視網膜微血管功能失調、炎癥反應過度激活以及神經元的退行性病變是糖尿病視網膜病變（DR）的主要發病機制。環狀RNA（circRNA）是一類主要由前體RNA經剪切加工后具有特殊環狀結構的內源性非編碼RNA，其廣泛存在于視網膜中并參與各種眼底疾病的發生發展。已有研究表明，circRNA在DR視網膜組織中存在異常表達，并且其可作為miRNA的“海綿”，通過參與視網膜微血管功能失調、炎癥反應及神經元退行性病變過程影響DR的發生發展。未來，對circRNA在DR中的探索將深入闡明DR的病理生理過程，使其有望成為DR診斷的生物標志物及治療的分子靶點，從而實現DR早期診斷及精準治療的目標。
引用本文： 陸辰, 邵珺. 環狀RNA在糖尿病視網膜病變中的作用研究進展. 中華眼底病雜志, 2022, 38(1): 77-80. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210416-00197 復制
近年來有研究發現，糖尿病患者血清中多種環狀RNA（circRNA）含量顯著升高[1]。circRNA廣泛存在于哺乳動物細胞中，是一類主要由前體RNA經剪切加工后具有特殊的環狀結構且不具有5’端帽結構及3’端多聚A尾的內源性非編碼RNA，具有多樣性[2]。有研究發現，糖尿病視網膜病變（DR）患者的玻璃體液中，circRNA表達與非糖尿病患者相比也呈現出顯著性差異[3]。這說明circRNA可能作為診斷DR的一種新的生物學標志，為深入探究DR的發病機制提供了新的思路。現就circRNA在DR中的研究進展作一綜述。
1 circRNA作為DR診斷的分子標記物
circRNA表現出參與多種疾病發生發展的特點，其中包括腫瘤、血管性疾病及神經系統疾病等[4-8]。近年有研究表明，circRNA在正常眼組織及眼的病理性進程中均呈現出差異性表達，參與了眼表疾病、白內障、青光眼和眼底疾病等病理發展過程[9-11]。視網膜組織中circRNA的表達模式十分復雜。Sun等[12]發現，circRNA在人視網膜中廣泛存在，并發揮不同的調控作用，如circPDE4B能夠調控細胞的增生。Gu等[1]收集DR患者血漿以測定其中circRNA表達譜，發現30種circRNA表達量顯著性上調，如has_circRNA_063981、has_circRNA_404457等。Zhang等[13]對DR患者視網膜、增生膜、血液及玻璃體組織的總RNA表達譜進行測定并分析，發現529種circRNA發生特異性表達量改變，包括356種上調的circRNA及173種下調的circRNA，其中circ_0005015在玻璃體組織、血漿及病理性視網膜前纖維血管膜中表達呈顯著性上調，且參與了視網膜血管內皮的功能調控。He等[3]通過測定DR患者玻璃體液中circRNA的表達譜也發現多種circRNA表達量發生了改變，包括122種上調的circRNA和9種下調的circRNA。Liu等[14]在DR患者視網膜前膜中也發現了一種參與DR血管內皮細胞功能失調機制的circRNA，即cZNF609，其表達量顯著性高于非糖尿病患者。Liu等[15]發現，DR患者視網膜前膜中has_circ_0002570的含量顯著升高。與之類似，Shan等[16]發現DR患者血漿及房水中circHIPK3表達量顯著升高。Wu等[17]發現，DR患者全血標本中circ_0001953表達量顯著升高，并且存在較高的靈敏度和特異性。這些研究結果均說明，circRNA表達量的特異性變化在DR病理生理中可能起到一定的作用，其與DR發病機制之間的關系值得探究，這有助于進一步闡明DR發病及進展的分子機制，且其具有作為診斷DR的特異性生物標志物的潛能，為DR的治療提供新的研究方向。這些circRNA有望于成為特異性的生物學標志及治療靶標用于DR患者的診斷及治療。
2 circRNA在DR血管功能失調中發揮的作用
