CsOH將pH調整為7.2。應用水平微電極拉制儀Sutter P-1000（美國Sutter Instrument公司）拉制的記錄玻璃微電極（美國Sutter Instrument公司）電阻為5～7 MΩ。膜片鉗系統為德國Heka公司的EPC10，給光系統為加拿大Mightex公司的外置光纖。
1.3 視網膜免疫熒光染色、視網膜鋪片及RGC計數
重組病毒注射1年后，深度麻醉處死各組小鼠，摘除眼球。每組隨機選取3只眼球制作視網膜冰凍切片，行視網膜免疫熒光染色。冰凍切片機（德國萊卡公司）將視杯視神經矢狀切成厚14 μm的切片。膠質纖維酸性蛋白（GFAP）抗體（兔，1∶1 000，丹麥DAKO公司），谷氨酰胺合成酶（GS）抗體（鼠，1∶5 000，美國Millipore公司），綠色熒光蛋白（GFP）（雞，1∶2 000）、AP2α抗體（兔，1∶1 000）（英國Abcam公司），Chx10抗體（羊，1∶500，美國Exalpha公司）、Calbindin抗體（兔，1∶5 000，瑞士SWANT公司）。二抗Alexa Fluor 488標記驢抗雞IgG（1∶500）、Alexa Fluor 594標記驢抗兔IgG（1∶500）、Alexa Fluor 594標記驢抗鼠IgG（1∶500）、Alexa Fluor 594標記驢抗羊IgG（1∶500）（美國Jackson公司）孵育，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育后封片，激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司，LSM880）拍照觀察熒光表達情況。
每組隨機選取6只眼球行視網膜鋪片及RGC計數。去除眼前節后，4%多聚甲醛固定30 min，鈍性分離視網膜。將視網膜置于4%牛血清白蛋白（武漢Goodbio Technology公司）和0.5% Triton X-100 溶液（美國Sigma公司）中，4 ℃封閉過夜。4 ℃孵育Brn3a抗體（兔，1∶800，美國Synaptic System公司）和GFP抗體 24 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗視網膜后置于Alexa Fluor 594標記驢抗兔IgG和Alexa Fluor 488標記驢抗雞IgG室溫孵育2 h，PBS漂洗后用抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下拍照并觀察重組病毒的轉染效率。以視盤為中心，將視網膜分為顳上、顳下、鼻上、鼻下4個象限，每個象限從距視盤1/6、1/2、5/6半徑處劃分為中央、中間、周邊3區，熒光顯微鏡10×40倍視野下，每個象限的每個分區各隨機選取3點，按序拍照（圖1），采用Image J圖像分析軟件計數RGC。每個視野實際面積為0.097 2 mm2，計算并比較3組小鼠視網膜單位面積RGC的數量。
圖1
小鼠視網膜鋪片全景熒光顯微鏡像。矩形框所示為視網膜鋪片拍攝區域Brn3a 標尺：50 μm
1.4 視網膜蘇木精-伊紅（HE）染色評估各組小鼠視網膜厚度
每組隨機選取3只眼球，PBS漂洗后4%多聚甲醛固定24 h。石蠟包埋，沿平行于視神經的矢狀軸做厚5 μm切片。HE染色，封片后光學顯微鏡下觀察。每只眼球選取1張有視神經的切片，采用Image J圖像分析軟件測量距視神經200 μm兩側的內層視網膜厚度。
1.5 原位末端標記法（TUNEL）觀察各組小鼠視網膜細胞凋亡情況
每組隨機選取3只眼球制作冰凍切片，0.5% Triton X-100破膜液充分浸潤組織，PBS漂洗3次后，加入50 μl TUNEL反應混合溶液（碧云天生物技術研究所），37 ℃孵育1.5 h，DAPI復染8 min后封片。熒光顯微鏡下觀察、拍照，以紅色熒光為凋亡細胞。
1.6 蛋白印跡免疫法（Western blot）檢測各組小鼠視網膜中核因子（NF）-κB p65蛋白相對表達量
每組隨機選取3只眼球，RIPA裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。每孔加入25 μg蛋白，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，電轉至硝酸纖維素膜（0.3 A，60 min），5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，NF-κB p65（兔，1∶1 000，美國CST公司），甘油醛脫氫酶（兔，1∶3 000，Antigene生物技術有限公司）孵育過夜，抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔（1∶5 000，武漢賽維爾生物科技有限公司）室溫孵育1.5 h，三羥甲基氨基甲烷緩沖液洗膜3次，增強化學發光，GelView 6000Plus儀器（廣州博鷺騰生物科技有限公司）拍照。
