環狀RNA（circRNA）是一類通過反向剪接生成的新的內源性非編碼RNA，具有miRNA“海綿”、調節轉錄和剪接、調節蛋白之間的相互作用等功能。最近的研究表明，circRNA在視網膜微血管功能障礙、糖尿病視網膜病變、老年性黃斑變性、增生性玻璃體視網膜病變、高同型半胱氨酸血癥所致眼病和眼部惡性腫瘤等眼底疾病的發生和發展過程中發揮著重要作用。在病理狀態下，circRNA的差異性表達改變了相應基因的轉錄和翻譯，從而改變細胞的活性和功能。CircRNA可能成為眼底疾病新的標志物和預后指標，其靶向干預也可能成為眼底疾病潛在的治療方法。
引用本文： 王穎, 陳雪, 劉慶淮. 環狀RNA在眼底疾病中的研究進展. 中華眼底病雜志, 2022, 38(4): 334-339. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210218-00082 復制
環狀RNA（circRNA）是一種特殊類型的非編碼RNA，與傳統的線性RNA不同，circRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。CircRNA在動植物中表達高度保守，并在多種生物學功能中發揮重要作用[1]。CircRNA的發現與研究為非編碼RNA的探索打開了新大門。隨著研究的深入，circRNA在眼部發育及眼部病理過程中的作用及機制也在逐步顯現。現就circRNA在各種眼底疾病中的表達、調控作用研究進展作一綜述。
1 CircRNA的結構及特征
CircRNA是一種特殊類型的非編碼RNA，其結構較線性RNA穩定且高度保守，常呈現組織及發育階段特異性表達[2-4]，其可以與不同的功能蛋白結合，在不同的組織或發育階段發揮不同的作用。CircRNA通過反向剪接形成，在線性前體RNA下游3’剪接位點與上游5’剪接位點之間形成共價鍵，產生共價閉合環結構，其與線性RNA相比缺少3’端poly（A）尾巴和5’端帽結構[5]。因此，circRNA對核糖核酸酶R和一些核酸外切酶具有抵抗力[6]，半衰期比其對應的線性產物要長。
CircRNA有3種基本類型，分別為外顯子circRNA、內含子circRNA和外顯子-內含子circRNA（EIciRNAs）[7]。EIciRNA含量最豐富，占已知circRNA的80%[8]。其生物發生機制有3種：（1）內含子套索形成。內含子套索形成與外顯子跳躍有關，外顯子的3’端與同一外顯子（單外顯子circRNA）或上游外顯子（多外顯子circRNA）的5’端共價連接，切除內含子后形成circRNA。（2）內含子配對環化。內含子配對環化則是兩側翼的內含子通過堿基互補配對，形成環狀結構后內含子被剪去，從而形成circRNA[2]。（3）RNA結合蛋白（RBP）介導的環化。某些RBP特異性地結合到側翼內含子，使3’端和5’端靠近，從而成環[9]。通過這些模型，可對circRNA的形成進行更深入地了解，為進一步探索其功能及其與各種疾病間的聯系奠定基礎。
由外顯子環化而成的circRNA多存在于細胞質中[4]，可作為競爭性內源RNA調控基因表達[2]，而保留內含子的circRNA僅在細胞核中發現[10]。某些情況下，circRNA的豐度是相關的線性信使RNA（mRNA）的10倍[2]，并且可通過調節RNA聚合酶Ⅱ（RNA Pol Ⅱ）的活性來調節親本基因的表達[10]。CircRNA也受到轉錄因子的調節，如轉錄因子c-Myb和TWIST1可分別與circHIPK3和Cul2 circRNA的啟動子結合，使其表達上調[11]。
2 CircRNA的功能
為進一步明確circRNA在生物體內的作用，對其生物學功能和作用機制進行了廣泛的研究。CircRNA作為內源RNA調控miRNA活性。miRNA是一種非編碼RNA，引導效應蛋白Argonaute與編碼基因的mRNA結合，促進mRNA降解，以抑制其蛋白的產生[4]。在老年性黃斑變性（AMD）中，circNR3C1作為內源性miR-382-5p的“海綿”可抑制其活性，從而阻止疾病的進展并保護視網膜色素上皮（RPE）[12]。CircHIPK3可競爭性結合miR-30a-3p，抑制其活性，從而調節糖尿病誘導的視網膜血管功能障礙[13]。
2.1 EIciRNAs可促進轉錄
EIciRNAs位于細胞核中，與其親本基因的轉錄調控有關[14-15]。EIciRNAs在轉錄位點富集，通過與U1小核核糖核蛋白相互作用從而與RNA Pol Ⅱ結合，促進宿主基因轉錄[16]。研究表明，circEIF3J和circPAIP2的敲除分別導致EIF3J和PAIP2基因的轉錄水平降低[14]。
2.2 CircRNA可作為轉錄調節因子結合RBP
CircRNA-RBP相互作用是多種細胞活動調節的基礎，可使RBP從作用位點脫離，或充當RBP“海綿”來發揮作用[3]。人抗原R是一種通過與多種RNA結合來調節蛋白質表達模式的RBP，circPABPN1與人抗原R的結合影響其翻譯[17]。
2.3 CircRNA的產生可與經典的前體mRNA剪接競爭
