Leber遺傳性視神經病變（LHON）是一種由線粒體DNA突變引起的致盲性疾病，是研究線粒體異常的經典疾病模型，其主要突變位點為m11778G.A、m.3460G.A和m.14484T.C。LHON細胞模型主要通過淋巴母細胞、成纖維細胞、細胞雜種和誘導多能干細胞等產生，LHON動物模型主要通過魚藤酮和ND4突變體誘導小鼠產生。盡管對于LHON模型的研究已取得不錯成果，但構建理想的實驗模型仍存在較多困難，嚴重限制了對LHON發病機制和治療藥物的探索。詳盡了解現有模型在LHON中的應用及特征，有助于完善實驗設計和構建新模型。
引用本文： 楊雪瑩, 陳長征. Leber遺傳性視神經病變的細胞及動物模型應用研究進展. 中華眼底病雜志, 2021, 37(10): 825-830. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210207-00073 復制
Leber遺傳性視神經病變（LHON）是一種最常見的線粒體疾病，由線粒體DNA（mtDNA）點突變引起，發病年齡為20～30歲，以年輕男性為多見。由于視網膜神經節細胞（RGC）丟失，視神經和視網膜萎縮，LHON患者會出現不同程度的中心視力下降和視野缺損，表現為單眼無痛性視力喪失，對側眼視力也在數月內急劇下降[1-2]。野生型和突變型mtDNA比例以及個體組織間差異會極大影響LHON的嚴重程度，而吸煙、抗逆轉錄病毒藥物和有機溶劑等因素會影響疾病的表型[3-4]。因為LHON患者的RGC不能直接用于動物實驗，所以建立合適的動物實驗模型對研究LHON的發病機制、基因型-表型相關性、易感性因素和治療藥物尤為重要[2]。而目前國內關于LHON實驗模型的研究不多[5]。現就LHON的細胞、動物模型及最新研究進展作一綜述，以期為實驗研究提供參考。
1 細胞模型
目前針對上述LHON發病機制，國內外學者提出很多細胞模型方法，其中淋巴母細胞、成纖維細胞、細胞雜種和誘導多能干細胞（iPSC）是LHON研究中使用最廣泛的細胞模型。
1.1 淋巴母細胞
淋巴母細胞由原代B淋巴細胞感染人類皰疹病毒4型（Epstein-Barr病毒）產生，其特點為永生性，即在人體外可快速增生且長期存活[2,6]。通過單份人體外周血樣本即可獲得大量實驗材料，便于對mtDNA做定性和定量分析。
Van Bergen等[7]發現，在無葡萄糖的半乳糖培養基上，LHON淋巴母細胞的生長速率比對照組慢2.35倍，提示LHON的發病機制可能為線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ驅動合成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）減少。Falabella等[8]在相同培養基上培育LHON患者的淋巴母細胞，發現培養基中活性氧（ROS）和亞硝酸鹽濃度產生均增加，提示LHON患者的淋巴母細胞對氧化和亞硝化產物刺激較敏感，過多暴露于一氧化氮會使細胞上的線粒體儲存能力降低，導致細胞功能障礙。Brown等[9]對攜帶m11778G＞A、m.3460G＞A和m.14484T＞C位點mtDNA突變的淋巴母細胞進行線粒體功能分析，結果顯示m11778G＞A、m.3460G＞A位點突變導致嚴重的線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ缺陷，而m.14484T＞C位點突變導致的線粒體功能障礙較輕。對于LHON基因型-表型的研究表明，核修飾基因會增加mtDNA突變的概率[10]。Jiang等[11]使用m11778G＞A位點突變的淋巴母細胞與無突變細胞相比，確定了LHON的第一個核修飾基因YARS2，它會影響mtDNA突變的表型，突變的YARS2基因會加劇與m.11778G> A位點突變相關的線粒體功能障礙。該研究同時探索了LHON男性患病率高的原因，其將LHON淋巴母細胞置于含有睪酮的細胞培養基中，發現與對照組相比，在含有睪酮的培養基中孵育的細胞凋亡數量增多，自噬標記物減少[12]。這提示睪酮能促進LHON淋巴母細胞凋亡，影響正常的自噬功能，導致有缺陷的線粒體積聚，正常線粒體數量減少，產能降低。
