根據誘導糖尿病視網膜病變（DR）的實驗方法不同以及觀察到的視網膜病變特點不同，DR動物模型可分為藥物或食物誘發性模型、氧誘導視網膜病變（OIR）模型、自發遺傳性模型和基因模型。誘發性模型是目前最常用于DR研究的動物模型，具有耗時短、成本低、方法簡便、重復性較好和短期內可批量造模等優點；但其使用的藥物對實驗動物的全身各器官均有一定的毒副作用，動物死亡風險較大。OIR模型的表型重復性高、穩定性高且成本相對較低，但由于OIR小鼠缺乏全身性高血糖的代謝改變，此模型無法準確反映高血糖狀態下由于代謝情況對視網膜病變的影響。自發遺傳性模型病理改變較為穩定，但由于價格昂貴，且同系繁殖和單基因遺傳會使其糖尿病的遺傳同質性與人類有差異，限制了該模型的廣泛應用。基因模型的優點是病因明確，但對技術、實驗操作和實驗儀器要求高，成本高不適合大批量造模，因此在應用中受限。研究者應從特定的研究目的、觀察指標、實驗條件和經費等多方面綜合考量，結合DR模型的特點和局限性，從而選擇最佳的動物模型。此外，仍需開發能夠更精確模擬DR的動物模型，以擴展對DR機制的探索，為研發可行的預防和治療方法提供更加有效的工具。
引用本文： 樊蕊嫣, 徐嫚鴻, 李筱榮. 糖尿病視網膜病變動物模型選擇和應用的研究進展. 中華眼底病雜志, 2021, 37(12): 985-990. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201125-00586 復制
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最常見的嚴重微血管并發癥之一，也是24～70歲成人失明的主要原因[1-2]。臨床上根據是否存在視網膜新生血管將DR分為非增生型DR（NPDR）和增生型DR（PDR），其中NPDR眼底改變主要包括微血管損傷和周細胞丟失所導致的微血管瘤、出血點、出血斑、硬性滲出和棉絨斑等；而PDR是以視網膜新生血管為特征的病理改變。為了進一步研究DR的病因和發病機制、研發DR的治療藥物，目前已有多種動物模型可供選擇。根據誘導DR的實驗方法不同以及觀察到的視網膜病變特點不同，這些動物模型可分為誘發性模型、氧誘導視網膜病變（OIR）模型、自發遺傳性模型和基因模型。現就DR動物模型造模方法、病變特點、病變出現時間以及驗證模型的檢測方法等研究進展作一綜述。
1 誘發性模型
誘發性模型是一種應用各種物理或化學方法破壞胰島β細胞導致胰島素缺乏或胰島素利用障礙，從而使血糖升高引發多種微血管并發癥，用于觀察DR相關病理表現的造模方法。目前有5種建立誘發性模型的方法：鏈脲佐菌素（STZ）、四氧嘧啶、高半乳糖飲食、手術切除胰腺和細胞因子[3]。最常用來誘導DR模型的動物是嚙齒動物，也有使用狗、貓、豬、兔子、猴子和斑馬魚的報道。大型動物誘導的DR病理表現通常較慢，故嚙齒動物和斑馬魚更受青睞。
1.1 STZ
STZ是目前最常用的誘導動物糖尿病的藥物，具有易操作、效率高、致病進程快和強特異性破壞胰島β細胞等優點[4-5]。β細胞特異性吸收STZ是因其表達低親和力的葡萄糖轉運蛋白2，且STZ在結構上與葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖相似[6]。肝細胞和腎小管細胞也表達葡萄糖轉運蛋白2，在給予STZ后也會受到類似的損傷[6]。STZ的作用機制為通過造成DNA斷裂，從而導致STZ高親和力的細胞死亡。
1.1.1 動物選擇
嚙齒類動物由于體積小、繁殖能力強和成本低的優點，在研究中應用廣泛。目前研究報道多使用雄性C57BL/6J小鼠、Kunming小鼠、Brown-Norway大鼠、Spragur-Dawley大鼠和Wistar大鼠。與小鼠相比，大鼠對STZ更敏感，更容易成模且成活時間長，但操作有一定難度，研究成本高于小鼠。6～8周齡小鼠對STZ的致糖尿病作用較敏感，而小于6周齡（性未成熟）的小鼠敏感性較低[7]。研究表明，雄性小鼠對STZ的致糖尿病作用的敏感性較雌性小鼠高，這可能與兩者的激素差異有關。雌激素在控制糖代謝過程中起著關鍵作用，STZ誘導成功的糖尿病小鼠模型使用外源雌激素后血糖可降至正常水平[8]，因此已報道的研究中多選用6～8周齡雄性小鼠誘導DR模型。