DR的病理生理改變主要表現為視網膜血管結構及功能的異常，包括視網膜血管通透性增高、血流灌注減少及新生血管形成，并最終導致視網膜的形態學改變及功能喪失[18]。在DR的病理生理過程中，視網膜血管功能異常占據了重要地位，但其背后的分子機制尚未完全闡明，現有的包括血管內皮生長因子（VEGF）相關通路、氧化應激相關通路和炎癥反應等[19]。circRNA具有多種功能，其中包括充當miRNA“海綿”，對相應的miRNA起負調控作用。circRNA富含miRNA的結合位點，可以通過堿基互補配對與miRNA的靶序列相結合，進而阻斷miRNA的下游通路，對miRNA的功能起到靶向抑制作用，這一作用被稱為miRNA的海綿作用[20]。研究發現，circRNA的海綿作用在生物體中具有普遍性，大量內源性circRNA可以有效地充當miRNA“海綿”，通過豐度的變化對基因表達發揮調控作用[20]。circRNA的海綿作用在DR視網膜血管功能異常背后的分子網絡機制中的影響，近年來逐步得到重視和闡述。
視網膜微血管內皮細胞形態及功能狀態的改變在DR視網膜血管異常中發揮重要作用。Zhu等[21]發現，在視網膜中特異性大量表達的miR-20b-5p，其在DR患者視網膜中呈高表達，通過調控激活素膜結合抑制因子基因影響視網膜微血管內皮細胞的功能，在高葡萄糖狀態下促進了視網膜微血管內皮細胞的遷移及血管形成，而circDMNT3B即為發揮充當miR-20b-5p海綿作用的circRNA。這提示，circDMNT3在糖尿病狀態下呈現低表達，因此相應地對miR-20b-5p的海綿作用被削弱，進而促進了視網膜微血管內皮細胞的增生、遷移及新生血管形成，最終導致DR患者視網膜纖維血管膜的形成。有研究在糖尿病模型大鼠玻璃體內注射腺相關病毒-DJ-circDNMT3B以上調circDNMT3B在眼球內的含量，發現大鼠視網膜異常血管生成及視力損傷均被有效緩解[21]。Shan等[16]發現，circHIPK3在DR視網膜內皮細胞中大量表達，并通過抑制miR-30a的功能，發揮海綿作用，從而導致內皮增生及血管功能異常。circHIPK3的表達量在DR患者視網膜病理性纖維血管膜中顯著上調；而circHIPK3沉默后，異常的毛細血管生成減少，高葡萄糖誘導的視網膜血管滲漏也隨之緩解，同時一系列炎癥因子如白細胞介素（IL）-2、VEGF-C、卷曲蛋白4、WNT家族蛋白2等的表達量也均被下調。DR患者circHIPK3的表達量上調促使了視網膜血管內皮細胞的表型改變，進而發生視網膜血管內皮細胞的增生、遷移和重塑，造成血管的滲透性增高及功能異常。Zhang等[13]對DR患者視網膜組織中的總circRNA進行分析，發現視網膜纖維血管膜、外周血漿及玻璃體組織中has_circ_0005015表達量均顯著上調；進一步研究發現，has_circ_0005015作為miRNA“海綿”，抑制miR-519d-3p活性，進而通過上調基質金屬蛋白酶（MMP）-2、信號傳導蛋白與轉錄激活物、X-連鎖凋亡抑制蛋白等基因的表達，促進內皮細胞的增生、遷移及新生血管形成，造成視網膜血管的功能異常[13]。Liu等[14]發現，在體內外低氧及高葡萄糖環境的誘導下，cZNF609這一在內皮細胞內大量表達的circRNA表達量顯著上調，而cZNF609沉默后，視網膜血管喪失及病理性新生血管形成被有效抑制；進一步研究發現，cZNF609通過抑制miR-615-5p的活性，作為其對應的海綿circRNA，進而抑制肌細胞增強因子2A的表達，發揮在高葡萄糖及低氧條件下對視網膜的病理性作用。在隨后對臨床樣本的circRNA檢測中這一結果也被進一步證實。Liu等[14]發現，與對照組相比，DR患者視網膜纖維血管膜及外周血中cZNF609的含量顯著升高，而miR-615-5p含量則明顯下調。Zou等[22]發現，circCOL1A2及VEGF水平在高葡萄糖作用下的人視網膜血管內皮細胞中呈現高表達。circCOL1A2作為miR-29b的“海綿”，通過吸附circRNA而促進VEGF的表達。