淋巴母細胞快速增生，可快速獲得大樣本量的特性，為實驗研究提供了一種經濟高效的細胞模型。但是，建立淋巴細胞系的永生化過程會影響細胞代謝，且在傳代過程中，細胞的基因表達會發生變化[13]。此外，淋巴母細胞對溫度、酸堿度、培養基、可能存在的培養基污染和培養時間等因素較為敏感[2]。在選擇淋巴母細胞作為模型時要考慮上述因素的影響。
1.2 成纖維細胞
成纖維細胞是一種間充質細胞，在組織發育以及維持和修復過程中起重要作用，能反映累積的細胞損傷和突變，主要通過微創皮膚活檢獲得[14]。
有研究發現，LHON患者、m11778G＞A位點突變攜帶者和正常個體的成纖維細胞的線粒體蛋白質存在差異，主要分為生物能途徑相關蛋白和質量控制系統相關蛋白兩類[15]。這提示LHON發病機制可能與生物能紊亂和蛋白質質量控制系統障礙有關。Zhou等[16]發現，LHON成纖維細胞的ROS顯著增加，谷胱甘肽化的蛋白質增加，其中僅27%的蛋白質來自線粒體，其余來自高爾基體、細胞核和溶酶體等。這提示線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ缺陷引起的氧化應激會促進蛋白質的谷胱甘肽化，累及細胞的各個細胞器，同時通過抗氧化作用能靶向減少蛋白質的谷胱甘肽化，從而治療LHON。成纖維細胞在研究LHON與其他疾病并存的分子機制中也有應用。Uittenbogaard等[17]比較LHON（m11778G＞A突變）和多發性硬化患者的成纖維細胞發現，前者細胞的基礎呼吸速率降低55％，線粒體嵴的超微結構被破壞，氧化磷酸化（OXPHOS）途徑被抑制，提示m11778G＞A位點突變通過改變OXPHOS和糖酵解之間的動態作用來損害細胞的代謝調控。還有研究表明，與僅攜帶m11778G＞A位點突變或m.14484T＞C位點突變者相比，攜帶兩種突變者的成纖維細胞中線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ的功能損害更嚴重[18]。
Giordano等[3]將LHON成纖維細胞與香煙煙霧冷凝物共同孵育以探索LHON的易感性因素，發現無論是LHON患者、攜帶者，還是正常人，其成纖維細胞的mtDNA拷貝數均顯著降低，ATP合成能力和細胞呼吸能力均下降。這提示吸煙削弱了線粒體生物發生和維持mtDNA拷貝數的補償能力，同時吸煙與LHON外顯率高度相關。
對于LHON的治療，Yu-Wai-Man等[19]將艾地苯醌和不同類型的輔酶Q加入4個LHON成纖維細胞系發現，艾地苯醌可通過提高線粒體呼吸鏈的電子傳遞效率對OXPHOS產生積極影響，且不同細胞系對艾地苯醌反應具有特異性。這也解釋了在臨床試驗中，不同患者口服艾地苯醌后視力變化和并發癥嚴重程度存在差異的原因。Chao de la Barca等[20]分析LHON成纖維細胞的代謝產物發現，所有種類的氨基酸濃度降低，部分鞘磷脂濃度降低。因為內質網（ER）是細胞產生蛋白質和氨基酸的主要部位，提示LHON可能與ER應激有關，為研究ER靶向藥物提供了理論基礎。
成纖維細胞有易培養、無需傳代以及在細胞水平可永久保持生物學特性等優勢，廣泛應用于線粒體蛋白質分析和治療藥物的研究[1-2,21]。其主要缺點主要有：（1）使用成纖維細胞模型可能不能反映線粒體調節的特異性，如線粒體在神經組織，特別是視神經中的致病機制；（2）經皮膚活檢取材后，需培育幾周才能獲得足夠樣本量[1]。
1.3 細胞雜種
細胞雜種，即胞質雜交細胞，它是由提供細胞核和線粒體的細胞融合而成的真核細胞系，通常使用無mtDNA（ρ0）的未成熟細胞與突變mtDNA雜交產生（將mtDNA注入未成熟細胞雜交成新細胞）[2, 22]。這種模型產生了核基因相同的雜交細胞系，在研究mtDNA突變的致病影響、mtDNA與表型的關系以及mtDNA與核DNA相容性中應用普遍[21,23-24]。