由于大多數circRNA是由mRNA中的外顯子組成，因此其產生可能與線性mRNA存在競爭關系[14]。CircRNA可通過RNA Pol Ⅱ與線性剪接競爭。研究表明，RNA Pol Ⅱ的突變會導致circRNA的數量減少[18]。有研究發現，剪接因子muscleblind（MBL）的第二個外顯子在蒼蠅及人體中出現環化，且circMbl及其側翼內含子中含有可與MBL高效、特異性結合的位點，且MBL與由其自身RNA生成的circMbl強而特異地結合。外源性增加MBL表達刺激內源性MBL轉錄本產生circMbl[18]。
2.4 CircRNA可以調節蛋白質之間的相互作用
Circ Foxo3可連接細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）和依賴于細胞周期蛋白的激酶抑制劑1（p21）。正常情況下，CDK2與cyclin A和cyclin E相互作用，促進進入細胞周期，而p21則抑制這些相互作用，中止細胞周期的進展。CircFoxo3-p21-CDK2三元復合物的形成抑制了CDK2的功能，從而阻斷細胞周期的進行[19]。
2.5 具有內部核糖體進入位點（IRES）的circRNA
Chen等[20]構建了具有開放閱讀框架的EMCV-IRES元件（EMCV-ORF IRES），發現環狀EMCV-ORF IRES RNA指導了極長蛋白質的合成，他們在EMCV-ORF IRES的上游引入編碼蛋白酶凝血酶切割位點的序列，證明長多聚體蛋白分子的合成可能只發生在circRNA模板上。隨后的研究發現，一些具有IRES的內源性circRNA，如circZNF609和circMbl可被翻譯成蛋白質[21-22]。
2.6 RNA的N6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾可促進circRNA蛋白的翻譯
CircRNA中存在大量m6A修飾的位點，且單個位點就足以驅動circRNA蛋白質翻譯的啟動[23]。由FTO基因編碼的m6A去甲基酶FTO蛋白與circRNA共表達顯著降低了其豐度及其蛋白的表達，而共表達m6A甲基轉移酶METTL3/14顯著增加了circRNA的蛋白質翻譯，進一步證實circRNA的翻譯由m6A驅動[23]。
2.7 CircRNA可調控前體核糖體RNA（pre-rRNA）的成熟
CircANRIL與pre-rRNA有相似的莖環結構，通過與pescadillo同系物1的c端結構域相互作用，抑制核酸外切酶介導的核糖體RNA成熟。因此，circANRIL損害了核糖體的生物發生，導致P53的激活，繼而增加細胞凋亡，降低細胞的增生率[24]。以上研究推動對circRNA功能的認識從基因轉錄層面擴展到了蛋白質翻譯層面，為其進一步的研究奠定了基礎。
3 CircRNA與眼底疾病
越來越多的研究表明，與正常組織相比，circRNA在一些眼底疾病的病理組織及細胞中存在表達差異，其上調或沉默會影響多個細胞過程，從而調節細胞的生命活動，參與疾病的發生與發展。因此，研究circRNA對于了解眼底疾病的發病機制具有重大的意義，對其適當的調控及干預可能成為眼底疾病潛在的治療方法。
3.1 CircRNA與視網膜微血管功能障礙
視網膜微血管功能障礙通常與基因調節異常和內皮細胞功能障礙有關[25]。Boeckel等[26]發現，機體在缺氧情況下circRNA cZNF292可促進內皮細胞增生。Pan等[27]發現，在高糖環境下的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）中circ_0054633表達上調，可抑制miR-218表達，從而誘導環形交叉軸突導向受體同源物1和血紅素加氧酶-1表達上調，改善高糖環境下內皮細胞功能障礙。Dang等[28]發現，缺氧條件下的HUVEC中has_circ_0010729表達上調，通過靶向miR-186/缺氧誘導因子-1α對血管內皮細胞增生和凋亡發揮重要的調控作用。CircRNA cZNF609是內皮細胞中表達最豐富的10個circRNA之一[29]，可作為miR-615-5p“海綿”抑制其作用，miR-615-5p的上調導致肌細胞增強因子2A（MEF2A）過表達從而逆轉由cZNF609沉默介導的細胞遷移、細胞管形成和凋亡。cZNF609/miR-615-5p/MEF2A軸可調節視網膜血管丟失、病理性血管生成和炎癥反應[29]。Cheng等[30]發現，hsa_circ_0068087在高糖環境下的HUVEC中表達下調，其可作為miR-197“海綿”改善Toll樣受體4/核因子κB/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體 3信號通路介導的炎癥和內皮細胞功能障礙。干預circRNA的表達將為血管疾病的治療提供新的視角。
3.2 CircRNA與糖尿病視網膜病變（DR）