circCOL1A2沉默能夠通過增強miR-29b表達進而抑制人視網膜血管內皮細胞的增生、遷移、通透性增加及血管生成相關基因的表達。Zou等[22]發現，敲除CircCOL1A2的DR模型小鼠視網膜中VEGF表達量明顯降低，且其表達量降低是通過miR-29b的表達上調實現的，其DR病理性新生血管的形成過程也被緩解和抑制。類似地，Liu等[15]也發現，circ_0002570在DR患者中的表達明顯升高，其對應的“海綿”受體miR-1243表達量則明顯降低。在高葡萄糖內環境中，circ_0002570通過抑制miR-1243的作用上調血管動蛋白的表達，導致視網膜微血管的功能失調。在敲除circ_0002570后，高葡萄糖內環境影響下的視網膜內皮細胞釋放炎癥介質及VEGF明顯減少，內皮細胞增生、遷移及新生血管形成等過程也受到了抑制[15]。這些研究結果均表明，在人視網膜中存在著多種circRNA，在DR進展過程中，某些特定的circRNA表達量發生變化，通過海綿作用抑制對應的miRNA表達，促進視網膜微血管內皮細胞的增生、遷移及新生血管形成，參與DR視網膜血管的異常變化發展。
視網膜毛細血管細胞主要包括內皮細胞及周細胞。除了視網膜微血管內皮細胞的異常外，周細胞的變化也參與了DR的視網膜血管功能異常。在DR進展期，視網膜新生血管的形成不僅有內皮細胞增生、遷移及成熟過程的參與，周細胞的增生與招募也參與其中。周細胞是在毛細血管內皮細胞與基膜之間的一種扁平而有突起的細胞，細胞突起緊貼在內皮細胞的基底面，主要起著對管腔的機械支持作用，并可能參與血管生長或再生時的調控[23]。視網膜周細胞的覆蓋率明顯高于其他的毛細血管，值得注意的是，周細胞變性被認為是糖尿病所引起的視網膜血管功能異常的早期標志[24]。Jiang等[25]發現，在DR患者的玻璃體液呈現高表達的cZNF532，在DR模型小鼠的視網膜毛細血管的周細胞中也呈現高表達。在高葡萄糖刺激下，周細胞內的cZNF532表達上調，并通過作為miR-29a-3p的“海綿”circRNA，誘導神經膠質抗原2、賴氨酰氧化酶樣蛋白2及細胞周期依賴性激酶2的表達，促進周細胞的增生及分化，募集周細胞向內皮細胞轉化。cZNF532沉默則使高葡萄糖及氧化應激所誘導的周細胞凋亡增多，其向內皮細胞的轉化減少。敲除cZNF532加重了視網膜血管周細胞的變性和血管功能失調，而過表達cZNF532則有效緩解了DR的進展，改善了視網膜血管的通透性增高及周細胞的覆蓋降低。Liu等[26]也得到了與之相似的研究結果，其發現cPWWP2A過表達可以保護周細胞免受高葡萄糖環境誘導的損傷。在體外實驗中，攜帶cPWWP2A的外泌體直接調控了周細胞的生物學功能。作為miR-579的“海綿”circRNA，cPWWP2A抑制了miR-579的活性并上調血管生成素1、閉鎖蛋白及煙酰胺腺苷二核苷酸依賴性去乙酰化酶沉默信息調節因子2相關酶1的表達，促進周細胞向內皮細胞的轉化[26]。這說明，周細胞內表達上調的cPWWP2A可通過外泌體從周細胞傳遞至內皮細胞，對內皮細胞起保護性調控作用。與對照組相比，周細胞內cPWWP2A沉默使得內皮的通透性顯著增高[26]。cPWWP2A從周細胞至內皮細胞的傳遞影響了內皮細胞增生、遷移及新生血管形成的過程。以上研究結果表明，circRNA可作為周細胞與內皮細胞之間的媒介，調控兩者在高葡萄糖應急狀態下的相互作用，在DR病理狀態下造成視網膜微血管的功能失調。周細胞與內皮細胞之間數量及功能的不協調，以及周細胞的增生及招募不足使新生血管的成熟過程受影響，導致病理性新生血管的通透性增高及機械作用差。circRNA在周細胞變性及視網膜微血管功能失調中的作用，為進一步闡明DR的發病機制及創新DR的治療手段提供了新的思路。
3 circRNA在DR血視網膜外屏障破壞中發揮的作用