對于LHON的發病機制，Zhang等[25]將ρ0細胞與LHON患者（m.3635G> A突變）的mtDNA融合發現，雜交細胞的線粒體功能障礙，ATP合成效率降低，ROS增多。這提示m.3635G> A是LHON mtDNA的突變位點。有研究證實，另1個突變位點m.12338T> C也與LHON相關，含突變mtDNA的細胞雜種線粒體數量減少，復合體Ⅰ活性降低，ATP減少，細胞凋亡數量增加[26]。Ji等[24]發現，同時攜帶m.3394T> C和m.11778G> A突變基因與只攜帶m.11778G> A突變基因的細胞雜種相比，復合體Ⅰ的結構不穩定性更高，活性更低。進一步的研究結果顯示，攜帶m.3866T> C和m.11778G> A突變的細胞雜種線粒體功能損害也更嚴重[27]。這提示兩種mtDNA突變的協同作用會加重LHON線粒體的功能障礙。Sharma等[28]發現，LHON雜交細胞通過激活自噬清除受損的線粒體，提高細胞存活率，說明線粒體的自噬激活既是LHON的保護機制，又是一種新的治療方式。Zhang等[29]在352例m.15927G>A突變患者中發現，8例患者存在轉運RNAThr基因，將其突變mtDNA的細胞雜種與對照組比較發現，線粒體翻譯功能受損，復合Ⅰ和Ⅲ活性降低，ATP產量減少，ROS增加。這提示m.15927G>A突變可能改變了RGC的tRNA結構和功能，破壞線粒體的翻譯和呼吸，從而導致LHON。
對于LHON基因型和表型，早期研究發現不同的mtDNA單倍體會影響LHON的外顯率[30]。Caporali等[31]觀察含有兩種突變mtDNA的細胞雜種發現，即使不是三種最常見的位點突變，mtDNA其他位點的突變組合也可能導致OXPHOS效率降低，LHON外顯率增加。這提示LHON的突變位點可能不存在“致病性”和“非致病性”的區別，是否致病或外顯主要取決于基因組突變的特定組合。不同的環境因素也會導致表型差異，López-Gallardo等[32]比較了來源于食物的復合物Ⅰ抑制物（魚藤酮、辣椒素和羅尼司它丁-1）對LHON細胞雜種的影響，結果顯示含有m.3460G> A突變mtDNA的細胞雜種對魚藤酮有較強抵抗力，但對辣椒素和羅尼司它丁-1較敏感。所以，食物中某些異源性物質可以改變LHON的外顯率，研究LHON的發病機制時必須考慮到基因與環境之間的相互作用。還有研究在LHON雜交細胞培養基中加入最常用的眼藥水防腐劑苯扎氯銨，發現其線粒體氧耗降低，ATP產量下降，提示苯扎氯銨會抑制線粒體的功能，LHON患者不宜使用含苯扎氯銨的眼藥水[33]。
對于LHON的治療，Emperador等[34]將攜帶不同mtDNA突變的細胞雜種置于含有酮體的培養基中發現，細胞與生酮共培養可以降低LHON異質性突變的百分比，增加同質性突變的mtDNA水平，提示生酮飲食可能是治療LHON的新方法。關于LHON男女患病率的差異，有學者認為雌激素的保護作用降低了女性患病率。Pisano等[35]將m.11778G> A突變的雜交細胞和雌激素混合培養發現，雌激素通過結合β受體激活線粒體的生物發生，降低氧化應激反應，啟動細胞的補償作用。這提示靶向介導雌激素β受體可作為突變攜帶者的一種預防性治療手段。
盡管細胞雜種模型在LHON研究中應用廣泛，但仍存在以下缺陷：（1）由于ρ0細胞的未成熟性，所以其核基因的遺傳背景不穩定；（2）細胞雜交是一個多階段的復雜過程，這些過程可能導致細胞應激以及基因表達改變；（3）檢驗是否融合成功的步驟也較為繁瑣[2]。
1.4 iPSC
iPSC-RGC模型是一種新興細胞模型。2006年科學家首次發明誘導iPSC技術，主要通過含有轉錄因子的質粒或病毒載體誘導體細胞產生iPSC，也稱為iPSC的重編程[36]。iPSC通常由成纖維細胞和外周血細胞產生，其優勢在于：（1）具有與研究疾病相同的細胞類型；（2）無限增生性；（3）多向分化的潛力[36-37]。