1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測各組小鼠視網膜中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素-6（IL-6）、B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白（Bax）mRNA相對表達量
每組隨機選取6只眼球，Trizol（美國Ambian公司）一步法提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將mRNA逆轉為cDNA。由武漢擎科生物公司合成引物（表1）。
表1
檢測因子引物序列
1.8 統計學方法
采用Graphpad Prism 8.0軟件行統計學分析。計量數據以均數±標準差（）表示。組間RGC密度、內層視網膜厚度、炎癥因子表達量、Bax mRNA含量的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
PsCatCh2.0-EGFP質粒結構包含2個酶切位點KpnI和BamHI，抗氨卞青霉素Amp篩選基因和EGFP報告基因（圖2）。
圖2
PsCatCh2.0-EGFP質粒圖譜。EGFP：增強型綠色熒光蛋白
注射重組病毒后1年，波長470 nm、光強度2.5×1016 photons/（cm2·s）刺激條件下，表達PsCatCh2.0的RGC產生的電流約為30 pA，且可很好地響應至少32 Hz的高頻率閃光刺激（圖3）。視網膜鋪片結果顯示，rAAV2/2- CMV-PsCatCh2.0-EGFP轉染到RGC的轉染率為（12.81±0.71）%。激光共聚焦顯微鏡觀察發現，PsCatCh2.0-EGFP與RGC呈共定位表達；少量與無長突細胞共定位，幾乎不與水平細胞、雙極細胞共定位（圖4）。
圖3
rd1小鼠注射重組病毒后表達PsCatCh2.0的RGC對光反應情況。3A示視網膜切片熒光顯微鏡像，熒光、明場及疊加示意圖 標尺：20 μm；3B示波長470 nm，光強度2.5×1016 photons/ （cm2·s）刺激條件下，表達PsCatCh2.0的RGC對光反應電流；3C示上述相同光強條件下，表達PsCatCh2.0的RGC對不同頻率（2、4、8、16、32 Hz）的閃光刺激下的電流響應。RGC：視網膜神經節細胞；GCL：神經節細胞層；INL：內核層
圖4
rd1實驗組小鼠玻璃體腔注射rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP 1年后視網膜免疫熒光染色像。4A示RGC標記物Brn3a及GFP共染色（白箭示共標細胞）；4B示無長突細胞標記物AP2α及GFP共染色（白箭示共標細胞）；4C示雙極細胞標記物Chx10與GFP共染色；4D示水平細胞標記物Calbindin與GFP共染色。PsCatCh2.0-EGFP與RGC呈共定位表達，少量與無長突細胞共定位，幾乎不與水平細胞、雙極細胞共定位 標尺：20 μm。rAAV：重組腺相關病毒；CMV：巨細胞病毒啟動子；GFP：綠色熒光蛋白；EGFP：增強型GFP；DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚
注射重組病毒后1年，rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組小鼠RGC密度分別為（1 856.52±149.49）、（1 923.83±137.58）、（2 417.76±57.09）個/mm2。rd1實驗組小鼠RGC密度低于rd1對照組，但差異無統計學意義（F=2.25，P＞0.05）；rd1實驗組、rd1對照組小鼠RGC密度均低于C57對照組，差異有統計學意義（F=6.32，P＜0.05）（圖5）。光學顯微鏡觀察發現，C57對照組可見3個核層，從內向外依次是神經節細胞層（GCL）、內核層（INL）和外核層（ONL）。rd1實驗組、rd1對照組小鼠外核層缺失，剩余兩細胞核層仍可分辨，但可見內叢狀層明顯變薄，INL到GCL為內層視網膜的范圍（圖6）。rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組小鼠內層視網膜厚度分別為（52.79±1.15）、（53.39±2.33）、（62.33±2.50）μm。rd1實驗組、rd1對照組小鼠內層視網膜厚度比較，差異無統計學意義（F=0.30，P＞0.05）；rd1實驗組、rd1對照組小鼠內層視網膜厚度均低于C57對照組，差異有統計學意義（F=6.57，P＜0.05）（圖7）。
圖5
各組小鼠全視網膜鋪片熒光顯微鏡像。5A～5C分別示rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組。rd1實驗組、rd1對照組小鼠RGC密度低于C57對照組 Brn3a 標尺：20 μm。RGC：視網膜神經節細胞
圖6
