引用本文： 牛華清, 晏穎, 陳曉. 二甲雙胍在高糖環境下對小膠質細胞極化狀態和光感受器細胞活性的影響. 中華眼底病雜志, 2023, 39(2): 163-169. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210527-00275 復制
糖尿病視網膜病變（DR）基本病理特征是血視網膜屏障受損以及形成病理性新生血管[1]。但研究發現，在視網膜微血管病變之前，視網膜神經細胞即出現了變性改變[2]，其中作為視網膜常駐免疫細胞的小膠質細胞發揮了重要作用[3]。已有研究表明，部分視網膜退行性疾病小膠質細胞在特定環境下被激活、遷移以及極化狀態改變會降低光感受器細胞的活性甚至凋亡[4-5]。本課題組前期亦在糖尿病動物模型中發現小膠質細胞發生的上述變化[6]。但其在不同糖濃度下的被極化狀態及不同極化狀態下對光感受器細胞的影響尚缺乏研究。二甲雙胍是一種廣泛用于治療2型糖尿病的雙胍類降糖劑，除可降低血糖外，對許多系統均有保護神經細胞及抗炎作用[7]。已有研究證明二甲雙胍在視網膜疾病中也具有較大的治療潛力[8-9]。近期研究發現，二甲雙胍可顯著減少視網膜變性小鼠的光感受器細胞凋亡，并顯著抑制視網膜外核層小膠質細胞的激活[10]。小膠質細胞的激活伴隨著細胞形態的改變，并呈現出兩種截然相反的作用，即以促炎作用為主的M1型和以抗炎作用為主的M2型。M1型小膠質細胞以誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、CD80、CD86和CD32等為特異性表面受體，M2型小膠質細胞以精氨酸酶（Arg）-1、CD206、CD68等為特異性表面受體；白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α為M1型小膠質細胞分泌的促炎因子，IL-4為M2型小膠質細胞分泌的抗炎因子[11]。有學者在腦缺血小鼠模型中發現，二甲雙胍通過誘導小膠質細胞向M2型極化，促進新生腦血管的形成[12]。由此我們推測二甲雙胍在DR中可能會通過影響小膠質細胞的活性和極化狀態從而影響光感受器細胞。為此，本研究通過體外細胞實驗探討二甲雙胍在高糖環境下對小膠質細胞極化狀態和光感受器細胞活性的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗細胞和主要材料
小鼠BV2小膠質細胞株（國家生物醫學實驗細胞資源庫）；小鼠661W視網膜光感受器細胞株（上海奧陸生物科技公司）。二甲雙胍粉劑、胎牛血清（美國Sigma公司）；D-葡萄糖（北京Solarbio公司）；Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM培養基，美國Gbico公司）； CD11b抗體（英國Abcam公司）；兔多抗iNOS、兔多抗Arg-1（美國Affinity公司）；鼠單抗CD206、兔單抗CD86（英國Abcam公司）；小鼠單抗β-肌動蛋白（actin，美國Santa公司)；辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗（英國Abcam公司）；熒光標記羊抗大鼠IgG二抗（美國Santa公司）；IL-4、TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）；噻唑藍（MTT，美國Amresco公司）；原位末端標記（TUNEL）細胞凋亡試劑盒（瑞士Roche公司）；APC/7-AAD細胞凋亡試劑盒（美國Immuno Chemistry公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。
1.2 方法
細胞培養。小鼠BV2小膠質細胞株、661W視網膜光感受器細胞株置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養基中，5% CO2、37 ℃、相對濕度為95%的細胞培養箱培養，取對數生長期細胞用于實驗。