為了驗證iPSC技術研究線粒體疾病的可行性，Hung等[38]研究了LHON中不同mtDNA突變引起的線粒體呼吸缺陷對iPSC重編程的影響，結果顯示復合體Ⅰ突變引起的線粒體呼吸缺陷僅輕度降低了重編程效率，并且未改變線粒體生物發生的基因表達。Lu等[39]使用仙臺病毒載體誘導LHON患者的單核細胞生成iPSC系（TVGH-iPSC-010-09），該細胞系含有m.11778G> A突變的mtDNA，且有分化為內、中和外胚層細胞的潛力，為疾病研究提供了一種體外實驗模型。Peron等[40]也使用相同方法產生攜帶m.3460G> A突變的iPSC系（FINCBi001-A）。Yang等[41]首次使用LHON患者的特異性iPSC分化出RGC（LHON-RGC），與正常RGC比較發現，LHON-RGC的α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸（AMPA）受體的蛋白表達水平下降，提示AMPA受體與LHON發病機制有關。為了研究LHON外顯率的差異，Wu等[42]將LHON患者和突變基因攜帶者iPSC分化的RGC比較，LHON-RGC的軸突結構明顯萎縮，軸突數量減少，轉錄生成的信使RNA減少。Yang等[43]發現，與突變基因攜帶者和正常人iPSC分化的RGC相比，LHON-RGC凋亡增加，ROS增加，逆行運動的線粒體數量增加，這種線粒體運動模式的改變可能與驅動蛋白5A的表達下降有關。這提示LHON外顯率差異是RGC氧化應激水平，線粒體運動模式和凋亡程度不同造成的。對于LHON的治療，Yang等[44]發現3D納米支架能促進iPSC分化的RGC軸突生長，增強RGC定向生長的能力，提高RGC的活性。這提示iPSC對研究LHON新的治療方式有重要前景。
與成纖維細胞和外周血細胞相比，iPSC是一種更能代表LHON突變特點的細胞模型，但也存在一些缺點：（1）價格昂貴；（2）耗時長，產生iPSC系至少需要3個月以上；（3）效率低，iPSC分化的部分RGC不包含突變的mtDNA；（4）分化的細胞類型有限[2,45]。
2 動物模型
雖然在LHON研究中細胞模型應用更廣泛，但動物模型對探究LHON發病機制和治療藥物也有重要意義。由于技術的限制，獲取線粒體疾病的動物模型比較困難，目前也在進行持續研究[2]。
2002年，Zhang等[46]在小鼠玻璃體腔內注射魚藤酮，導致視網膜節細胞層和內叢狀層中神經元的損傷，這些位于視網膜中央的損傷與LHON患者視網膜病理切片相同，建立了第一個由線粒體功能障礙引起視神經病變的小鼠模型。Qi等[47]將通過改變mtDNA的編碼活得突變的ND4mtDNA，最終可將ND4亞基中的精氨酸轉變為組氨酸，獲得ND4突變體，將腺相關病毒-ND4突變復合體注入小鼠玻璃體腔內構建了LHON模型，小鼠出現視盤水腫、視神經萎縮、RGC凋亡和ROS增加。Lin等[48]報道，將造成視神經萎縮的突變mtDNA（ND6 P25L）導入雌鼠體內，在交配的后代中獲得LHON小鼠模型。Zhang等[49]研究顯示，在大鼠上丘注射魚藤酮也能獲得LHON的動物模型。
基于以上動物模型，Heitz等[50]將艾地苯醌喂養的LHON小鼠和對照組比較發現，艾地苯醌能防止RGC死亡、視網膜損傷和視力下降。Koilkonda等[51]在LHON小鼠玻璃體腔內注射正常的腺相關病毒-ND4，發現小鼠視功能較對照組改善，視神經軸突增多。Indrieri等[52]發現，miRNA-181a/b失活的LHON小鼠視力下降更緩慢，提示miRNA-181a/b能調控線粒體的生物發生，下調miRNA-181a/b水平對RGC有保護作用，同時它也可能是基因治療的靶標。最新研究發現，在腺相關病毒-ND4突變體誘導的LHON小鼠中，X連鎖凋亡抑制劑能防止軸突損傷和神經纖維層厚度變薄，從而預防RGC凋亡，延緩疾病進展[53]。上述動物研究均為LHON臨床試驗的開展提供了可靠依據。
3 未來可能的LHON模型
目前，基因編輯技術的研究較多，其中較為熱門的是RNA核酸內切酶（Cas9），它是一種短回文的重復序列(CRISPR)[2]。CRISPR/Cas9酶廣泛應用于動植物細胞和原代細胞的培養，它能夠結合和切割DNA的單個或多個堿基，從而獲得目的基因，這也使未來基因編輯技術應用于LHON建模和靶向基因治療成為可能[54]。當前，科學家研發出一種新型視網膜器官-芯片模型，芯片上包含視網膜色素上皮層所有的細胞類型，它的獨特優勢在于可以使用連續的營養供應來模擬生理灌注，同時能對來源于LHON的多能干細胞進行改造[55]。此外，LHON患者的細胞共培養衍生物、 RGC-3D類器官和離體眼組織也可作為實驗模型[56]。
4 小結與展望