DR是糖尿病的常見并發癥，可導致視力損害和失明。DR以周細胞丟失、基底膜增厚、血管通透性增加和微動脈瘤形成等形態學改變為特征[29-30]。然而，它們的調控機制仍然鮮為人知。研究發現，周細胞中circRNA cPWWP2A的表達在糖尿病相關病變中上調，其過表達能保護周細胞免受高糖誘導的損傷，circRNA cPWWP2A通過“海綿化”miR-579與其靶基因（包括血管生成素1/occludin/SIRT1）相互作用影響周細胞覆蓋和血管完整性，揭示了cPWWP2A介導的信號在視網膜微血管功能障礙中的關鍵作用[31]。Shan等[13]研究發現，糖尿病患者視網膜內皮細胞中circHIPK3的表達水平顯著上調。在體外實驗中，circHIPK3的沉默或過表達影響視網膜內皮細胞的活力、增生、遷移和成管，而在體內沉默circHIPK3可減輕視網膜血管的功能障礙。CircHIPK3作為內源性miR-30a-3p“海綿”抑制其活性，導致血管內皮生長因子（VEGF）C、卷曲蛋白4基因和Wnt家族成員2表達增加，表明circHIPK3是控制DR的潛在靶點。Circ_0005015在DR患者的血漿、玻璃體和纖維血管膜中表達上調，作為miR-519d-3p“海綿”抑制其活性，導致基質金屬蛋白酶-2、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白和信號轉換器和轉錄因子激活因子3表達增加，從而調控內皮細胞的增生、遷移和細胞成管，促進視網膜內皮細胞的血管生成[32]。Zhu等[33]發現在DR患者的視網膜組織中，circDNMT3B mRNA表達下調，通過miR-20b-5p/BMP和激活素膜結合抑制劑通路導致視網膜微血管功能異常。在高糖刺激下的人視網膜微血管內皮細胞（hRMECs）中circCOL1A2增加，VEGF、MMP-2和MMP-9 mRNA表達上調，而miR-29b mRNA表達下降，沉默circCOL1A2后，可通過miR-29b表達增高抑制高糖誘導的hRMECs的增生、遷移、血管生成和血管通透性[34]。Jiang等[35]發現，circRNA cZNF532在糖尿病應激下的周細胞、糖尿病小鼠模型的視網膜血管和糖尿病患者的玻璃體中表達上調，其作為miR-29a-3p“海綿”，誘導硫酸軟骨素蛋白多糖4、賴氨酸氧化酶2和CDK2表達增加，從而調控周細胞生物學，誘導circRNA cZNF532或拮抗miR-29a-3p可成為治療DR的一種方法。在高糖孵育的ARPE-19細胞中，circRNA_0084043和hsa_circ_0041795表達升高，這些circRNA的缺失顯著提高了細胞存活率，抑制了高糖誘導的細胞凋亡。在機制上，circRNA_0084043的可能通過作為miR-140-3p“海綿”調節轉化生長因子α（TGF-α）來抑制高糖誘導的損傷，circRNA hsa_circ_0041795作為miR-646的“分子海綿”調節VEGFC的表達[36-37]。Wu等[38]通過測序和逆轉錄-定量聚合酶鏈反應實驗，發現增生型DR患者的circRNA hsa_circ_0001953水平明顯高于健康受試者組和非增生型DR患者組，其circRNA-miRNA靶向基因網絡表明，circRNA hsa_circ_0001953可與數十個miRNA相互作用，其中一些靶向mRNA可能參與糖尿病的發病機制。這說明全血中circRNA hsa_circ_0001953可能成為DR的一種新的診斷標志物和潛在的治療靶點。這些調控機制將為研究DR提供新的視角。
3.3 CircRNA與AMD
AMD占全球所有失明的8.7%，是發達國家最常見的致盲原因[39]。Chen等[12]研究發現，circNR3C1的表達隨著RPE的分化持續上調，而在功能障礙的RPE和AMD患者血清中表達下調。機制上，circNR3C1作為內源性miR-382-5p“海綿”可抑制其活性，增加10號染色體上的磷酸酶和張力蛋白同源物的表達，并抑制蛋白激酶B/哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白通路，從而阻止AMD的進展并保護RPE。該研究表明，circNR3C1可能成為治療萎縮型AMD的靶點[12]。脈絡膜新生血管（CNV）是導致嚴重視力喪失的主要原因，可見于多種眼科疾病，尤其是新生血管性AMD。Zhou等[40]在新生血管性AMD患者的臨床標本中檢測到circRNA cZBTB44異常表達，并發現在激光誘導的CNV小鼠模型和缺氧應激的內皮細胞中circRNA cZBTB44的表達顯著上調，沉默circRNA cZBTB44可降低內皮細胞的活力以及增生、遷移和管狀形成，circRNA CZBTB44作為miR-578“海綿”抑制其活性，導致VEGFA和血管細胞粘附分子-1（VCAM1）表達增加，為CNV的發病機制提供了新的見解，因此CZBTB44-miR-578-VEGFA/VCAM1軸可能成為治療新生血管相關疾病的新靶點。CircRNA hsa_circ_7329可能通過circRNA hsa-miR-9調節硬脂酰輔酶A去飽和酶，促進巨噬細胞介導的炎癥和病理性血管生成，從而導致AMD的發生[41]。這提示circRNA在AMD患者CNV的發病機制中起重要作用[42]。
3.4 CircRNA與增生性玻璃體視網膜病變（PVR）