1.1.2 單純注射STZ
單次大劑量注射STZ可快速破壞大量胰島β細胞，導致血糖急速升高，缺乏胰島的自身免疫反應，與人類1型糖尿病（T1DM）差距較大[9]；多次低劑量注射STZ則誘發部分胰島β細胞的自身免疫反應，導致細胞活性的進一步喪失，血糖漸進性升高，具有慢性胰島炎癥反應和胰島素缺乏癥的特征，能更好地模擬人類T1DM的發病機制[10]。與單次大劑量注射相比，多次小劑量注射還具有造模成功率高、死亡率低和高血糖維持穩定的優點。C57BL/6J小鼠6周基礎隨機血糖為8.9 mmol/L，禁食6 h后空腹血糖為7.9 mmol/L。目前小鼠常采用連續5 d腹腔注射55 mg/kg STZ，注射前通常禁食4～6 h[10]；STZ誘導的小鼠模型高血糖癥通常發生在最后一次注射后的2周內，成模標準為隨機血糖＞16.7 mmol/L（300 mg/dl）[11]，空腹血糖＞13.9 mmol/L（250 mg/dl）[11]。高紅梅和王儉勤[12]研究發現，小鼠40、50、60 mg/kg STZ連續腹腔注射5 d，成模率分別為12.5%、62.5%、87.5%，實驗期間無小鼠因注射藥物死亡。有研究給予大鼠連續5 d腹腔注射STZ 30 mg/kg或單次注射45～70 mg/kg，注射前禁食12 h，結果顯示多次連續注射STZ的大鼠死亡率是0%，而單次注射量為45、55、65、70 mg/kg時大鼠的死亡率分別為10%、10%～30%、20%～50%和100%[8]，誘導的大鼠模型通常研究時間長達20周。STZ誘導的DR模型通常可以觀測到視網膜的電生理改變、微血管滲漏、神經節細胞丟失、神經膠質細胞凋亡、毛細血管退行性變和毛細血管基底膜增厚（表1）。
表1
STZ誘導的嚙齒類動物DR模型中病理改變出現時間及檢測方法
1.1.3 高脂飲食聯合STZ
目前用于模擬2型糖尿病（T2DM）的動物模型多采用高脂飲食聯合STZ誘導嚙齒類動物，高脂飲食喂養導致動物肥胖、高胰島素血癥和胰島素抵抗；輔以低劑量STZ促使實驗動物胰島素缺乏。Srinivasan等[19]研究發現，高脂飲食（脂肪58%、蛋白質25%、碳水化合物17%）喂養大鼠2周后，腹腔一次性注射35 mg/kg STZ，可較好地反映T2DM大鼠的病理狀態，包括體重增加、輕度高血糖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥和代償性高胰島素血癥，同時葡萄糖消失率降低，類似于人類糖尿病前期的胰島素抵抗狀態。Salido等[20]研究結果顯示，腹腔注射高糖聯合STZ誘導成年大鼠12周后，其視網膜電圖出現明顯的異常，伴有血管內皮生長因子（VEGF）水平升高。雖然該動物模型可呈現T2DM的典型特征，但目前用于研究DR的文獻報道較少。
1.2 四氧嘧啶
四氧嘧啶已被用于小鼠、大鼠、狗、豬和兔子等多種動物誘導DR[16,21]。四氧嘧啶是通過抑制葡萄糖激酶介導誘導β細胞死亡的，并且其作用具有胰島β細胞特異性，對α、δ和胰腺外分泌細胞沒有毒性作用。與STZ相比，四氧嘧啶效率較低，在室溫和體溫下及水中性質也不穩定。小鼠單劑量注射四氧嘧啶，可誘導高血糖癥導致糖尿病[22]。Fot_FB菌株小鼠靜脈注射60～80 mg/kg四氧嘧啶后，7 d內可觀察周細胞和視網膜神經節細胞（RGC）丟失，21 d出現微血管瘤及無細胞毛細血管的增多[22] ；C57小鼠靜脈注射75 mg/kg四氧嘧啶后3個月時視網膜小膠質細胞胞體增厚，樹突變短[23]。
1.3 高半乳糖飲食