血視網膜屏障由內屏障和外屏障組成，其中視網膜毛細血管內皮及其連接構成了內屏障，視網膜色素上皮（RPE）細胞形成了血視網膜外屏障。RPE細胞使視網膜組織液與脈絡膜組織液分離，在DR中，RPE細胞的結構和功能失調造成的血視網膜外屏障被破壞及炎癥反應使得血管滲出物經破壞的外屏障外漏，在DR發展及患者視力喪失中發揮重要作用[27]。 Li等[28]發現，在高葡萄糖誘導的DR模型RPE細胞中，circRNA_0084043的表達量明顯升高，并促進細胞增生，抑制細胞凋亡。circRNA_0084043沉默使得RPE細胞的氧化應激過程被抑制，相應地丙二醛水平被下調，超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化酶活性被激活，腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6及環氧化酶-2等炎癥介質釋放減少。circRNA_0084043通過調控miR-140-3p，促進細胞凋亡及炎癥過程，特別是TNF-α的高表達，參與DR的進展[28]。Sun和Kang[29]也發現，has_circ_0041795的表達量在高葡萄糖誘導下的RPE細胞中顯著升高，并促進了細胞凋亡。has_circ_0041795顯著上調TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達，促進炎癥反應，并抑制其下游的miR-646表達，發揮circRNA的海綿作用，并上調VEGF-C的表達，從而在DR進展中發揮作用[29]。而Zhou等[30]發現，糖尿病大鼠RPE細胞中circ-ITCH表達量顯著低于對照組。在糖尿病大鼠模型RPE細胞中過表達circ-ITCH，MMP-2、MMP-9及TNF-α的表達均被抑制[30]。作為miR-22的“海綿”circRNA，circ-ITCH在RPE細胞中的低表達促進了miR-22的活性，進而上調了MMP-2、MMP-9及TNF-α的表達，在糖尿病視網膜慢性微血管炎癥反應及新生血管形成過程中發揮了重要作用[30]。以上研究結果提示，circRNA的表達量改變在DR發生發展中誘導了RPE細胞凋亡，并通過調控一系列炎癥介質的釋放進一步影響RPE細胞及視網膜血管內皮細胞的結構及功能，造成了血視網膜屏障的破壞，參與DR的發展。
4 小結與展望
視網膜微血管功能失調、炎癥反應過度激活以及神經元的退行性病變是DR的主要發病機制[31]。這三個關鍵環節相互影響，共同參與了DR病程的進展，但背后具體的調控機制及其在發生過程中的先后順序目前尚不明確。circRNA廣泛存在視網膜中并參與各種眼底疾病的發生發展過程，但對其功能還知之甚少。目前對circRNA的研究主要集中在腫瘤領域，其中具有調控細胞增生作用的circ-ITCH及circHIPK3不僅在腫瘤的分子診斷、靶向治療及預后判斷上有光明的前景，同時也被發現參與了視網膜病變的病理過程[16, 30, 32-33]。circRNA在DR過程中的機制研究逐漸得到重視，其中circPDE4B、cZNF609不僅在視網膜呈特異性高表達，而且被證實參與了細胞增生調節和病理性新生血管形成過程，在DR的分子診斷及靶向治療方面具有重要的價值[14, 34]。總的來說，針對DR過程中circRNA發揮作用的研究，目前尤以circRNA對高葡萄糖應激內環境下視網膜微血管病變失調的影響最為集中，其他作用機制方面仍有待進一步探索。
現有的對于circRNA參與DR病理生理過程的研究也存在著一些局限與不足：（1）多數實驗僅建立在單一細胞系或實驗動物層面，特定的circRNA實際在人視網膜中的表達及DR病理過程中的變化不能明確；（2）從DR患者獲得的病理標本由于眼科學的特殊性，樣本量少且缺乏多中心的樣本，結果偏倚難以避免；（3）circRNA的提取、量化和分析方法以及平臺的不同，缺乏標準化，各研究之間難以比較；（4）多種與DR相關的circRNA被發現，相互之間缺乏聯系，隨著目標circRNA的增多，以circRNA為DR診斷生物學標志及治療靶標的對象選擇面臨挑戰；（5）目前研究主要集中于circRNA在調控視網膜微血管功能失調及炎癥反應過度激活中所起的作用，對于circRNA對DR神經退行性病變影響方面的研究依然缺乏。