PVR是視網膜脫離手術后的主要并發癥，也是眼內手術治療的瓶頸[43]。PVR患者玻璃體中血小板衍生生長因子-AA、TGF-α、VEGFA、白細胞介素（IL）-6、IL-8和腫瘤壞死因子-β的濃度顯著升高，預防PVR時應考慮這些因素[44]。Yao等[45]研究發現，circ_0043144在PVR患者的玻璃體和血清樣本中顯著上調，推測circ_0043144可能作為PVR患者預后和診斷的標記物。Circ_0043144沉默顯著降低了ARPE-19細胞的增生和遷移能力，且敲低circ_0043144后，ARPE-19細胞產生的C-C序列趨化因子配體2、C-X-C序列趨化因子配體8、IL-6和VEGFA明顯下降。在PVR中，circ_0043144上調可能促進細胞增生、遷移、細胞因子產生，導致PVR視網膜前膜形成。強調circ_0043144具有作為PVR患者診斷和預后標記物的價值以及監測PVR發展的潛力。
3.5 CircRNA與高同型半胱氨酸血癥（HHcy）所致眼病
同型半胱氨酸（Hcy）是蛋氨酸代謝過程中通過一碳代謝（蛋氨酸循環）產生的一種含硫非蛋白氨基酸。CBS基因突變是HHcy的病因之一[46]。Singh等[47]在CBS基因缺乏小鼠模型的眼球中發現了74個與對照組不同的circRNA，其中近27%表達下調，近73%表達上調，揭示HHcy可能通過改變靶基因調控元件的甲基化來擾亂細胞的代謝，并通過調節基因-mRNAs-miRNAs-circRNAs-蛋白質軸來影響基因產物水平和疾病表型。研究發現，HHcy破壞視網膜內皮細胞中的血視網膜屏障以及RPE細胞的結構和功能[48-49]，為由Hcy濃度升高引起的眼部疾病提供潛在的診斷指標和治療靶點[50]。
3.6 CircRNA與眼部惡性腫瘤
視網膜母細胞瘤（RB）占所有兒童癌癥的3%，是最常見的眼內惡性腫瘤[51]。Xing等[52]發現在RB組織和細胞系中hsa_circ_0001649的表達水平降低，其在細胞中具有腫瘤抑制作用，在組織中與腫瘤的侵襲性表型有關，預示預后不良。因此，增強circRNA hsa_circ_0001649的作用可能是RB潛在的治療策略。研究表明，在RB組織中TET1-has_circ_0093996和程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）表達水平下調[53]，認為TET1-has_circ_0093996的下調可能增加了未結合的miR-183，進而降低基因PDCD4的表達，因此，TET1-has_circ_0093996-miR183-PDCD4可能是RB發病過程中潛在的調節軸[54]。Fu等[55]發現circTET1通過“海綿化”miR-492/miR-494-3p使Wnt/β-catenin途徑失活，從而抑制RB的進展，為RB的治療提供了新的思路。與正常視網膜組織和RPE相比，circDHDDS在RB組織和細胞中高表達，其沉默抑制了細胞的增生、遷移和侵襲，從而抑制腫瘤的生長，circDHDDS作為miR-361-3p的分子海綿調控Wnt3a的表達通過影響RB細胞的增生、細胞周期、遷移和侵襲來影響RB的發育[56]。RB組織和細胞中circ_0000034和融合突觸蛋白17（STX17）水平升高，miR-361-3p水平降低，circ_0000034基因敲除可抑制RB細胞的增生、遷移、侵襲、自噬和腫瘤組織生長，并誘導細胞凋亡，故其基因敲除通過調節miR-361-3p/STX17軸抑制RB的發生和發展[57-58]，還可通過作為miR-361-3p的“分子海綿”作用于去整合素和金屬蛋白酶19加速RB的進展，提示circ_0000034可能是RB治療的靶點[59]。Circ_0000527在RB組織和細胞中均有高表達，其表達水平與分化程度和臨床TNM分期水平密切相關。Circ_0000527過表達促進了RB細胞的增生、遷移、侵襲并抑制細胞凋亡，circ_0000527直接靶向miR646，正向調節低密度脂蛋白受體相關蛋白6的表達，促進RB細胞的增生和轉移[60]。Circ_0000527還可通過作為miR646的“分子海綿”間接調控B淋巴細胞瘤-2，從而促進RB的發育[61]。Circ-0075804通過結合異源核糖核蛋白K來提高其宿主基因E2F3的穩定性，從而促進RB的增生，為RB的治療帶來了新的曙光[62]。
Yang等[63]發現，在葡萄膜黑色素瘤（UM）中hsa_circ_0119873的表達明顯上調，預測其靶點是RasGRP3基因。CircRNA hsa_circ_0133460的預測靶基因是DGKI基因，與circRNA RasGRP3結合并影響Ras信號通路[64]。該研究預測hsa_circ_0128533可與miR-145結合，miR-145過表達可抑制UM細胞增生，促進UM細胞凋亡[65]。因此，hsa_circ_0128533的靶基因可能是一個癌基因，通過靶向miR-145來阻止UM凋亡[65]。結膜黑色素瘤（CJM）是一種罕見但具有潛在致命性且高度復發的眼部癌癥，占眼部腫瘤的2%～5%和眼部原發性惡性黑色素瘤的5%～7%[66]。CircMTUS1的表達在CJM組織和細胞系中異常升高，在體外敲低可顯著抑制CJM的增生，在機制上，circMTUS1可作為miR-622和miR-1208的“分子海綿”調節腫瘤相關的信號通路[66]。這些研究表明，circRNA可作為黑色素瘤的一種新的標志物。