確定促進小膠質細胞活化的最佳葡萄糖濃度。BV2細胞分為25、50、75、100 mmol/L糖濃度組，細胞培養24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞大小、形狀、懸浮和貼壁細胞比例。免疫熒光染色檢測各組細胞中CD11b表達。4%多聚甲醛固定細胞爬片，0.5% Triton X-100室溫下通透15 min，滴加正常山羊血清于室溫下封閉30 min，加入稀釋CD11b一抗（1∶100）濕盒中4 ℃過夜；磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗后加入稀釋熒光二抗（1∶100）濕盒中37 ℃避光孵育1 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染色5 min，PBS浸洗后滴加含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。細胞中CD11b呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。
BV2細胞分為對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組。高糖組細胞培養基中加入75 mmo/L葡萄糖；二甲雙胍+高糖組細胞采用2 mmol/L的二甲雙胍預處理12 h后，再置于75 mmo/L葡萄糖濃度培養基中培養；對照組細胞正常培養，不做任何處理。培養24 h后，將BV2細胞與661W細胞置于Transwell小室共培養24 h。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測BV2細胞內iNOS、CD86、Arg-1、CD206蛋白相對表達量。加入蛋白裂解液于冰上裂解30 min提取細胞總蛋白，離心后收集上清，二喹啉甲酸法測定樣品蛋白濃度。變性后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質分離并轉移至聚偏氟乙烯膜上，封閉液封閉2 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；三羥甲基氨基甲烷緩沖液浸洗后加入稀釋二抗室溫孵育2 h，增強化學發光法顯色，以β-actin作為內參照，BandScan軟件分析目的蛋白表達量。
ELISA檢測BV2細胞中IL-6、TNF-α、IL-4的表達。收集細胞上清作為待測樣本，根據試劑盒說明書操作，酶標儀測量各組樣本在波長450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，繪制標準曲線，計算樣本濃度。
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞與661W細胞于Transwell小室共培養24 h。共培養時，BV2細胞置于小室下層，661W細胞置于小室上層。
MTT比色法檢測各組661W細胞活性。細胞密度達到70%時，胰酶消化細胞，以1×104個/ml的密度接種于96孔板中，加入50 μl/孔0.5%MTT溶液，37 ℃敷箱中孵化4 h，加入150 μl/孔二甲基亞砜震蕩10 min，酶標儀測量各孔樣本在波長568 nm處的A值。設定對照組661W細胞活性為100%，實驗組661W細胞活性（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。
TUNEL法檢測661W細胞凋亡情況。4%多聚甲醛固定細胞爬片，PBS浸洗，滴加稀釋后的Proteinase K溶液（20 μg/ml）通透20 min，加入TUNEL反應混合液濕盒內避光孵育60 min，PBS浸洗，DAPI復染細胞核，熒光顯微鏡下觀察并拍照。紅色熒光為凋亡細胞，藍色熒光為所有661W細胞。
流式細胞儀檢測661W細胞凋亡率。消化細胞后離心收集細胞，PBS浸洗，再離心去上清，按照AnnexinV-APC/7-AAD試劑盒說明操作，加入Annexin V-APC溶液室溫下避光反應15 min，再加入7-AAD染色液避光反應5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，凋亡細胞為紅色熒光。
1.3 統計學方法
采用SPSS25.0軟件行統計學分析。所有實驗數據均重復3次。計量資料以均數±標準差（
）表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
25 mmol/L糖濃度組約70%～80%細胞貼壁生長，細胞胞體呈梭形，邊緣有長棘狀突起（圖1A）；50 mmol/L糖濃度組約50%～60%細胞貼壁生長，細胞胞體變大變圓，分支減少，突起回縮變粗（圖1B）；75 mmol/L糖濃度組約10%～20%細胞貼壁生長，細胞較多聚集成團，細胞胞體進一步變大變圓，細胞明顯活化（圖1C）；100 mmol/L糖濃度組約40%～50%細胞貼壁生長，細胞胞體皺縮變小（圖1D）。
圖1