根據現有文獻顯示，iPSC可能是LHON最有應用前景的細胞模型，但它也存在著實驗費用昂貴、操作技術困難等問題。對于LHON動物模型，需要從線粒體基因層面徹底改造，才能真正獲得與LHON發病機制和臨床表現相似的模型，但目前尚未有公認的較穩定的動物模型出現，還需進一步探索。除細胞和動物模型外，CRISPR/Cas9酶和LHON患者組織培養衍生物也開始應用到LHON的研究中，但如何精確定位和提高培養成功率也是下一步需要克服的問題。隨著科學研究的不斷推進，未來我們希望能獲得一種基因表型穩定、實驗技術成熟的模型。
Leber遺傳性視神經病變（LHON）是一種最常見的線粒體疾病，由線粒體DNA（mtDNA）點突變引起，發病年齡為20～30歲，以年輕男性為多見。由于視網膜神經節細胞（RGC）丟失，視神經和視網膜萎縮，LHON患者會出現不同程度的中心視力下降和視野缺損，表現為單眼無痛性視力喪失，對側眼視力也在數月內急劇下降[1-2]。野生型和突變型mtDNA比例以及個體組織間差異會極大影響LHON的嚴重程度，而吸煙、抗逆轉錄病毒藥物和有機溶劑等因素會影響疾病的表型[3-4]。因為LHON患者的RGC不能直接用于動物實驗，所以建立合適的動物實驗模型對研究LHON的發病機制、基因型-表型相關性、易感性因素和治療藥物尤為重要[2]。而目前國內關于LHON實驗模型的研究不多[5]。現就LHON的細胞、動物模型及最新研究進展作一綜述，以期為實驗研究提供參考。
1 細胞模型
目前針對上述LHON發病機制，國內外學者提出很多細胞模型方法，其中淋巴母細胞、成纖維細胞、細胞雜種和誘導多能干細胞（iPSC）是LHON研究中使用最廣泛的細胞模型。
1.1 淋巴母細胞
淋巴母細胞由原代B淋巴細胞感染人類皰疹病毒4型（Epstein-Barr病毒）產生，其特點為永生性，即在人體外可快速增生且長期存活[2,6]。通過單份人體外周血樣本即可獲得大量實驗材料，便于對mtDNA做定性和定量分析。
Van Bergen等[7]發現，在無葡萄糖的半乳糖培養基上，LHON淋巴母細胞的生長速率比對照組慢2.35倍，提示LHON的發病機制可能為線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ驅動合成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）減少。Falabella等[8]在相同培養基上培育LHON患者的淋巴母細胞，發現培養基中活性氧（ROS）和亞硝酸鹽濃度產生均增加，提示LHON患者的淋巴母細胞對氧化和亞硝化產物刺激較敏感，過多暴露于一氧化氮會使細胞上的線粒體儲存能力降低，導致細胞功能障礙。Brown等[9]對攜帶m11778G＞A、m.3460G＞A和m.14484T＞C位點mtDNA突變的淋巴母細胞進行線粒體功能分析，結果顯示m11778G＞A、m.3460G＞A位點突變導致嚴重的線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ缺陷，而m.14484T＞C位點突變導致的線粒體功能障礙較輕。對于LHON基因型-表型的研究表明，核修飾基因會增加mtDNA突變的概率[10]。Jiang等[11]使用m11778G＞A位點突變的淋巴母細胞與無突變細胞相比，確定了LHON的第一個核修飾基因YARS2，它會影響mtDNA突變的表型，突變的YARS2基因會加劇與m.11778G> A位點突變相關的線粒體功能障礙。該研究同時探索了LHON男性患病率高的原因，其將LHON淋巴母細胞置于含有睪酮的細胞培養基中，發現與對照組相比，在含有睪酮的培養基中孵育的細胞凋亡數量增多，自噬標記物減少[12]。這提示睪酮能促進LHON淋巴母細胞凋亡，影響正常的自噬功能，導致有缺陷的線粒體積聚，正常線粒體數量減少，產能降低。
淋巴母細胞快速增生，可快速獲得大樣本量的特性，為實驗研究提供了一種經濟高效的細胞模型。但是，建立淋巴細胞系的永生化過程會影響細胞代謝，且在傳代過程中，細胞的基因表達會發生變化[13]。此外，淋巴母細胞對溫度、酸堿度、培養基、可能存在的培養基污染和培養時間等因素較為敏感[2]。在選擇淋巴母細胞作為模型時要考慮上述因素的影響。
1.2 成纖維細胞