4 小結與展望
隨著實驗技術的發展，越來越多的研究揭示了circRNA的功能以及在各種疾病中的作用。在病理狀態下，circRNA的差異性表達改變了相應基因的轉錄和翻譯，從而改變細胞的活性和功能，在成為疾病診斷指標和治療靶點等方面有巨大的潛力，但其在臨床方面的應用還需要進一步研究。CircRNA可能成為眼底疾病新的標志物和預后指標，其靶向干預也可能成為眼底疾病潛在的治療方法。
環狀RNA（circRNA）是一種特殊類型的非編碼RNA，與傳統的線性RNA不同，circRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。CircRNA在動植物中表達高度保守，并在多種生物學功能中發揮重要作用[1]。CircRNA的發現與研究為非編碼RNA的探索打開了新大門。隨著研究的深入，circRNA在眼部發育及眼部病理過程中的作用及機制也在逐步顯現。現就circRNA在各種眼底疾病中的表達、調控作用研究進展作一綜述。
1 CircRNA的結構及特征
CircRNA是一種特殊類型的非編碼RNA，其結構較線性RNA穩定且高度保守，常呈現組織及發育階段特異性表達[2-4]，其可以與不同的功能蛋白結合，在不同的組織或發育階段發揮不同的作用。CircRNA通過反向剪接形成，在線性前體RNA下游3’剪接位點與上游5’剪接位點之間形成共價鍵，產生共價閉合環結構，其與線性RNA相比缺少3’端poly（A）尾巴和5’端帽結構[5]。因此，circRNA對核糖核酸酶R和一些核酸外切酶具有抵抗力[6]，半衰期比其對應的線性產物要長。
CircRNA有3種基本類型，分別為外顯子circRNA、內含子circRNA和外顯子-內含子circRNA（EIciRNAs）[7]。EIciRNA含量最豐富，占已知circRNA的80%[8]。其生物發生機制有3種：（1）內含子套索形成。內含子套索形成與外顯子跳躍有關，外顯子的3’端與同一外顯子（單外顯子circRNA）或上游外顯子（多外顯子circRNA）的5’端共價連接，切除內含子后形成circRNA。（2）內含子配對環化。內含子配對環化則是兩側翼的內含子通過堿基互補配對，形成環狀結構后內含子被剪去，從而形成circRNA[2]。（3）RNA結合蛋白（RBP）介導的環化。某些RBP特異性地結合到側翼內含子，使3’端和5’端靠近，從而成環[9]。通過這些模型，可對circRNA的形成進行更深入地了解，為進一步探索其功能及其與各種疾病間的聯系奠定基礎。
由外顯子環化而成的circRNA多存在于細胞質中[4]，可作為競爭性內源RNA調控基因表達[2]，而保留內含子的circRNA僅在細胞核中發現[10]。某些情況下，circRNA的豐度是相關的線性信使RNA（mRNA）的10倍[2]，并且可通過調節RNA聚合酶Ⅱ（RNA Pol Ⅱ）的活性來調節親本基因的表達[10]。CircRNA也受到轉錄因子的調節，如轉錄因子c-Myb和TWIST1可分別與circHIPK3和Cul2 circRNA的啟動子結合，使其表達上調[11]。
2 CircRNA的功能
為進一步明確circRNA在生物體內的作用，對其生物學功能和作用機制進行了廣泛的研究。CircRNA作為內源RNA調控miRNA活性。miRNA是一種非編碼RNA，引導效應蛋白Argonaute與編碼基因的mRNA結合，促進mRNA降解，以抑制其蛋白的產生[4]。在老年性黃斑變性（AMD）中，circNR3C1作為內源性miR-382-5p的“海綿”可抑制其活性，從而阻止疾病的進展并保護視網膜色素上皮（RPE）[12]。CircHIPK3可競爭性結合miR-30a-3p，抑制其活性，從而調節糖尿病誘導的視網膜血管功能障礙[13]。
2.1 EIciRNAs可促進轉錄
EIciRNAs位于細胞核中，與其親本基因的轉錄調控有關[14-15]。EIciRNAs在轉錄位點富集，通過與U1小核核糖核蛋白相互作用從而與RNA Pol Ⅱ結合，促進宿主基因轉錄[16]。研究表明，circEIF3J和circPAIP2的敲除分別導致EIF3J和PAIP2基因的轉錄水平降低[14]。
2.2 CircRNA可作為轉錄調節因子結合RBP
CircRNA-RBP相互作用是多種細胞活動調節的基礎，可使RBP從作用位點脫離，或充當RBP“海綿”來發揮作用[3]。人抗原R是一種通過與多種RNA結合來調節蛋白質表達模式的RBP，circPABPN1與人抗原R的結合影響其翻譯[17]。
2.3 CircRNA的產生可與經典的前體mRNA剪接競爭
由于大多數circRNA是由mRNA中的外顯子組成，因此其產生可能與線性mRNA存在競爭關系[14]。CircRNA可通過RNA Pol Ⅱ與線性剪接競爭。研究表明，RNA Pol Ⅱ的突變會導致circRNA的數量減少[18]。有研究發現，剪接因子muscleblind（MBL）的第二個外顯子在蒼蠅及人體中出現環化，且circMbl及其側翼內含子中含有可與MBL高效、特異性結合的位點，且MBL與由其自身RNA生成的circMbl強而特異地結合。外源性增加MBL表達刺激內源性MBL轉錄本產生circMbl[18]。