未來，對circRNA在DR中的探索將深入闡明DR的病理生理過程，在視網膜微血管功能失調、炎癥反應尤其是應激狀態下神經退行性病變中circRNA所起的作用將進一步完善DR的發病機制。研究的進展及理論的更新有望使circRNA成為早期診斷DR的有效生物學標志，并為DR的精準治療提供嶄新的生物學靶點。
近年來有研究發現，糖尿病患者血清中多種環狀RNA（circRNA）含量顯著升高[1]。circRNA廣泛存在于哺乳動物細胞中，是一類主要由前體RNA經剪切加工后具有特殊的環狀結構且不具有5’端帽結構及3’端多聚A尾的內源性非編碼RNA，具有多樣性[2]。有研究發現，糖尿病視網膜病變（DR）患者的玻璃體液中，circRNA表達與非糖尿病患者相比也呈現出顯著性差異[3]。這說明circRNA可能作為診斷DR的一種新的生物學標志，為深入探究DR的發病機制提供了新的思路。現就circRNA在DR中的研究進展作一綜述。
1 circRNA作為DR診斷的分子標記物
circRNA表現出參與多種疾病發生發展的特點，其中包括腫瘤、血管性疾病及神經系統疾病等[4-8]。近年有研究表明，circRNA在正常眼組織及眼的病理性進程中均呈現出差異性表達，參與了眼表疾病、白內障、青光眼和眼底疾病等病理發展過程[9-11]。視網膜組織中circRNA的表達模式十分復雜。Sun等[12]發現，circRNA在人視網膜中廣泛存在，并發揮不同的調控作用，如circPDE4B能夠調控細胞的增生。Gu等[1]收集DR患者血漿以測定其中circRNA表達譜，發現30種circRNA表達量顯著性上調，如has_circRNA_063981、has_circRNA_404457等。Zhang等[13]對DR患者視網膜、增生膜、血液及玻璃體組織的總RNA表達譜進行測定并分析，發現529種circRNA發生特異性表達量改變，包括356種上調的circRNA及173種下調的circRNA，其中circ_0005015在玻璃體組織、血漿及病理性視網膜前纖維血管膜中表達呈顯著性上調，且參與了視網膜血管內皮的功能調控。He等[3]通過測定DR患者玻璃體液中circRNA的表達譜也發現多種circRNA表達量發生了改變，包括122種上調的circRNA和9種下調的circRNA。Liu等[14]在DR患者視網膜前膜中也發現了一種參與DR血管內皮細胞功能失調機制的circRNA，即cZNF609，其表達量顯著性高于非糖尿病患者。Liu等[15]發現，DR患者視網膜前膜中has_circ_0002570的含量顯著升高。與之類似，Shan等[16]發現DR患者血漿及房水中circHIPK3表達量顯著升高。Wu等[17]發現，DR患者全血標本中circ_0001953表達量顯著升高，并且存在較高的靈敏度和特異性。這些研究結果均說明，circRNA表達量的特異性變化在DR病理生理中可能起到一定的作用，其與DR發病機制之間的關系值得探究，這有助于進一步闡明DR發病及進展的分子機制，且其具有作為診斷DR的特異性生物標志物的潛能，為DR的治療提供新的研究方向。這些circRNA有望于成為特異性的生物學標志及治療靶標用于DR患者的診斷及治療。
2 circRNA在DR血管功能失調中發揮的作用
DR的病理生理改變主要表現為視網膜血管結構及功能的異常，包括視網膜血管通透性增高、血流灌注減少及新生血管形成，并最終導致視網膜的形態學改變及功能喪失[18]。在DR的病理生理過程中，視網膜血管功能異常占據了重要地位，但其背后的分子機制尚未完全闡明，現有的包括血管內皮生長因子（VEGF）相關通路、氧化應激相關通路和炎癥反應等[19]。circRNA具有多種功能，其中包括充當miRNA“海綿”，對相應的miRNA起負調控作用。circRNA富含miRNA的結合位點，可以通過堿基互補配對與miRNA的靶序列相結合，進而阻斷miRNA的下游通路，對miRNA的功能起到靶向抑制作用，這一作用被稱為miRNA的海綿作用[20]。研究發現，circRNA的海綿作用在生物體中具有普遍性，大量內源性circRNA可以有效地充當miRNA“海綿”，通過豐度的變化對基因表達發揮調控作用[20]。circRNA的海綿作用在DR視網膜血管功能異常背后的分子網絡機制中的影響，近年來逐步得到重視和闡述。