由30%～50%高半乳糖飲食持續喂養小鼠所形成的DR模型，小鼠在6周齡時出現高血糖，15個月后觀察到內皮細胞丟失和無細胞毛細血管增多[24]，21個月后觀察到周細胞丟失、微血管瘤和視網膜增厚[24-25]。這些小鼠DR表征發生時間晚，但其存活時間長達26個月，用于實驗及觀察的時間較其他模型更長，但此模型無視網膜新生血管形成。
1.4 其他方法
除上述建模方法外，還有胰腺切除手術誘發模型及堿燒傷模型。胰腺切除手術是誘導糖尿病較為古老的方法，操作困難，對動物傷害大，通常適用于大型靈長類動物，如猴。研究發現，猴在6～15歲時切除胰腺導致胰島素依賴和高血糖癥，高血糖1年內會出現血視網膜屏障滲漏，但在胰腺切除10年后，猴仍未出現類似PDR的病理表現[26]。由于動物倫理問題、猴的繁殖能力低、實驗研究時間長、研究成本高等因素限制了該模型的使用。堿燒傷模型將浸泡在1 mmol/L氫氧化鈉中的2 mm濾光片放置在成年小鼠眼表[27]，導致細胞因子活性增加，產生DR樣新生血管[28]，造模過程對小鼠更為痛苦，不提倡采用。
2 OIR模型
OIR模型是利用高氧或低氧造成視網膜無灌注區，誘發促血管生成因子顯著上調，從而形成病理性新生血管。該模型能較好地模擬缺血性新生血管的形成，最初用來模擬早產兒視網膜病變（ROP）的病理表現，目前在DR視網膜血管病變的機制研究及對抗血管藥物或治療靶點的評估中發揮重要的作用。
2.1 嚙齒類動物OIR模型
OIR模型中最常用的是小鼠，OIR小鼠模型是將出生后7～12 d（P7～P12）的新生小鼠置于濃度75%的氧氣中，P12時恢復到室內空氣（濃度21%的氧氣）[28]。P7～P12高氧迅速引起小鼠視網膜血管閉塞，并在高氧后48 h達到峰值。由于發育中的視網膜對氧氣需求增加，血管閉塞區的血運從P9～P12開始重建，出現的病理性視網膜新生血管主要分布在無血管區和血管區交界處，在P17時最為明顯，隨后新生血管開始消退，直到P25時新生血管幾乎完全消失。中心血管閉塞和視網膜新生血管化緊密相關，前者在很大程度上決定了后者的時間進程和嚴重性[29]，兩者都可以在視網膜平面上進行評測。
新生血管的定量分析主要采用全視網膜鋪片的免疫熒光染色，共聚焦觀察并定量分析新生血管團簇的面積；也可采用蘇木精-伊紅染色病理切片，在光學顯微鏡下計數內界膜玻璃體側的新生血管細胞核來定量新生血管化[29]。然而傳統的定量方法難以將缺血誘導的新生血管和先前存在的視網膜脈管系統區分開，近期有研究報道了一種更加客觀的來量化視網膜新生血管的方法，胸苷類似物5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）可以用于標記新合成的DNA，在P11后持續給予OIR小鼠腹腔注射100mg / kg BrdU至安樂死，再結合內皮細胞特異性標志物對視網膜進行熒光染色，則可以在共聚焦下觀察到已被標記的增生的內皮細胞，為視網膜新生血管的客觀量化以及抗新生血管干預方法的效果評估提供了一種靈敏高效的方法[30]。
OIR大鼠多采用高氧-低氧交替方式進行誘導，van Wijngaarden等[31]將出生后大鼠置于高氧環境中11～14 d，隨后置于常氧狀態飼養，在P18時視網膜出現星形細胞變性，內核層及內從狀層厚度降低，并出現新生血管。Soetikno等[32]將出生后大鼠置于濃度50%與10%氧交替暴露的環境下，14 d時恢復到正常氧環境，缺氧-再灌注導致大鼠出現視網膜新生血管。與小鼠相比，大鼠模型的視網膜新生血管形成不穩定，可能會偶發視網膜脫離。但大鼠模型的優勢在于新生血管特征與ROP相似，血管閉塞和新生血管的形成主要出現在視網膜周邊部，而小鼠模型的血管閉塞和新生血管發生在視網膜中央區[33]。
2.2 斑馬魚OIR模型