2.4 CircRNA可以調節蛋白質之間的相互作用
Circ Foxo3可連接細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）和依賴于細胞周期蛋白的激酶抑制劑1（p21）。正常情況下，CDK2與cyclin A和cyclin E相互作用，促進進入細胞周期，而p21則抑制這些相互作用，中止細胞周期的進展。CircFoxo3-p21-CDK2三元復合物的形成抑制了CDK2的功能，從而阻斷細胞周期的進行[19]。
2.5 具有內部核糖體進入位點（IRES）的circRNA
Chen等[20]構建了具有開放閱讀框架的EMCV-IRES元件（EMCV-ORF IRES），發現環狀EMCV-ORF IRES RNA指導了極長蛋白質的合成，他們在EMCV-ORF IRES的上游引入編碼蛋白酶凝血酶切割位點的序列，證明長多聚體蛋白分子的合成可能只發生在circRNA模板上。隨后的研究發現，一些具有IRES的內源性circRNA，如circZNF609和circMbl可被翻譯成蛋白質[21-22]。
2.6 RNA的N6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾可促進circRNA蛋白的翻譯
CircRNA中存在大量m6A修飾的位點，且單個位點就足以驅動circRNA蛋白質翻譯的啟動[23]。由FTO基因編碼的m6A去甲基酶FTO蛋白與circRNA共表達顯著降低了其豐度及其蛋白的表達，而共表達m6A甲基轉移酶METTL3/14顯著增加了circRNA的蛋白質翻譯，進一步證實circRNA的翻譯由m6A驅動[23]。
2.7 CircRNA可調控前體核糖體RNA（pre-rRNA）的成熟
CircANRIL與pre-rRNA有相似的莖環結構，通過與pescadillo同系物1的c端結構域相互作用，抑制核酸外切酶介導的核糖體RNA成熟。因此，circANRIL損害了核糖體的生物發生，導致P53的激活，繼而增加細胞凋亡，降低細胞的增生率[24]。以上研究推動對circRNA功能的認識從基因轉錄層面擴展到了蛋白質翻譯層面，為其進一步的研究奠定了基礎。
3 CircRNA與眼底疾病
越來越多的研究表明，與正常組織相比，circRNA在一些眼底疾病的病理組織及細胞中存在表達差異，其上調或沉默會影響多個細胞過程，從而調節細胞的生命活動，參與疾病的發生與發展。因此，研究circRNA對于了解眼底疾病的發病機制具有重大的意義，對其適當的調控及干預可能成為眼底疾病潛在的治療方法。
3.1 CircRNA與視網膜微血管功能障礙
視網膜微血管功能障礙通常與基因調節異常和內皮細胞功能障礙有關[25]。Boeckel等[26]發現，機體在缺氧情況下circRNA cZNF292可促進內皮細胞增生。Pan等[27]發現，在高糖環境下的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）中circ_0054633表達上調，可抑制miR-218表達，從而誘導環形交叉軸突導向受體同源物1和血紅素加氧酶-1表達上調，改善高糖環境下內皮細胞功能障礙。Dang等[28]發現，缺氧條件下的HUVEC中has_circ_0010729表達上調，通過靶向miR-186/缺氧誘導因子-1α對血管內皮細胞增生和凋亡發揮重要的調控作用。CircRNA cZNF609是內皮細胞中表達最豐富的10個circRNA之一[29]，可作為miR-615-5p“海綿”抑制其作用，miR-615-5p的上調導致肌細胞增強因子2A（MEF2A）過表達從而逆轉由cZNF609沉默介導的細胞遷移、細胞管形成和凋亡。cZNF609/miR-615-5p/MEF2A軸可調節視網膜血管丟失、病理性血管生成和炎癥反應[29]。Cheng等[30]發現，hsa_circ_0068087在高糖環境下的HUVEC中表達下調，其可作為miR-197“海綿”改善Toll樣受體4/核因子κB/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體 3信號通路介導的炎癥和內皮細胞功能障礙。干預circRNA的表達將為血管疾病的治療提供新的視角。
3.2 CircRNA與糖尿病視網膜病變（DR）
DR是糖尿病的常見并發癥，可導致視力損害和失明。DR以周細胞丟失、基底膜增厚、血管通透性增加和微動脈瘤形成等形態學改變為特征[29-30]。然而，它們的調控機制仍然鮮為人知。研究發現，周細胞中circRNA cPWWP2A的表達在糖尿病相關病變中上調，其過表達能保護周細胞免受高糖誘導的損傷，circRNA cPWWP2A通過“海綿化”miR-579與其靶基因（包括血管生成素1/occludin/SIRT1）相互作用影響周細胞覆蓋和血管完整性，揭示了cPWWP2A介導的信號在視網膜微血管功能障礙中的關鍵作用[31]。Shan等[13]研究發現，糖尿病患者視網膜內皮細胞中circHIPK3的表達水平顯著上調。在體外實驗中，circHIPK3的沉默或過表達影響視網膜內皮細胞的活力、增生、遷移和成管，而在體內沉默circHIPK3可減輕視網膜血管的功能障礙。