各組小鼠視網膜光學顯微鏡像。6A～6C分別示rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組。與C57對照組相比，rd1實驗組與rd1對照組小鼠視網膜厚度明顯變薄，外核層缺失，剩下兩層細胞核結構可分辨，但內叢狀層明顯變薄。蘇木精-伊紅 標尺：20 μm。GCL：神經節細胞層；INL：內核層；ONL：外核層
圖7
各組小鼠（n=3）內層視網膜厚度比較。rd1實驗組、rd1對照組小鼠內層視網膜厚度數均低于C57對照組。 *P＜0.05
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，rd1實驗組小鼠視網膜GS、GFAP熒光強度均略弱于rd1對照組（圖8）。qPCR檢測結果顯示，rd1實驗組小鼠視網膜TNF-α mRNA相對表達量高于C57對照組（F=15.67，P＜0.002）；rd1實驗組小鼠視網膜IL-6 mRNA相對表達量略高于C57對照組，差異無統計學意義（F=3.15，P＞0.05）；rd1實驗組小鼠視網膜TNF-α、IL-6 mRNA相對表達量均低于rd1對照組，差異有統計學意義（F=5.91、5.78，P＜0.05）（圖9）。Western blot檢測結果顯示，rd1實驗組小鼠視網膜NF-κB p65蛋白相對表達量低于rd1對照組，差異有統計學意義（F=4.61，P＜0.05）（圖10）。
圖8
各組小鼠視網膜冰凍切片熒光顯微鏡像。8A、8B分別示rd1實驗組、rd1對照組GS染色；8C、8D分別示rd1實驗組、rd1對照組GFAP染色。rd1實驗組小鼠視網膜GS、GFAP熒光強度均弱于rd1對照組 標尺：20 μm。GS：谷氨酰胺合成酶；GFP：綠色熒光蛋白；GFAP：膠質纖維酸性蛋白；DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚；INL：內核層；GCL：神經節細胞層
圖9
各組小鼠（n=3）視網膜TNF-α、IL-6 mRNA相對表達量比較。rd1實驗組小鼠視網膜TNF-α和IL-6的mRNA表達量均明顯低于rd1對照組，但高于C57對照組。*P＜0.05，**P＜0.01。TNF：腫瘤壞死因子；IL：白細胞介素
圖10
各組小鼠（n=3）視網膜NF-κB p65蛋白相對表達情況。10A示電泳圖；10B示NF-κB p65蛋白相對表達量比較。C57對照組小鼠視網膜NF-κB p65蛋白相對表達量明顯低于rd1實驗組和rd1對照組，rd1實驗組小鼠視網膜NF-κB p65蛋白相對表達量低于rd1對照組。*P＜0.05。NF：核因子；GAPDH：甘油醛脫氫酶
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，rd1實驗組小鼠視網膜中呈紅色熒光的凋亡細胞數量少于rd1對照組；C57對照組小鼠視網膜中僅有少量凋亡細胞（圖11）。qPCR檢測結果顯示，rd1實驗組小鼠視網膜Bax mRNA相對表達量低于rd1對照組，但高于C57對照組，差異有統計學意義（F=7.52、6.51，P＜0.01）（圖12）。
圖11
各組小鼠視網膜冰凍切片熒光顯微鏡像。11A～11C分別示rd1實驗組、rd1對照組、C57對照組。rd1實驗組小鼠視網膜中呈紅色熒光的凋亡細胞數量少于rd1對照組；C57對照組小鼠視網膜中僅少量凋亡細胞（白箭） 標尺：20 μm。ONL：外核層；INL：內核層；GCL：神經節細胞層
圖12
各組小鼠（n=6）視網膜Bax mRNA相對表達量比較。rd1實驗組Bax的含量低于rd1對照組，而高于C57對照組。**P＜0.01。Bax：B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白
3 討論
隨著光遺傳學技術的不斷發展，對光敏蛋白的光敏感性和動力學要求也逐步提高[11]。微生物光敏蛋白具有快速動力學，響應頻率可達20 Hz以上，但光敏感性低，應用時會造成視網膜的光毒性損害[12]。哺乳動物光敏蛋白雖然光敏感性高，但動力學不足，對光響應頻率僅僅只有2 Hz，無法滿足高時空分辨率[2]。針對上述問題，可以應用基因工程學技術構建新型的光敏蛋白來提升光敏蛋白的生物學特性。由于哺乳動物光敏蛋白是有7層跨膜結構的G蛋白偶聯受體，結構復雜，目前暫無有效的策略來提升動力學性能。針對微生物光敏蛋白的改造主要有三種策略，一是進行單位點或者多位點突變，如CoChR H94E/L112C/K264T的三位點突變體，光敏感性可以提升到1012 photons/（cm2·s），但關閉時間常數延長到了723 ms，對光響應頻率不足10 Hz[13]；二是篩選激活光譜紅移的光敏蛋白，如Rea-ChR（red activatable ChR），但往往導致光敏蛋白的響應電流較低[7]；三是增加光敏蛋白通道Ca2+的通透性，從一價Na+為主改變為Ca2+、Na+為主的光敏蛋白，是一種提升光敏感性、增大電流、不減慢動力學特征的改造策略[14]。本研究使用的高Ca2+通透性PsCatCh2.0通過策略三改造得到，在快動力學的基礎上光敏感性得到較大提高。