不同糖濃度培養BV2細胞24 h后倒置相差顯微鏡像 1A示25 mmol/L糖濃度組，胞體呈梭形，邊緣有長棘狀突起；1B示50 mmol/L糖濃度組，胞體變大變圓，分支減少，突起回縮變粗；1C示75 mmol/L糖濃度組，細胞較多聚集成團，胞體進一步變大變圓；1D示100 mmol/L糖濃度組，胞體皺縮變小 標尺：100 μm
免疫熒光檢測結果顯示，BV2細胞CD11b主要表達于胞質中。與25 mmol/L糖濃度組比較，50 mmol/L糖濃度組細胞中CD11b表達增多，熒光強度增強；與50 mmol/L糖濃度組比較，75 mmol/L糖濃度組細胞中CD11b熒光強度進一步增強，染色明顯加深；與75 mmol/L糖濃度組比較，100 mmol/L糖濃度組細胞胞質中CD11b熒光強度減弱，染色變淺（圖2）。
圖2
不同糖濃度組BV2細胞熒光顯微鏡像 2A～2D分別示25、50、75、100 mmol/L糖濃度組。紅色熒光示CD11b蛋白；藍色熒光示細胞核 標尺：20 μm
Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，高糖組BV2細胞中iNOS、CD86蛋白相對表達量增高，Arg-1、CD206蛋白相對表達量降低，差異均有統計學意義（t=?16.783、?11.605、4.325、4.649，P＜0.05）；與高糖組比較，二甲雙胍+高糖組BV2細胞中iNOS、CD86蛋白相對表達量降低，Arg-1、CD206蛋白相對表達量增高，差異均有統計學意義（t=7.231、5.560、?8.035、?8.824，P＜0.01）（表1，圖3）。
表1
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞中iNOS、CD86、Arg-1、CD206蛋白相對表達量（
）（n=3）
圖3
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞中誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、CD86、精氨酸酶-1（Arg-1）、CD206蛋白表達情況（n=3） 3A示電泳圖；3B示各組iNOS、CD86蛋白相對表達量比較；3C示各組Arg-1、CD206蛋白相對表達量比較。*P＜0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001
ELISA檢測結果顯示，與對照組比較，高糖組BV2細胞中IL-6、TNF-α含量增多，IL-4含量降低，差異均有統計學意義（t=?64.312、?127.147、71.547，P＜0.001）；與高糖組比較，二甲雙胍+高糖組BV2細胞中IL-6、TNF-α含量顯著降低，IL-4含量明顯增多，差異均有統計學意義（t=44.426、83.232、?143.115，P＜0.001）（表2，圖4）。
表2
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞中IL-6、TNF-α、IL-4含量（pg/ml，
）（n=3）
圖4
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞中白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-4含量變化（n=3） 4A～4C分別示各組IL-6、TNF-α、IL-4含量比較，***P＜0.001
BV2細胞與661W細胞共培養24 h后，MTT比色法檢測結果顯示，對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組661W細胞活性分別是100.00%、（78.33±5.03）%、（90.33±4.51）%。與對照組比較，高糖組661W細胞活性明顯降低，差異有統計學意義（t=7.456，P＜0.01）；與高糖組比較，二甲雙胍+高糖組661W細胞活性升高，差異有統計學意義（t=?3.076，P＜0.05）（圖5）。
圖5
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組661W細胞活性變化（n=3） *P＜0.05，**P＜0.01