視網膜微血管內皮細胞形態及功能狀態的改變在DR視網膜血管異常中發揮重要作用。Zhu等[21]發現，在視網膜中特異性大量表達的miR-20b-5p，其在DR患者視網膜中呈高表達，通過調控激活素膜結合抑制因子基因影響視網膜微血管內皮細胞的功能，在高葡萄糖狀態下促進了視網膜微血管內皮細胞的遷移及血管形成，而circDMNT3B即為發揮充當miR-20b-5p海綿作用的circRNA。這提示，circDMNT3在糖尿病狀態下呈現低表達，因此相應地對miR-20b-5p的海綿作用被削弱，進而促進了視網膜微血管內皮細胞的增生、遷移及新生血管形成，最終導致DR患者視網膜纖維血管膜的形成。有研究在糖尿病模型大鼠玻璃體內注射腺相關病毒-DJ-circDNMT3B以上調circDNMT3B在眼球內的含量，發現大鼠視網膜異常血管生成及視力損傷均被有效緩解[21]。Shan等[16]發現，circHIPK3在DR視網膜內皮細胞中大量表達，并通過抑制miR-30a的功能，發揮海綿作用，從而導致內皮增生及血管功能異常。circHIPK3的表達量在DR患者視網膜病理性纖維血管膜中顯著上調；而circHIPK3沉默后，異常的毛細血管生成減少，高葡萄糖誘導的視網膜血管滲漏也隨之緩解，同時一系列炎癥因子如白細胞介素（IL）-2、VEGF-C、卷曲蛋白4、WNT家族蛋白2等的表達量也均被下調。DR患者circHIPK3的表達量上調促使了視網膜血管內皮細胞的表型改變，進而發生視網膜血管內皮細胞的增生、遷移和重塑，造成血管的滲透性增高及功能異常。Zhang等[13]對DR患者視網膜組織中的總circRNA進行分析，發現視網膜纖維血管膜、外周血漿及玻璃體組織中has_circ_0005015表達量均顯著上調；進一步研究發現，has_circ_0005015作為miRNA“海綿”，抑制miR-519d-3p活性，進而通過上調基質金屬蛋白酶（MMP）-2、信號傳導蛋白與轉錄激活物、X-連鎖凋亡抑制蛋白等基因的表達，促進內皮細胞的增生、遷移及新生血管形成，造成視網膜血管的功能異常[13]。Liu等[14]發現，在體內外低氧及高葡萄糖環境的誘導下，cZNF609這一在內皮細胞內大量表達的circRNA表達量顯著上調，而cZNF609沉默后，視網膜血管喪失及病理性新生血管形成被有效抑制；進一步研究發現，cZNF609通過抑制miR-615-5p的活性，作為其對應的海綿circRNA，進而抑制肌細胞增強因子2A的表達，發揮在高葡萄糖及低氧條件下對視網膜的病理性作用。在隨后對臨床樣本的circRNA檢測中這一結果也被進一步證實。Liu等[14]發現，與對照組相比，DR患者視網膜纖維血管膜及外周血中cZNF609的含量顯著升高，而miR-615-5p含量則明顯下調。Zou等[22]發現，circCOL1A2及VEGF水平在高葡萄糖作用下的人視網膜血管內皮細胞中呈現高表達。circCOL1A2作為miR-29b的“海綿”，通過吸附circRNA而促進VEGF的表達。circCOL1A2沉默能夠通過增強miR-29b表達進而抑制人視網膜血管內皮細胞的增生、遷移、通透性增加及血管生成相關基因的表達。Zou等[22]發現，敲除CircCOL1A2的DR模型小鼠視網膜中VEGF表達量明顯降低，且其表達量降低是通過miR-29b的表達上調實現的，其DR病理性新生血管的形成過程也被緩解和抑制。類似地，Liu等[15]也發現，circ_0002570在DR患者中的表達明顯升高，其對應的“海綿”受體miR-1243表達量則明顯降低。