光遺傳學恢復視覺功能的策略與基因治療相似，均采用rAAV作為載體攜帶目的基因轉染到靶細胞上[3,15-16]。基因治療需要根據患者缺陷基因來定制個性化序列，一般只能針對常染色體隱性遺傳的基因突變，而光遺傳學則是根據靶向細胞不同選擇不同的光敏蛋白，是一種普適性的基因治療策略[17]。但基于rAAV2/2、CMV作為啟動子在視網膜轉染效率上偏低，而且根據進針位置不同導致在視網膜上轉染也不均勻，呈現進針側轉染效率高而對側偏低的情況，本研究選擇兩次注射重組病毒（鼻側、顳側）的方式有效地解決了這一問題。雖然rAAV作為攜帶目的基因最常用的載體，具有免疫原性低、非致病性、廣泛宿主性、很少整合至宿主細胞基因組、可長期表達等優點[18-21]。但兩次玻璃體腔注射病毒的劑量增加一倍，且PsCatCh2.0在細胞膜上表達效率進一步提高，長期在體內表達的安全性是首要問題。
本研究結果顯示，rd1實驗組小鼠玻璃體腔注射rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP病毒1年后，表達PsCatCh2.0-EGFP的RGC依然可以在波長470 nm、低于視網膜安全閾值的光強6.4×1014 photons/（cm2·s）下被激活，而且可以很好響應高頻率光刺激（32 Hz），說明新型光敏蛋白PsCatCh2.0具有恢復視網膜退行性疾病視覺功能的潛在有效性。有研究表明，眼內注射rAAV2/2-GFP后視網膜內可持續檢測到轉基因產物，注射7.5個月后視網膜內仍有較高的GFP表達[22]，相比而言PsCatCh2.0-EGFP在視網膜也表現出持續的過表達性能。在rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP玻璃體腔注射轉染視網膜1年后，我們通過視網膜鋪片發現RGC轉染效率仍有（12.81±0.70）%，但較短期而言下降明顯，漏標到其他細胞如無長突細胞的問題仍存在。rd1小鼠出生后即表現為視網膜退行性病變，出生28 d視網膜光感受器消失而INL和GCL層仍存在，持續性炎癥是導致視網膜退行性病變的機制之一[23]。長期轉染表達rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP是否會影響rd1小鼠視網膜的炎性反應、是否會影響退行性病變進程，這對應用PsCatCh2.0恢復視覺功能的安全性至關重要。因此，本研究進一步觀察發現，rd1實驗組小鼠在注射rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP病毒1年后，實際年齡為13個月左右，其視網膜厚度與rd1對照組小鼠相比未見明顯差異，而且RGC的數量也未見明顯減少。這說明rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP并未加重rd1小鼠視網膜退行性病變進程。
小膠質細胞是視網膜的主要免疫細胞，在視網膜退行性病變模型中，rd1小鼠出生14～28 d，光感受器變性會導致表達Ki-67和CD68的CD11b+或IBA1+的小膠質細胞向光感受器細胞遷移[24]。通過突觸吞噬作用和促進Müller細胞激活以促進光感受器細胞的死亡[25]。為了確定新型光敏蛋白PsCatCh2.0轉染后是否影響視網膜細胞凋亡過程，我們對視網膜切片進行了凋亡染色評估，rd1實驗組小鼠Tunel陽性細胞數量低于rd1對照組；同時，細胞凋亡相關因子Bax mRNA表達也下降。膠質細胞活化和炎性反應繼發并貫穿在rd1小鼠視網膜光感受器退化進程中[26]，GFAP是星形膠質細胞活化的標志物，在視網膜中主要標記Müller細胞，Müller細胞活化是視網膜細胞損傷和死亡最敏感的指標，在視網膜炎癥反應中起重要作用[11,27]。小膠質細胞可促進炎癥因子TNF-α和IL-6的產生，誘導過量炎癥，加速神經元死亡[24,28]。rd1實驗組小鼠注射重組病毒1年后，TNF-α、IL-6 mRNA表達量較rd1對照組降低，且NF-κB p65蛋白表達量也低于rd1對照組。NF-κB p65在細胞炎癥、免疫應答中起重要作用，參與細胞炎性因子刺激的調控[29]。rd1實驗組小鼠視網膜炎癥水平較rd1對照組小鼠低，表明rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP病毒長期表達可能影響了視網膜膠質細胞功能，導致炎性通路NF-κB p65蛋白表達下降，進一步影響炎性因子TNF-α和IL-6的表達，抑制了細胞炎性反應。
本研究結果證明新型光敏蛋白PsCatCh2.0利用rAAV2/2轉染至視網膜1年后仍有表達，且表達PsCatCh2.0-EGFP的RGC具有良好的對光反應，并未對退行性病變小鼠的視網膜產生明顯的毒性作用。因此，新型微生物光敏蛋白PsCatCh2.0是一個值得繼續深入研究的性能良好、對視網膜安全的光遺傳學工具蛋白。