TUNEL法、流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組661W細胞凋亡率分別為（3.95±0.16）%、（21.85±1.38）%、（11.88±0.49）%和（2.49±0.28）%、（17.67±1.13）%、（11.30±1.13）%。與對照組比較，高糖組細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（t=?22.248、?22.628，P＜0.001）；與高糖組比較，二甲雙胍+高糖組細胞凋亡率明顯下降，差異有統計學意義（t=11.767、6.906，P＜0.001、0.01）（圖6）。
圖6
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組細胞凋亡率比較（n=3） *** P＜0.001，** P＜0.01
3 討論
糖尿病引起的高血糖對視網膜神經元具有非血管依賴性影響[13]，視網膜神經細胞凋亡和活化膠質細胞增生為特征的神經細胞的慢性炎癥性損傷是DR更早的表現。因此，觀察DR病理過程中慢性炎癥病變所伴隨的小膠質細胞極化狀態以及視網膜神經細胞活性的改變，并探尋其機制，尋找干預措施，具有重要臨床意義。
小膠質細胞可被激活為兩種極化狀態：M1型小膠質細胞以分泌促炎細胞因子為特征，能吞噬損傷的神經元、組織碎片及血管內皮細胞[13]，同時這些促炎因子又促進視網膜光感受器細胞的病理損傷，因此具有細胞毒性；M2型小膠質細胞能夠分泌抗炎因子及神經營養因子，抑制視網膜炎癥反應，具有抗炎、保護神經節細胞和光感受器細胞等功能[14]。M1型小膠質細胞以iNOS、CD80、CD86和CD32等為特異性表面受體，M2型小膠質細胞以Arg-1、CD206、CD68等為特異性表面受體[11]。本研究選取iNOS、CD86和Arg-1、CD206分別作為M1型、M2型標記物，研究中發現高糖環境下小膠質細胞由高度分支的靜息態轉變為突起收縮的阿米巴狀激活態，極化狀態轉變為促炎M1型。有研究者在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病動物模型中也觀察到小膠質細胞激活后發生了類似的形態變化[14]。這可能是由于一方面高血糖能夠促進蛋白質晚期糖基化終末產物（AGE）的生成，AGE與AGE受體之間的相互作用能誘導小膠質細胞的致炎表型（即M1型），導致細胞炎癥因子分泌增加[15]；另一方面高血糖會導致線粒體中超氧化物的生成增加，并增強蛋白激酶C表達，進一步導致活性氧的增加，活性氧可激活核因子-κB通路誘導炎癥反應[16]，從而上調視網膜小膠質細胞的炎癥反應。
本研究不僅觀察到小膠質細胞在高糖環境下發生了極化狀態以及相伴隨的抗炎與促炎因子分泌的改變，同時發現光感受器細胞的活性及凋亡率與其密切相關。結果顯示，M1型小膠質細胞促進了炎癥反應，導致促炎因子IL-6、TNF-α分泌增加以及抑炎因子IL-4分泌減少，引起光感受器細胞損傷；相反，M2型小膠質細胞則對炎癥反應有抵抗作用，導致抑炎因子IL-4的分泌增加以及促炎因子IL-6、TNF-α分泌減少，從而保護了光感受器細胞。由此可見，M1型和M2型小膠質細胞間的比例變化對于DR中的神經炎癥及視功能起著至關重要的作用。Zhou等[17]發現，在視網膜變性小鼠模型中，降低視網膜中小膠質細胞M1型比例、增加M2型比例后，視網膜外核層光感受器細胞丟失數量減少，光相干斷層掃描檢查顯示視網膜厚度增加。該實驗在動物模型上印證了小膠質細胞極化狀態與光感受器細胞之間的關系，與本研究體外實驗結果類似。因此，在DR中有效調控小膠質細胞的極化分型將是保護光感受器細胞，延緩DR進展的一個有效靶點。
本研究結果顯示，高糖環境下二甲雙胍使光感受器細胞活性增高、凋亡減少。其原因可能與其調控小膠質細胞向抗炎M2型轉化，并導致抑炎細胞因子分泌增加相關。A等[10]建立視網膜變性小鼠模型，通過玻璃體腔注射二甲雙胍，發現二甲雙胍可抑制小膠質細胞激活，并且增強小鼠視網膜外層光感受器細胞的活性。這與本研究結果一致，均提示二甲雙胍對視網膜神經細胞的炎癥性損傷存在保護作用。二甲雙胍對小膠質細胞的調控作用可能是依賴激活經典AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）通路實現。AMPK是維持細胞能量產生和平衡的關鍵酶，二甲雙胍為經典AMPK激動劑，AMPK的激活已被證明是促進小膠質細胞向M2型極化的一個關鍵分子開關[18]。二甲雙胍已應用于臨床多年，其安全性和副作用早已得到臨床認證，本研究結果表明其在DR中存在著較大的治療潛力，值得進一步探索。
本研究存在的不足：未對二甲雙胍的濃度梯度和量效關系進行實驗；二甲雙胍對小膠質細胞極化狀態及光感受器細胞活性影響的具體分子通路機制尚需進一步探究；實驗模擬高糖環境的葡萄糖濃度與人類糖尿病的血液葡萄糖濃度有一定差異，且小膠質細胞僅在高葡萄糖濃度的培養基中培養了24 h，而糖尿病是血葡萄糖水平慢性增高的過程，故本研究細胞實驗與人體糖尿病的發生發展存在一定差異，尚需進行動物模型研究及臨床科研調查。