斑馬魚OIR模型建立方法是將斑馬魚置于常氧水中，然后在48～72 h內逐漸降低氧分壓至10%，在這種環境中維持15 d，暴露后新生血管明顯增多，視網膜新生血管在P12時達到高峰[34]。Cao等[35]對斑馬魚采用口服給藥的方式進行抗新生血管藥物的研究，發現給藥方便簡單易操作。但與嚙齒類動物相比，斑馬魚模型尚未廣泛應用，缺乏豐富的研究基礎。
3 自發遺傳性模型
自發遺傳性模型與人類糖尿病發病進展最為接近，多采用有自發性糖尿病傾向的純種動物，按照對應的飼養方式進行喂養使其成模。目前自發性T1DM模型有NOD小鼠、Ins2akita小鼠和BB大鼠；自發性T2DM模型有db/db小鼠、KKAy小鼠、OLETF大鼠、GK大鼠、ZDF大鼠、SDT大鼠和WBN/Kob大鼠等[3]。其中Ins2akita小鼠和db/db小鼠模型在DR研究中應用廣泛。
Ins2akita小鼠是一種自發的T1DM模型，由于胰島素2基因的錯義突變導致胰島素蛋白的構象變化，蛋白在胰島β細胞中積累致β細胞死亡。4周時小鼠血糖水平顯著升高；高血糖8周后小鼠血管壁白細胞增多，星形膠質細胞和小膠質細胞形態發生改變；高血糖12周后視網膜血管通透性增加[36]；高血糖3個月后RGC軸突和樹突減少[37]；高血糖22周后視網膜內叢狀層和內核層厚度減少；高血糖36周后無細胞毛細血管增加[36]。Ins2akita小鼠可在短時間內檢測到RGC丟失，有助于研究DR早期進展的分子機制并用于評估藥物的神經保護作用[37]。
db/db小鼠是一種自發的T2DM模型，由于小鼠缺乏瘦素受體，出生后4～8周便自發發展為與肥胖相關的糖尿病，通常于10個月時死于胰島嚴重枯竭和心肌疾病。純合子動物表現為慢性高血糖癥、病態肥胖和胰腺β細胞萎縮，最終出現低胰島素血癥。出生6周后，db/db小鼠視網膜中央的RGC數量減少[38]；15周時周細胞丟失和內細胞丟失，基底膜增厚，血視網膜屏障破壞，神經細胞凋亡，膠質細胞重新激活，反應性神經膠質增生。由于該模型突變體的易獲得性，db/db小鼠現已成為研究DR早期發病機制的一種動物模型[39]。
4 基因模型
動物基因模型是一項具有前景的新型誘導技術，通過轉基因、基因敲除和誘發突變等方法尋找DR相關基因在發病及治療中的作用。目前常用的轉基因動物模型包括IR/IRS-1基因敲除雜合小鼠、Kimba小鼠和Akimba小鼠。
Kimba小鼠是一種轉基因的視網膜新生血管模型，由光感受器細胞中暫時過表達的VEGF所誘導。小鼠P7時可出現神經節細胞層、內核層，外核層和整個視網膜層的厚度降低；小鼠P28時出現視網膜微血管瘤和血管滲漏[40]；6周時，在小鼠的靜脈和毛細血管中發現黏附的白細胞和無細胞毛細血管數量增加；9周時血管紆曲和周細胞丟失明顯，但由于VEGF的表達水平逐漸下降，血管滲漏在9周后不再繼續[41]。Kimba小鼠缺乏高血糖背景，該模型的視網膜新生血管與高血糖癥無相關性[42]。
由于Kimba小鼠模型的局限性，有學者通過雜交Kimba小鼠與自發性T1DM模型Ins2Akita小鼠，創建了Akimba模型；其特點是具有兩個親本模型的相加效應，具有高血糖及晚期DR的特征[42]。在8周內出現微動脈瘤，新生血管形成，毛細血管出血、紆曲擴張和滲漏，光相干斷層掃描檢查顯示Akimba小鼠視網膜水腫，光感受器層厚度降低和視網膜脫離；24周時小鼠的RGC數量和神經節細胞層厚度降低，視網膜電圖暗視a波和b波振幅顯著降低[43]。熒光素眼底血管造影檢查發現8周和22～24周的Ins2Akita小鼠均未出現熒光素滲漏改變，Kimba小鼠和Akimba小鼠均出現熒光素滲漏，且Akimba小鼠中由VEGF與高血糖水平相結合所導致的熒光素滲漏改變比Kimba小鼠更嚴重[43-44]。
5 DR模型的比較
誘發性模型是目前最常用于DR研究的動物模型，具有耗時短、成本低、方法簡便、重復性較好和短期內可批量造模等優點。研究者可使用該模型探究DR發病過程中不同細胞、不同病變過程的差異，檢測方法和指標較為明確。但誘發性模型所使用的藥物對實驗動物的全身各器官均有一定的毒副作用，動物死亡風險較大。此外，STZ、四氧嘧啶和高半乳糖飲食誘導均只能模擬NPDR的特征，無法用于PDR病變特征的研究。