CircHIPK3作為內源性miR-30a-3p“海綿”抑制其活性，導致血管內皮生長因子（VEGF）C、卷曲蛋白4基因和Wnt家族成員2表達增加，表明circHIPK3是控制DR的潛在靶點。Circ_0005015在DR患者的血漿、玻璃體和纖維血管膜中表達上調，作為miR-519d-3p“海綿”抑制其活性，導致基質金屬蛋白酶-2、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白和信號轉換器和轉錄因子激活因子3表達增加，從而調控內皮細胞的增生、遷移和細胞成管，促進視網膜內皮細胞的血管生成[32]。Zhu等[33]發現在DR患者的視網膜組織中，circDNMT3B mRNA表達下調，通過miR-20b-5p/BMP和激活素膜結合抑制劑通路導致視網膜微血管功能異常。在高糖刺激下的人視網膜微血管內皮細胞（hRMECs）中circCOL1A2增加，VEGF、MMP-2和MMP-9 mRNA表達上調，而miR-29b mRNA表達下降，沉默circCOL1A2后，可通過miR-29b表達增高抑制高糖誘導的hRMECs的增生、遷移、血管生成和血管通透性[34]。Jiang等[35]發現，circRNA cZNF532在糖尿病應激下的周細胞、糖尿病小鼠模型的視網膜血管和糖尿病患者的玻璃體中表達上調，其作為miR-29a-3p“海綿”，誘導硫酸軟骨素蛋白多糖4、賴氨酸氧化酶2和CDK2表達增加，從而調控周細胞生物學，誘導circRNA cZNF532或拮抗miR-29a-3p可成為治療DR的一種方法。在高糖孵育的ARPE-19細胞中，circRNA_0084043和hsa_circ_0041795表達升高，這些circRNA的缺失顯著提高了細胞存活率，抑制了高糖誘導的細胞凋亡。在機制上，circRNA_0084043的可能通過作為miR-140-3p“海綿”調節轉化生長因子α（TGF-α）來抑制高糖誘導的損傷，circRNA hsa_circ_0041795作為miR-646的“分子海綿”調節VEGFC的表達[36-37]。Wu等[38]通過測序和逆轉錄-定量聚合酶鏈反應實驗，發現增生型DR患者的circRNA hsa_circ_0001953水平明顯高于健康受試者組和非增生型DR患者組，其circRNA-miRNA靶向基因網絡表明，circRNA hsa_circ_0001953可與數十個miRNA相互作用，其中一些靶向mRNA可能參與糖尿病的發病機制。這說明全血中circRNA hsa_circ_0001953可能成為DR的一種新的診斷標志物和潛在的治療靶點。這些調控機制將為研究DR提供新的視角。
3.3 CircRNA與AMD
AMD占全球所有失明的8.7%，是發達國家最常見的致盲原因[39]。Chen等[12]研究發現，circNR3C1的表達隨著RPE的分化持續上調，而在功能障礙的RPE和AMD患者血清中表達下調。機制上，circNR3C1作為內源性miR-382-5p“海綿”可抑制其活性，增加10號染色體上的磷酸酶和張力蛋白同源物的表達，并抑制蛋白激酶B/哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白通路，從而阻止AMD的進展并保護RPE。該研究表明，circNR3C1可能成為治療萎縮型AMD的靶點[12]。脈絡膜新生血管（CNV）是導致嚴重視力喪失的主要原因，可見于多種眼科疾病，尤其是新生血管性AMD。Zhou等[40]在新生血管性AMD患者的臨床標本中檢測到circRNA cZBTB44異常表達，并發現在激光誘導的CNV小鼠模型和缺氧應激的內皮細胞中circRNA cZBTB44的表達顯著上調，沉默circRNA cZBTB44可降低內皮細胞的活力以及增生、遷移和管狀形成，circRNA CZBTB44作為miR-578“海綿”抑制其活性，導致VEGFA和血管細胞粘附分子-1（VCAM1）表達增加，為CNV的發病機制提供了新的見解，因此CZBTB44-miR-578-VEGFA/VCAM1軸可能成為治療新生血管相關疾病的新靶點。CircRNA hsa_circ_7329可能通過circRNA hsa-miR-9調節硬脂酰輔酶A去飽和酶，促進巨噬細胞介導的炎癥和病理性血管生成，從而導致AMD的發生[41]。這提示circRNA在AMD患者CNV的發病機制中起重要作用[42]。
3.4 CircRNA與增生性玻璃體視網膜病變（PVR）
PVR是視網膜脫離手術后的主要并發癥，也是眼內手術治療的瓶頸[43]。PVR患者玻璃體中血小板衍生生長因子-AA、TGF-α、VEGFA、白細胞介素（IL）-6、IL-8和腫瘤壞死因子-β的濃度顯著升高，預防PVR時應考慮這些因素[44]。Yao等[45]研究發現，circ_0043144在PVR患者的玻璃體和血清樣本中顯著上調，推測circ_0043144可能作為PVR患者預后和診斷的標記物。Circ_0043144沉默顯著降低了ARPE-19細胞的增生和遷移能力，且敲低circ_0043144后，ARPE-19細胞產生的C-C序列趨化因子配體2、C-X-C序列趨化因子配體8、IL-6和VEGFA明顯下降。在PVR中，circ_0043144上調可能促進細胞增生、遷移、細胞因子產生，導致PVR視網膜前膜形成。強調circ_0043144具有作為PVR患者診斷和預后標記物的價值以及監測PVR發展的潛力。