成纖維細胞是一種間充質細胞，在組織發育以及維持和修復過程中起重要作用，能反映累積的細胞損傷和突變，主要通過微創皮膚活檢獲得[14]。
有研究發現，LHON患者、m11778G＞A位點突變攜帶者和正常個體的成纖維細胞的線粒體蛋白質存在差異，主要分為生物能途徑相關蛋白和質量控制系統相關蛋白兩類[15]。這提示LHON發病機制可能與生物能紊亂和蛋白質質量控制系統障礙有關。Zhou等[16]發現，LHON成纖維細胞的ROS顯著增加，谷胱甘肽化的蛋白質增加，其中僅27%的蛋白質來自線粒體，其余來自高爾基體、細胞核和溶酶體等。這提示線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ缺陷引起的氧化應激會促進蛋白質的谷胱甘肽化，累及細胞的各個細胞器，同時通過抗氧化作用能靶向減少蛋白質的谷胱甘肽化，從而治療LHON。成纖維細胞在研究LHON與其他疾病并存的分子機制中也有應用。Uittenbogaard等[17]比較LHON（m11778G＞A突變）和多發性硬化患者的成纖維細胞發現，前者細胞的基礎呼吸速率降低55％，線粒體嵴的超微結構被破壞，氧化磷酸化（OXPHOS）途徑被抑制，提示m11778G＞A位點突變通過改變OXPHOS和糖酵解之間的動態作用來損害細胞的代謝調控。還有研究表明，與僅攜帶m11778G＞A位點突變或m.14484T＞C位點突變者相比，攜帶兩種突變者的成纖維細胞中線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ的功能損害更嚴重[18]。
Giordano等[3]將LHON成纖維細胞與香煙煙霧冷凝物共同孵育以探索LHON的易感性因素，發現無論是LHON患者、攜帶者，還是正常人，其成纖維細胞的mtDNA拷貝數均顯著降低，ATP合成能力和細胞呼吸能力均下降。這提示吸煙削弱了線粒體生物發生和維持mtDNA拷貝數的補償能力，同時吸煙與LHON外顯率高度相關。
對于LHON的治療，Yu-Wai-Man等[19]將艾地苯醌和不同類型的輔酶Q加入4個LHON成纖維細胞系發現，艾地苯醌可通過提高線粒體呼吸鏈的電子傳遞效率對OXPHOS產生積極影響，且不同細胞系對艾地苯醌反應具有特異性。這也解釋了在臨床試驗中，不同患者口服艾地苯醌后視力變化和并發癥嚴重程度存在差異的原因。Chao de la Barca等[20]分析LHON成纖維細胞的代謝產物發現，所有種類的氨基酸濃度降低，部分鞘磷脂濃度降低。因為內質網（ER）是細胞產生蛋白質和氨基酸的主要部位，提示LHON可能與ER應激有關，為研究ER靶向藥物提供了理論基礎。
成纖維細胞有易培養、無需傳代以及在細胞水平可永久保持生物學特性等優勢，廣泛應用于線粒體蛋白質分析和治療藥物的研究[1-2,21]。其主要缺點主要有：（1）使用成纖維細胞模型可能不能反映線粒體調節的特異性，如線粒體在神經組織，特別是視神經中的致病機制；（2）經皮膚活檢取材后，需培育幾周才能獲得足夠樣本量[1]。
1.3 細胞雜種
細胞雜種，即胞質雜交細胞，它是由提供細胞核和線粒體的細胞融合而成的真核細胞系，通常使用無mtDNA（ρ0）的未成熟細胞與突變mtDNA雜交產生（將mtDNA注入未成熟細胞雜交成新細胞）[2, 22]。這種模型產生了核基因相同的雜交細胞系，在研究mtDNA突變的致病影響、mtDNA與表型的關系以及mtDNA與核DNA相容性中應用普遍[21,23-24]。
對于LHON的發病機制，Zhang等[25]將ρ0細胞與LHON患者（m.3635G> A突變）的mtDNA融合發現，雜交細胞的線粒體功能障礙，ATP合成效率降低，ROS增多。這提示m.3635G> A是LHON mtDNA的突變位點。有研究證實，另1個突變位點m.12338T> C也與LHON相關，含突變mtDNA的細胞雜種線粒體數量減少，復合體Ⅰ活性降低，ATP減少，細胞凋亡數量增加[26]。Ji等[24]發現，同時攜帶m.3394T> C和m.11778G> A突變基因與只攜帶m.11778G> A突變基因的細胞雜種相比，復合體Ⅰ的結構不穩定性更高，活性更低。進一步的研究結果顯示，攜帶m.3866T> C和m.11778G> A突變的細胞雜種線粒體功能損害也更嚴重[27]。