糖尿病視網膜病變（DR）基本病理特征是血視網膜屏障受損以及形成病理性新生血管[1]。但研究發現，在視網膜微血管病變之前，視網膜神經細胞即出現了變性改變[2]，其中作為視網膜常駐免疫細胞的小膠質細胞發揮了重要作用[3]。已有研究表明，部分視網膜退行性疾病小膠質細胞在特定環境下被激活、遷移以及極化狀態改變會降低光感受器細胞的活性甚至凋亡[4-5]。本課題組前期亦在糖尿病動物模型中發現小膠質細胞發生的上述變化[6]。但其在不同糖濃度下的被極化狀態及不同極化狀態下對光感受器細胞的影響尚缺乏研究。二甲雙胍是一種廣泛用于治療2型糖尿病的雙胍類降糖劑，除可降低血糖外，對許多系統均有保護神經細胞及抗炎作用[7]。已有研究證明二甲雙胍在視網膜疾病中也具有較大的治療潛力[8-9]。近期研究發現，二甲雙胍可顯著減少視網膜變性小鼠的光感受器細胞凋亡，并顯著抑制視網膜外核層小膠質細胞的激活[10]。小膠質細胞的激活伴隨著細胞形態的改變，并呈現出兩種截然相反的作用，即以促炎作用為主的M1型和以抗炎作用為主的M2型。M1型小膠質細胞以誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、CD80、CD86和CD32等為特異性表面受體，M2型小膠質細胞以精氨酸酶（Arg）-1、CD206、CD68等為特異性表面受體；白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α為M1型小膠質細胞分泌的促炎因子，IL-4為M2型小膠質細胞分泌的抗炎因子[11]。有學者在腦缺血小鼠模型中發現，二甲雙胍通過誘導小膠質細胞向M2型極化，促進新生腦血管的形成[12]。由此我們推測二甲雙胍在DR中可能會通過影響小膠質細胞的活性和極化狀態從而影響光感受器細胞。為此，本研究通過體外細胞實驗探討二甲雙胍在高糖環境下對小膠質細胞極化狀態和光感受器細胞活性的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗細胞和主要材料
小鼠BV2小膠質細胞株（國家生物醫學實驗細胞資源庫）；小鼠661W視網膜光感受器細胞株（上海奧陸生物科技公司）。二甲雙胍粉劑、胎牛血清（美國Sigma公司）；D-葡萄糖（北京Solarbio公司）；Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM培養基，美國Gbico公司）； CD11b抗體（英國Abcam公司）；兔多抗iNOS、兔多抗Arg-1（美國Affinity公司）；鼠單抗CD206、兔單抗CD86（英國Abcam公司）；小鼠單抗β-肌動蛋白（actin，美國Santa公司)；辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗（英國Abcam公司）；熒光標記羊抗大鼠IgG二抗（美國Santa公司）；IL-4、TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）；噻唑藍（MTT，美國Amresco公司）；原位末端標記（TUNEL）細胞凋亡試劑盒（瑞士Roche公司）；APC/7-AAD細胞凋亡試劑盒（美國Immuno Chemistry公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。
1.2 方法
細胞培養。小鼠BV2小膠質細胞株、661W視網膜光感受器細胞株置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養基中，5% CO2、37 ℃、相對濕度為95%的細胞培養箱培養，取對數生長期細胞用于實驗。
確定促進小膠質細胞活化的最佳葡萄糖濃度。BV2細胞分為25、50、75、100 mmol/L糖濃度組，細胞培養24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞大小、形狀、懸浮和貼壁細胞比例。免疫熒光染色檢測各組細胞中CD11b表達。4%多聚甲醛固定細胞爬片，0.5% Triton X-100室溫下通透15 min，滴加正常山羊血清于室溫下封閉30 min，加入稀釋CD11b一抗（1∶100）濕盒中4 ℃過夜；磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗后加入稀釋熒光二抗（1∶100）濕盒中37 ℃避光孵育1 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染色5 min，PBS浸洗后滴加含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。細胞中CD11b呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。