在高葡萄糖內環境中，circ_0002570通過抑制miR-1243的作用上調血管動蛋白的表達，導致視網膜微血管的功能失調。在敲除circ_0002570后，高葡萄糖內環境影響下的視網膜內皮細胞釋放炎癥介質及VEGF明顯減少，內皮細胞增生、遷移及新生血管形成等過程也受到了抑制[15]。這些研究結果均表明，在人視網膜中存在著多種circRNA，在DR進展過程中，某些特定的circRNA表達量發生變化，通過海綿作用抑制對應的miRNA表達，促進視網膜微血管內皮細胞的增生、遷移及新生血管形成，參與DR視網膜血管的異常變化發展。
視網膜毛細血管細胞主要包括內皮細胞及周細胞。除了視網膜微血管內皮細胞的異常外，周細胞的變化也參與了DR的視網膜血管功能異常。在DR進展期，視網膜新生血管的形成不僅有內皮細胞增生、遷移及成熟過程的參與，周細胞的增生與招募也參與其中。周細胞是在毛細血管內皮細胞與基膜之間的一種扁平而有突起的細胞，細胞突起緊貼在內皮細胞的基底面，主要起著對管腔的機械支持作用，并可能參與血管生長或再生時的調控[23]。視網膜周細胞的覆蓋率明顯高于其他的毛細血管，值得注意的是，周細胞變性被認為是糖尿病所引起的視網膜血管功能異常的早期標志[24]。Jiang等[25]發現，在DR患者的玻璃體液呈現高表達的cZNF532，在DR模型小鼠的視網膜毛細血管的周細胞中也呈現高表達。在高葡萄糖刺激下，周細胞內的cZNF532表達上調，并通過作為miR-29a-3p的“海綿”circRNA，誘導神經膠質抗原2、賴氨酰氧化酶樣蛋白2及細胞周期依賴性激酶2的表達，促進周細胞的增生及分化，募集周細胞向內皮細胞轉化。cZNF532沉默則使高葡萄糖及氧化應激所誘導的周細胞凋亡增多，其向內皮細胞的轉化減少。敲除cZNF532加重了視網膜血管周細胞的變性和血管功能失調，而過表達cZNF532則有效緩解了DR的進展，改善了視網膜血管的通透性增高及周細胞的覆蓋降低。Liu等[26]也得到了與之相似的研究結果，其發現cPWWP2A過表達可以保護周細胞免受高葡萄糖環境誘導的損傷。在體外實驗中，攜帶cPWWP2A的外泌體直接調控了周細胞的生物學功能。作為miR-579的“海綿”circRNA，cPWWP2A抑制了miR-579的活性并上調血管生成素1、閉鎖蛋白及煙酰胺腺苷二核苷酸依賴性去乙酰化酶沉默信息調節因子2相關酶1的表達，促進周細胞向內皮細胞的轉化[26]。這說明，周細胞內表達上調的cPWWP2A可通過外泌體從周細胞傳遞至內皮細胞，對內皮細胞起保護性調控作用。與對照組相比，周細胞內cPWWP2A沉默使得內皮的通透性顯著增高[26]。cPWWP2A從周細胞至內皮細胞的傳遞影響了內皮細胞增生、遷移及新生血管形成的過程。以上研究結果表明，circRNA可作為周細胞與內皮細胞之間的媒介，調控兩者在高葡萄糖應急狀態下的相互作用，在DR病理狀態下造成視網膜微血管的功能失調。周細胞與內皮細胞之間數量及功能的不協調，以及周細胞的增生及招募不足使新生血管的成熟過程受影響，導致病理性新生血管的通透性增高及機械作用差。circRNA在周細胞變性及視網膜微血管功能失調中的作用，為進一步闡明DR的發病機制及創新DR的治療手段提供了新的思路。
3 circRNA在DR血視網膜外屏障破壞中發揮的作用
血視網膜屏障由內屏障和外屏障組成，其中視網膜毛細血管內皮及其連接構成了內屏障，視網膜色素上皮（RPE）細胞形成了血視網膜外屏障。RPE細胞使視網膜組織液與脈絡膜組織液分離，在DR中，RPE細胞的結構和功能失調造成的血視網膜外屏障被破壞及炎癥反應使得血管滲出物經破壞的外屏障外漏，在DR發展及患者視力喪失中發揮重要作用[27]。 Li等[28]發現，在高葡萄糖誘導的DR模型RPE細胞中，circRNA_0084043的表達量明顯升高，并促進細胞增生，抑制細胞凋亡。