OIR模型的表型重復性好、穩定性高且成本相對較低，最典型的優點是具有人類PDR的關鍵特征。OIR模型是由視網膜微血管損傷引起視網膜缺氧，隨后病理性新生血管長入玻璃體腔導致出血，且新生血管的面積可以進行定量分析[30]，因此在抗新生血管藥物的研發中OIR模型發揮重要作用[34-35]，并表現出與血管疾病相關的神經膠質和神經元的損傷[45]。但由于OIR小鼠缺乏全身性高血糖的代謝改變，此模型無法準確反映高血糖狀態下由于代謝情況對視網膜病變的影響。
自發模型的實驗動物具有相同的遺傳背景，可以利用該模型對多種致病因素進行分析。此外，該模型的病理改變較為穩定，具有高血糖和眼部病變的特點，適用于包括視網膜血管滲漏和膠質細胞改變在內的多種病理改變的探究。但由于價格昂貴，且同系繁殖和單基因遺傳會使其糖尿病的遺傳同質性與人類有差異，限制了該模型的廣泛應用。
基因模型的優點是病因明確，模型動物間表現的差異小，不影響其他組織，如化學誘導劑的細胞毒性作用。但也存在明顯的缺點，如對技術、實驗操作和實驗儀器要求高，成本高不適合大批量造模，因此在應用中受到限制。
DR是一種較為復雜的糖尿病微血管并發癥，目前尚沒有某種動物模型可以完全模擬DR的全部發病過程，因此需要研究者根據實驗目的和所探究的指標來選擇合適的動物模型（表2）。
表2
常見DR動物模型分類
6 小結與展望
現階段大多數的DR動物模型較好地模擬了人類DR疾病的早期階段，具有PDR視網膜新生血管特征的動物模型較少，因此限制了疾病晚期的治療研究。目前針對視網膜新生血管、視網膜出血和水腫已開發出抗VEGF藥物，但DR是一種可防不可治愈的致盲疾病，應在疾病的早期尋找到致病的關鍵靶點，從而減緩或抑制疾病的進一步進展。研究者應從特定的研究目的、觀察指標、實驗條件和經費等多方面綜合考量，結合DR模型的特點和局限性，從而選擇最佳的動物模型。此外，仍需開發能夠更精確模擬DR的動物模型，以擴展對DR機制的探索，為研發可行的預防和治療方法提供更加有效的工具。
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最常見的嚴重微血管并發癥之一，也是24～70歲成人失明的主要原因[1-2]。臨床上根據是否存在視網膜新生血管將DR分為非增生型DR（NPDR）和增生型DR（PDR），其中NPDR眼底改變主要包括微血管損傷和周細胞丟失所導致的微血管瘤、出血點、出血斑、硬性滲出和棉絨斑等；而PDR是以視網膜新生血管為特征的病理改變。為了進一步研究DR的病因和發病機制、研發DR的治療藥物，目前已有多種動物模型可供選擇。根據誘導DR的實驗方法不同以及觀察到的視網膜病變特點不同，這些動物模型可分為誘發性模型、氧誘導視網膜病變（OIR）模型、自發遺傳性模型和基因模型。現就DR動物模型造模方法、病變特點、病變出現時間以及驗證模型的檢測方法等研究進展作一綜述。
1 誘發性模型
誘發性模型是一種應用各種物理或化學方法破壞胰島β細胞導致胰島素缺乏或胰島素利用障礙，從而使血糖升高引發多種微血管并發癥，用于觀察DR相關病理表現的造模方法。目前有5種建立誘發性模型的方法：鏈脲佐菌素（STZ）、四氧嘧啶、高半乳糖飲食、手術切除胰腺和細胞因子[3]。最常用來誘導DR模型的動物是嚙齒動物，也有使用狗、貓、豬、兔子、猴子和斑馬魚的報道。大型動物誘導的DR病理表現通常較慢，故嚙齒動物和斑馬魚更受青睞。
1.1 STZ
STZ是目前最常用的誘導動物糖尿病的藥物，具有易操作、效率高、致病進程快和強特異性破壞胰島β細胞等優點[4-5]。β細胞特異性吸收STZ是因其表達低親和力的葡萄糖轉運蛋白2，且STZ在結構上與葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖相似[6]。肝細胞和腎小管細胞也表達葡萄糖轉運蛋白2，在給予STZ后也會受到類似的損傷[6]。STZ的作用機制為通過造成DNA斷裂，從而導致STZ高親和力的細胞死亡。