BV2細胞分為對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組。高糖組細胞培養基中加入75 mmo/L葡萄糖；二甲雙胍+高糖組細胞采用2 mmol/L的二甲雙胍預處理12 h后，再置于75 mmo/L葡萄糖濃度培養基中培養；對照組細胞正常培養，不做任何處理。培養24 h后，將BV2細胞與661W細胞置于Transwell小室共培養24 h。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測BV2細胞內iNOS、CD86、Arg-1、CD206蛋白相對表達量。加入蛋白裂解液于冰上裂解30 min提取細胞總蛋白，離心后收集上清，二喹啉甲酸法測定樣品蛋白濃度。變性后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質分離并轉移至聚偏氟乙烯膜上，封閉液封閉2 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；三羥甲基氨基甲烷緩沖液浸洗后加入稀釋二抗室溫孵育2 h，增強化學發光法顯色，以β-actin作為內參照，BandScan軟件分析目的蛋白表達量。
ELISA檢測BV2細胞中IL-6、TNF-α、IL-4的表達。收集細胞上清作為待測樣本，根據試劑盒說明書操作，酶標儀測量各組樣本在波長450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，繪制標準曲線，計算樣本濃度。
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞與661W細胞于Transwell小室共培養24 h。共培養時，BV2細胞置于小室下層，661W細胞置于小室上層。
MTT比色法檢測各組661W細胞活性。細胞密度達到70%時，胰酶消化細胞，以1×104個/ml的密度接種于96孔板中，加入50 μl/孔0.5%MTT溶液，37 ℃敷箱中孵化4 h，加入150 μl/孔二甲基亞砜震蕩10 min，酶標儀測量各孔樣本在波長568 nm處的A值。設定對照組661W細胞活性為100%，實驗組661W細胞活性（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。
TUNEL法檢測661W細胞凋亡情況。4%多聚甲醛固定細胞爬片，PBS浸洗，滴加稀釋后的Proteinase K溶液（20 μg/ml）通透20 min，加入TUNEL反應混合液濕盒內避光孵育60 min，PBS浸洗，DAPI復染細胞核，熒光顯微鏡下觀察并拍照。紅色熒光為凋亡細胞，藍色熒光為所有661W細胞。
流式細胞儀檢測661W細胞凋亡率。消化細胞后離心收集細胞，PBS浸洗，再離心去上清，按照AnnexinV-APC/7-AAD試劑盒說明操作，加入Annexin V-APC溶液室溫下避光反應15 min，再加入7-AAD染色液避光反應5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，凋亡細胞為紅色熒光。
1.3 統計學方法
采用SPSS25.0軟件行統計學分析。所有實驗數據均重復3次。計量資料以均數±標準差（）表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
25 mmol/L糖濃度組約70%～80%細胞貼壁生長，細胞胞體呈梭形，邊緣有長棘狀突起（圖1A）；50 mmol/L糖濃度組約50%～60%細胞貼壁生長，細胞胞體變大變圓，分支減少，突起回縮變粗（圖1B）；75 mmol/L糖濃度組約10%～20%細胞貼壁生長，細胞較多聚集成團，細胞胞體進一步變大變圓，細胞明顯活化（圖1C）；100 mmol/L糖濃度組約40%～50%細胞貼壁生長，細胞胞體皺縮變小（圖1D）。
圖1