這提示兩種mtDNA突變的協同作用會加重LHON線粒體的功能障礙。Sharma等[28]發現，LHON雜交細胞通過激活自噬清除受損的線粒體，提高細胞存活率，說明線粒體的自噬激活既是LHON的保護機制，又是一種新的治療方式。Zhang等[29]在352例m.15927G>A突變患者中發現，8例患者存在轉運RNAThr基因，將其突變mtDNA的細胞雜種與對照組比較發現，線粒體翻譯功能受損，復合Ⅰ和Ⅲ活性降低，ATP產量減少，ROS增加。這提示m.15927G>A突變可能改變了RGC的tRNA結構和功能，破壞線粒體的翻譯和呼吸，從而導致LHON。
對于LHON基因型和表型，早期研究發現不同的mtDNA單倍體會影響LHON的外顯率[30]。Caporali等[31]觀察含有兩種突變mtDNA的細胞雜種發現，即使不是三種最常見的位點突變，mtDNA其他位點的突變組合也可能導致OXPHOS效率降低，LHON外顯率增加。這提示LHON的突變位點可能不存在“致病性”和“非致病性”的區別，是否致病或外顯主要取決于基因組突變的特定組合。不同的環境因素也會導致表型差異，López-Gallardo等[32]比較了來源于食物的復合物Ⅰ抑制物（魚藤酮、辣椒素和羅尼司它丁-1）對LHON細胞雜種的影響，結果顯示含有m.3460G> A突變mtDNA的細胞雜種對魚藤酮有較強抵抗力，但對辣椒素和羅尼司它丁-1較敏感。所以，食物中某些異源性物質可以改變LHON的外顯率，研究LHON的發病機制時必須考慮到基因與環境之間的相互作用。還有研究在LHON雜交細胞培養基中加入最常用的眼藥水防腐劑苯扎氯銨，發現其線粒體氧耗降低，ATP產量下降，提示苯扎氯銨會抑制線粒體的功能，LHON患者不宜使用含苯扎氯銨的眼藥水[33]。
對于LHON的治療，Emperador等[34]將攜帶不同mtDNA突變的細胞雜種置于含有酮體的培養基中發現，細胞與生酮共培養可以降低LHON異質性突變的百分比，增加同質性突變的mtDNA水平，提示生酮飲食可能是治療LHON的新方法。關于LHON男女患病率的差異，有學者認為雌激素的保護作用降低了女性患病率。Pisano等[35]將m.11778G> A突變的雜交細胞和雌激素混合培養發現，雌激素通過結合β受體激活線粒體的生物發生，降低氧化應激反應，啟動細胞的補償作用。這提示靶向介導雌激素β受體可作為突變攜帶者的一種預防性治療手段。
盡管細胞雜種模型在LHON研究中應用廣泛，但仍存在以下缺陷：（1）由于ρ0細胞的未成熟性，所以其核基因的遺傳背景不穩定；（2）細胞雜交是一個多階段的復雜過程，這些過程可能導致細胞應激以及基因表達改變；（3）檢驗是否融合成功的步驟也較為繁瑣[2]。
1.4 iPSC
iPSC-RGC模型是一種新興細胞模型。2006年科學家首次發明誘導iPSC技術，主要通過含有轉錄因子的質粒或病毒載體誘導體細胞產生iPSC，也稱為iPSC的重編程[36]。iPSC通常由成纖維細胞和外周血細胞產生，其優勢在于：（1）具有與研究疾病相同的細胞類型；（2）無限增生性；（3）多向分化的潛力[36-37]。
為了驗證iPSC技術研究線粒體疾病的可行性，Hung等[38]研究了LHON中不同mtDNA突變引起的線粒體呼吸缺陷對iPSC重編程的影響，結果顯示復合體Ⅰ突變引起的線粒體呼吸缺陷僅輕度降低了重編程效率，并且未改變線粒體生物發生的基因表達。Lu等[39]使用仙臺病毒載體誘導LHON患者的單核細胞生成iPSC系（TVGH-iPSC-010-09），該細胞系含有m.11778G> A突變的mtDNA，且有分化為內、中和外胚層細胞的潛力，為疾病研究提供了一種體外實驗模型。Peron等[40]也使用相同方法產生攜帶m.3460G> A突變的iPSC系（FINCBi001-A）。Yang等[41]首次使用LHON患者的特異性iPSC分化出RGC（LHON-RGC），與正常RGC比較發現，LHON-RGC的α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸（AMPA）受體的蛋白表達水平下降，提示AMPA受體與LHON發病機制有關。