3.5 CircRNA與高同型半胱氨酸血癥（HHcy）所致眼病
同型半胱氨酸（Hcy）是蛋氨酸代謝過程中通過一碳代謝（蛋氨酸循環）產生的一種含硫非蛋白氨基酸。CBS基因突變是HHcy的病因之一[46]。Singh等[47]在CBS基因缺乏小鼠模型的眼球中發現了74個與對照組不同的circRNA，其中近27%表達下調，近73%表達上調，揭示HHcy可能通過改變靶基因調控元件的甲基化來擾亂細胞的代謝，并通過調節基因-mRNAs-miRNAs-circRNAs-蛋白質軸來影響基因產物水平和疾病表型。研究發現，HHcy破壞視網膜內皮細胞中的血視網膜屏障以及RPE細胞的結構和功能[48-49]，為由Hcy濃度升高引起的眼部疾病提供潛在的診斷指標和治療靶點[50]。
3.6 CircRNA與眼部惡性腫瘤
視網膜母細胞瘤（RB）占所有兒童癌癥的3%，是最常見的眼內惡性腫瘤[51]。Xing等[52]發現在RB組織和細胞系中hsa_circ_0001649的表達水平降低，其在細胞中具有腫瘤抑制作用，在組織中與腫瘤的侵襲性表型有關，預示預后不良。因此，增強circRNA hsa_circ_0001649的作用可能是RB潛在的治療策略。研究表明，在RB組織中TET1-has_circ_0093996和程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）表達水平下調[53]，認為TET1-has_circ_0093996的下調可能增加了未結合的miR-183，進而降低基因PDCD4的表達，因此，TET1-has_circ_0093996-miR183-PDCD4可能是RB發病過程中潛在的調節軸[54]。Fu等[55]發現circTET1通過“海綿化”miR-492/miR-494-3p使Wnt/β-catenin途徑失活，從而抑制RB的進展，為RB的治療提供了新的思路。與正常視網膜組織和RPE相比，circDHDDS在RB組織和細胞中高表達，其沉默抑制了細胞的增生、遷移和侵襲，從而抑制腫瘤的生長，circDHDDS作為miR-361-3p的分子海綿調控Wnt3a的表達通過影響RB細胞的增生、細胞周期、遷移和侵襲來影響RB的發育[56]。RB組織和細胞中circ_0000034和融合突觸蛋白17（STX17）水平升高，miR-361-3p水平降低，circ_0000034基因敲除可抑制RB細胞的增生、遷移、侵襲、自噬和腫瘤組織生長，并誘導細胞凋亡，故其基因敲除通過調節miR-361-3p/STX17軸抑制RB的發生和發展[57-58]，還可通過作為miR-361-3p的“分子海綿”作用于去整合素和金屬蛋白酶19加速RB的進展，提示circ_0000034可能是RB治療的靶點[59]。Circ_0000527在RB組織和細胞中均有高表達，其表達水平與分化程度和臨床TNM分期水平密切相關。Circ_0000527過表達促進了RB細胞的增生、遷移、侵襲并抑制細胞凋亡，circ_0000527直接靶向miR646，正向調節低密度脂蛋白受體相關蛋白6的表達，促進RB細胞的增生和轉移[60]。Circ_0000527還可通過作為miR646的“分子海綿”間接調控B淋巴細胞瘤-2，從而促進RB的發育[61]。Circ-0075804通過結合異源核糖核蛋白K來提高其宿主基因E2F3的穩定性，從而促進RB的增生，為RB的治療帶來了新的曙光[62]。
Yang等[63]發現，在葡萄膜黑色素瘤（UM）中hsa_circ_0119873的表達明顯上調，預測其靶點是RasGRP3基因。CircRNA hsa_circ_0133460的預測靶基因是DGKI基因，與circRNA RasGRP3結合并影響Ras信號通路[64]。該研究預測hsa_circ_0128533可與miR-145結合，miR-145過表達可抑制UM細胞增生，促進UM細胞凋亡[65]。因此，hsa_circ_0128533的靶基因可能是一個癌基因，通過靶向miR-145來阻止UM凋亡[65]。結膜黑色素瘤（CJM）是一種罕見但具有潛在致命性且高度復發的眼部癌癥，占眼部腫瘤的2%～5%和眼部原發性惡性黑色素瘤的5%～7%[66]。CircMTUS1的表達在CJM組織和細胞系中異常升高，在體外敲低可顯著抑制CJM的增生，在機制上，circMTUS1可作為miR-622和miR-1208的“分子海綿”調節腫瘤相關的信號通路[66]。這些研究表明，circRNA可作為黑色素瘤的一種新的標志物。
4 小結與展望
隨著實驗技術的發展，越來越多的研究揭示了circRNA的功能以及在各種疾病中的作用。在病理狀態下，circRNA的差異性表達改變了相應基因的轉錄和翻譯，從而改變細胞的活性和功能，在成為疾病診斷指標和治療靶點等方面有巨大的潛力，但其在臨床方面的應用還需要進一步研究。CircRNA可能成為眼底疾病新的標志物和預后指標，其靶向干預也可能成為眼底疾病潛在的治療方法。