circRNA_0084043沉默使得RPE細胞的氧化應激過程被抑制，相應地丙二醛水平被下調，超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化酶活性被激活，腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6及環氧化酶-2等炎癥介質釋放減少。circRNA_0084043通過調控miR-140-3p，促進細胞凋亡及炎癥過程，特別是TNF-α的高表達，參與DR的進展[28]。Sun和Kang[29]也發現，has_circ_0041795的表達量在高葡萄糖誘導下的RPE細胞中顯著升高，并促進了細胞凋亡。has_circ_0041795顯著上調TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達，促進炎癥反應，并抑制其下游的miR-646表達，發揮circRNA的海綿作用，并上調VEGF-C的表達，從而在DR進展中發揮作用[29]。而Zhou等[30]發現，糖尿病大鼠RPE細胞中circ-ITCH表達量顯著低于對照組。在糖尿病大鼠模型RPE細胞中過表達circ-ITCH，MMP-2、MMP-9及TNF-α的表達均被抑制[30]。作為miR-22的“海綿”circRNA，circ-ITCH在RPE細胞中的低表達促進了miR-22的活性，進而上調了MMP-2、MMP-9及TNF-α的表達，在糖尿病視網膜慢性微血管炎癥反應及新生血管形成過程中發揮了重要作用[30]。以上研究結果提示，circRNA的表達量改變在DR發生發展中誘導了RPE細胞凋亡，并通過調控一系列炎癥介質的釋放進一步影響RPE細胞及視網膜血管內皮細胞的結構及功能，造成了血視網膜屏障的破壞，參與DR的發展。
4 小結與展望
視網膜微血管功能失調、炎癥反應過度激活以及神經元的退行性病變是DR的主要發病機制[31]。這三個關鍵環節相互影響，共同參與了DR病程的進展，但背后具體的調控機制及其在發生過程中的先后順序目前尚不明確。circRNA廣泛存在視網膜中并參與各種眼底疾病的發生發展過程，但對其功能還知之甚少。目前對circRNA的研究主要集中在腫瘤領域，其中具有調控細胞增生作用的circ-ITCH及circHIPK3不僅在腫瘤的分子診斷、靶向治療及預后判斷上有光明的前景，同時也被發現參與了視網膜病變的病理過程[16, 30, 32-33]。circRNA在DR過程中的機制研究逐漸得到重視，其中circPDE4B、cZNF609不僅在視網膜呈特異性高表達，而且被證實參與了細胞增生調節和病理性新生血管形成過程，在DR的分子診斷及靶向治療方面具有重要的價值[14, 34]。總的來說，針對DR過程中circRNA發揮作用的研究，目前尤以circRNA對高葡萄糖應激內環境下視網膜微血管病變失調的影響最為集中，其他作用機制方面仍有待進一步探索。
現有的對于circRNA參與DR病理生理過程的研究也存在著一些局限與不足：（1）多數實驗僅建立在單一細胞系或實驗動物層面，特定的circRNA實際在人視網膜中的表達及DR病理過程中的變化不能明確；（2）從DR患者獲得的病理標本由于眼科學的特殊性，樣本量少且缺乏多中心的樣本，結果偏倚難以避免；（3）circRNA的提取、量化和分析方法以及平臺的不同，缺乏標準化，各研究之間難以比較；（4）多種與DR相關的circRNA被發現，相互之間缺乏聯系，隨著目標circRNA的增多，以circRNA為DR診斷生物學標志及治療靶標的對象選擇面臨挑戰；（5）目前研究主要集中于circRNA在調控視網膜微血管功能失調及炎癥反應過度激活中所起的作用，對于circRNA對DR神經退行性病變影響方面的研究依然缺乏。
未來，對circRNA在DR中的探索將深入闡明DR的病理生理過程，在視網膜微血管功能失調、炎癥反應尤其是應激狀態下神經退行性病變中circRNA所起的作用將進一步完善DR的發病機制。研究的進展及理論的更新有望使circRNA成為早期診斷DR的有效生物學標志，并為DR的精準治療提供嶄新的生物學靶點。