不同糖濃度培養BV2細胞24 h后倒置相差顯微鏡像 1A示25 mmol/L糖濃度組，胞體呈梭形，邊緣有長棘狀突起；1B示50 mmol/L糖濃度組，胞體變大變圓，分支減少，突起回縮變粗；1C示75 mmol/L糖濃度組，細胞較多聚集成團，胞體進一步變大變圓；1D示100 mmol/L糖濃度組，胞體皺縮變小 標尺：100 μm
免疫熒光檢測結果顯示，BV2細胞CD11b主要表達于胞質中。與25 mmol/L糖濃度組比較，50 mmol/L糖濃度組細胞中CD11b表達增多，熒光強度增強；與50 mmol/L糖濃度組比較，75 mmol/L糖濃度組細胞中CD11b熒光強度進一步增強，染色明顯加深；與75 mmol/L糖濃度組比較，100 mmol/L糖濃度組細胞胞質中CD11b熒光強度減弱，染色變淺（圖2）。
圖2
不同糖濃度組BV2細胞熒光顯微鏡像 2A～2D分別示25、50、75、100 mmol/L糖濃度組。紅色熒光示CD11b蛋白；藍色熒光示細胞核 標尺：20 μm
Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，高糖組BV2細胞中iNOS、CD86蛋白相對表達量增高，Arg-1、CD206蛋白相對表達量降低，差異均有統計學意義（t=?16.783、?11.605、4.325、4.649，P＜0.05）；與高糖組比較，二甲雙胍+高糖組BV2細胞中iNOS、CD86蛋白相對表達量降低，Arg-1、CD206蛋白相對表達量增高，差異均有統計學意義（t=7.231、5.560、?8.035、?8.824，P＜0.01）（表1，圖3）。
表1
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞中iNOS、CD86、Arg-1、CD206蛋白相對表達量（）（n=3）
圖3
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞中誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、CD86、精氨酸酶-1（Arg-1）、CD206蛋白表達情況（n=3） 3A示電泳圖；3B示各組iNOS、CD86蛋白相對表達量比較；3C示各組Arg-1、CD206蛋白相對表達量比較。*P＜0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001
ELISA檢測結果顯示，與對照組比較，高糖組BV2細胞中IL-6、TNF-α含量增多，IL-4含量降低，差異均有統計學意義（t=?64.312、?127.147、71.547，P＜0.001）；與高糖組比較，二甲雙胍+高糖組BV2細胞中IL-6、TNF-α含量顯著降低，IL-4含量明顯增多，差異均有統計學意義（t=44.426、83.232、?143.115，P＜0.001）（表2，圖4）。
表2
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞中IL-6、TNF-α、IL-4含量（pg/ml，）（n=3）
圖4
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組BV2細胞中白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-4含量變化（n=3） 4A～4C分別示各組IL-6、TNF-α、IL-4含量比較，***P＜0.001
BV2細胞與661W細胞共培養24 h后，MTT比色法檢測結果顯示，對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組661W細胞活性分別是100.00%、（78.33±5.03）%、（90.33±4.51）%。與對照組比較，高糖組661W細胞活性明顯降低，差異有統計學意義（t=7.456，P＜0.01）；與高糖組比較，二甲雙胍+高糖組661W細胞活性升高，差異有統計學意義（t=?3.076，P＜0.05）（圖5）。
圖5
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組661W細胞活性變化（n=3） *P＜0.05，**P＜0.01
TUNEL法、流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組661W細胞凋亡率分別為（3.95±0.16）%、（21.85±1.38）%、（11.88±0.49）%和（2.49±0.28）%、（17.67±1.13）%、（11.30±1.13）%。與對照組比較，高糖組細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（t=?22.248、?22.628，P＜0.001）；與高糖組比較，二甲雙胍+高糖組細胞凋亡率明顯下降，差異有統計學意義（t=11.767、6.906，P＜0.001、0.01）（圖6）。