為了研究LHON外顯率的差異，Wu等[42]將LHON患者和突變基因攜帶者iPSC分化的RGC比較，LHON-RGC的軸突結構明顯萎縮，軸突數量減少，轉錄生成的信使RNA減少。Yang等[43]發現，與突變基因攜帶者和正常人iPSC分化的RGC相比，LHON-RGC凋亡增加，ROS增加，逆行運動的線粒體數量增加，這種線粒體運動模式的改變可能與驅動蛋白5A的表達下降有關。這提示LHON外顯率差異是RGC氧化應激水平，線粒體運動模式和凋亡程度不同造成的。對于LHON的治療，Yang等[44]發現3D納米支架能促進iPSC分化的RGC軸突生長，增強RGC定向生長的能力，提高RGC的活性。這提示iPSC對研究LHON新的治療方式有重要前景。
與成纖維細胞和外周血細胞相比，iPSC是一種更能代表LHON突變特點的細胞模型，但也存在一些缺點：（1）價格昂貴；（2）耗時長，產生iPSC系至少需要3個月以上；（3）效率低，iPSC分化的部分RGC不包含突變的mtDNA；（4）分化的細胞類型有限[2,45]。
2 動物模型
雖然在LHON研究中細胞模型應用更廣泛，但動物模型對探究LHON發病機制和治療藥物也有重要意義。由于技術的限制，獲取線粒體疾病的動物模型比較困難，目前也在進行持續研究[2]。
2002年，Zhang等[46]在小鼠玻璃體腔內注射魚藤酮，導致視網膜節細胞層和內叢狀層中神經元的損傷，這些位于視網膜中央的損傷與LHON患者視網膜病理切片相同，建立了第一個由線粒體功能障礙引起視神經病變的小鼠模型。Qi等[47]將通過改變mtDNA的編碼活得突變的ND4mtDNA，最終可將ND4亞基中的精氨酸轉變為組氨酸，獲得ND4突變體，將腺相關病毒-ND4突變復合體注入小鼠玻璃體腔內構建了LHON模型，小鼠出現視盤水腫、視神經萎縮、RGC凋亡和ROS增加。Lin等[48]報道，將造成視神經萎縮的突變mtDNA（ND6 P25L）導入雌鼠體內，在交配的后代中獲得LHON小鼠模型。Zhang等[49]研究顯示，在大鼠上丘注射魚藤酮也能獲得LHON的動物模型。
基于以上動物模型，Heitz等[50]將艾地苯醌喂養的LHON小鼠和對照組比較發現，艾地苯醌能防止RGC死亡、視網膜損傷和視力下降。Koilkonda等[51]在LHON小鼠玻璃體腔內注射正常的腺相關病毒-ND4，發現小鼠視功能較對照組改善，視神經軸突增多。Indrieri等[52]發現，miRNA-181a/b失活的LHON小鼠視力下降更緩慢，提示miRNA-181a/b能調控線粒體的生物發生，下調miRNA-181a/b水平對RGC有保護作用，同時它也可能是基因治療的靶標。最新研究發現，在腺相關病毒-ND4突變體誘導的LHON小鼠中，X連鎖凋亡抑制劑能防止軸突損傷和神經纖維層厚度變薄，從而預防RGC凋亡，延緩疾病進展[53]。上述動物研究均為LHON臨床試驗的開展提供了可靠依據。
3 未來可能的LHON模型
目前，基因編輯技術的研究較多，其中較為熱門的是RNA核酸內切酶（Cas9），它是一種短回文的重復序列(CRISPR)[2]。CRISPR/Cas9酶廣泛應用于動植物細胞和原代細胞的培養，它能夠結合和切割DNA的單個或多個堿基，從而獲得目的基因，這也使未來基因編輯技術應用于LHON建模和靶向基因治療成為可能[54]。當前，科學家研發出一種新型視網膜器官-芯片模型，芯片上包含視網膜色素上皮層所有的細胞類型，它的獨特優勢在于可以使用連續的營養供應來模擬生理灌注，同時能對來源于LHON的多能干細胞進行改造[55]。此外，LHON患者的細胞共培養衍生物、 RGC-3D類器官和離體眼組織也可作為實驗模型[56]。
4 小結與展望
根據現有文獻顯示，iPSC可能是LHON最有應用前景的細胞模型，但它也存在著實驗費用昂貴、操作技術困難等問題。對于LHON動物模型，需要從線粒體基因層面徹底改造，才能真正獲得與LHON發病機制和臨床表現相似的模型，但目前尚未有公認的較穩定的動物模型出現，還需進一步探索。除細胞和動物模型外，CRISPR/Cas9酶和LHON患者組織培養衍生物也開始應用到LHON的研究中，但如何精確定位和提高培養成功率也是下一步需要克服的問題。隨著科學研究的不斷推進，未來我們希望能獲得一種基因表型穩定、實驗技術成熟的模型。