圖6
對照組、高糖組、二甲雙胍+高糖組細胞凋亡率比較（n=3） *** P＜0.001，** P＜0.01
3 討論
糖尿病引起的高血糖對視網膜神經元具有非血管依賴性影響[13]，視網膜神經細胞凋亡和活化膠質細胞增生為特征的神經細胞的慢性炎癥性損傷是DR更早的表現。因此，觀察DR病理過程中慢性炎癥病變所伴隨的小膠質細胞極化狀態以及視網膜神經細胞活性的改變，并探尋其機制，尋找干預措施，具有重要臨床意義。
小膠質細胞可被激活為兩種極化狀態：M1型小膠質細胞以分泌促炎細胞因子為特征，能吞噬損傷的神經元、組織碎片及血管內皮細胞[13]，同時這些促炎因子又促進視網膜光感受器細胞的病理損傷，因此具有細胞毒性；M2型小膠質細胞能夠分泌抗炎因子及神經營養因子，抑制視網膜炎癥反應，具有抗炎、保護神經節細胞和光感受器細胞等功能[14]。M1型小膠質細胞以iNOS、CD80、CD86和CD32等為特異性表面受體，M2型小膠質細胞以Arg-1、CD206、CD68等為特異性表面受體[11]。本研究選取iNOS、CD86和Arg-1、CD206分別作為M1型、M2型標記物，研究中發現高糖環境下小膠質細胞由高度分支的靜息態轉變為突起收縮的阿米巴狀激活態，極化狀態轉變為促炎M1型。有研究者在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病動物模型中也觀察到小膠質細胞激活后發生了類似的形態變化[14]。這可能是由于一方面高血糖能夠促進蛋白質晚期糖基化終末產物（AGE）的生成，AGE與AGE受體之間的相互作用能誘導小膠質細胞的致炎表型（即M1型），導致細胞炎癥因子分泌增加[15]；另一方面高血糖會導致線粒體中超氧化物的生成增加，并增強蛋白激酶C表達，進一步導致活性氧的增加，活性氧可激活核因子-κB通路誘導炎癥反應[16]，從而上調視網膜小膠質細胞的炎癥反應。
本研究不僅觀察到小膠質細胞在高糖環境下發生了極化狀態以及相伴隨的抗炎與促炎因子分泌的改變，同時發現光感受器細胞的活性及凋亡率與其密切相關。結果顯示，M1型小膠質細胞促進了炎癥反應，導致促炎因子IL-6、TNF-α分泌增加以及抑炎因子IL-4分泌減少，引起光感受器細胞損傷；相反，M2型小膠質細胞則對炎癥反應有抵抗作用，導致抑炎因子IL-4的分泌增加以及促炎因子IL-6、TNF-α分泌減少，從而保護了光感受器細胞。由此可見，M1型和M2型小膠質細胞間的比例變化對于DR中的神經炎癥及視功能起著至關重要的作用。Zhou等[17]發現，在視網膜變性小鼠模型中，降低視網膜中小膠質細胞M1型比例、增加M2型比例后，視網膜外核層光感受器細胞丟失數量減少，光相干斷層掃描檢查顯示視網膜厚度增加。該實驗在動物模型上印證了小膠質細胞極化狀態與光感受器細胞之間的關系，與本研究體外實驗結果類似。因此，在DR中有效調控小膠質細胞的極化分型將是保護光感受器細胞，延緩DR進展的一個有效靶點。
本研究結果顯示，高糖環境下二甲雙胍使光感受器細胞活性增高、凋亡減少。其原因可能與其調控小膠質細胞向抗炎M2型轉化，并導致抑炎細胞因子分泌增加相關。A等[10]建立視網膜變性小鼠模型，通過玻璃體腔注射二甲雙胍，發現二甲雙胍可抑制小膠質細胞激活，并且增強小鼠視網膜外層光感受器細胞的活性。這與本研究結果一致，均提示二甲雙胍對視網膜神經細胞的炎癥性損傷存在保護作用。二甲雙胍對小膠質細胞的調控作用可能是依賴激活經典AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）通路實現。AMPK是維持細胞能量產生和平衡的關鍵酶，二甲雙胍為經典AMPK激動劑，AMPK的激活已被證明是促進小膠質細胞向M2型極化的一個關鍵分子開關[18]。二甲雙胍已應用于臨床多年，其安全性和副作用早已得到臨床認證，本研究結果表明其在DR中存在著較大的治療潛力，值得進一步探索。
本研究存在的不足：未對二甲雙胍的濃度梯度和量效關系進行實驗；二甲雙胍對小膠質細胞極化狀態及光感受器細胞活性影響的具體分子通路機制尚需進一步探究；實驗模擬高糖環境的葡萄糖濃度與人類糖尿病的血液葡萄糖濃度有一定差異，且小膠質細胞僅在高葡萄糖濃度的培養基中培養了24 h，而糖尿病是血葡萄糖水平慢性增高的過程，故本研究細胞實驗與人體糖尿病的發生發展存在一定差異，尚需進行動物模型研究及臨床科研調查。