1.1.1 動物選擇
嚙齒類動物由于體積小、繁殖能力強和成本低的優點，在研究中應用廣泛。目前研究報道多使用雄性C57BL/6J小鼠、Kunming小鼠、Brown-Norway大鼠、Spragur-Dawley大鼠和Wistar大鼠。與小鼠相比，大鼠對STZ更敏感，更容易成模且成活時間長，但操作有一定難度，研究成本高于小鼠。6～8周齡小鼠對STZ的致糖尿病作用較敏感，而小于6周齡（性未成熟）的小鼠敏感性較低[7]。研究表明，雄性小鼠對STZ的致糖尿病作用的敏感性較雌性小鼠高，這可能與兩者的激素差異有關。雌激素在控制糖代謝過程中起著關鍵作用，STZ誘導成功的糖尿病小鼠模型使用外源雌激素后血糖可降至正常水平[8]，因此已報道的研究中多選用6～8周齡雄性小鼠誘導DR模型。
1.1.2 單純注射STZ
單次大劑量注射STZ可快速破壞大量胰島β細胞，導致血糖急速升高，缺乏胰島的自身免疫反應，與人類1型糖尿病（T1DM）差距較大[9]；多次低劑量注射STZ則誘發部分胰島β細胞的自身免疫反應，導致細胞活性的進一步喪失，血糖漸進性升高，具有慢性胰島炎癥反應和胰島素缺乏癥的特征，能更好地模擬人類T1DM的發病機制[10]。與單次大劑量注射相比，多次小劑量注射還具有造模成功率高、死亡率低和高血糖維持穩定的優點。C57BL/6J小鼠6周基礎隨機血糖為8.9 mmol/L，禁食6 h后空腹血糖為7.9 mmol/L。目前小鼠常采用連續5 d腹腔注射55 mg/kg STZ，注射前通常禁食4～6 h[10]；STZ誘導的小鼠模型高血糖癥通常發生在最后一次注射后的2周內，成模標準為隨機血糖＞16.7 mmol/L（300 mg/dl）[11]，空腹血糖＞13.9 mmol/L（250 mg/dl）[11]。高紅梅和王儉勤[12]研究發現，小鼠40、50、60 mg/kg STZ連續腹腔注射5 d，成模率分別為12.5%、62.5%、87.5%，實驗期間無小鼠因注射藥物死亡。有研究給予大鼠連續5 d腹腔注射STZ 30 mg/kg或單次注射45～70 mg/kg，注射前禁食12 h，結果顯示多次連續注射STZ的大鼠死亡率是0%，而單次注射量為45、55、65、70 mg/kg時大鼠的死亡率分別為10%、10%～30%、20%～50%和100%[8]，誘導的大鼠模型通常研究時間長達20周。STZ誘導的DR模型通常可以觀測到視網膜的電生理改變、微血管滲漏、神經節細胞丟失、神經膠質細胞凋亡、毛細血管退行性變和毛細血管基底膜增厚（表1）。
表1
STZ誘導的嚙齒類動物DR模型中病理改變出現時間及檢測方法
1.1.3 高脂飲食聯合STZ
目前用于模擬2型糖尿病（T2DM）的動物模型多采用高脂飲食聯合STZ誘導嚙齒類動物，高脂飲食喂養導致動物肥胖、高胰島素血癥和胰島素抵抗；輔以低劑量STZ促使實驗動物胰島素缺乏。Srinivasan等[19]研究發現，高脂飲食（脂肪58%、蛋白質25%、碳水化合物17%）喂養大鼠2周后，腹腔一次性注射35 mg/kg STZ，可較好地反映T2DM大鼠的病理狀態，包括體重增加、輕度高血糖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥和代償性高胰島素血癥，同時葡萄糖消失率降低，類似于人類糖尿病前期的胰島素抵抗狀態。Salido等[20]研究結果顯示，腹腔注射高糖聯合STZ誘導成年大鼠12周后，其視網膜電圖出現明顯的異常，伴有血管內皮生長因子（VEGF）水平升高。雖然該動物模型可呈現T2DM的典型特征，但目前用于研究DR的文獻報道較少。
1.2 四氧嘧啶
四氧嘧啶已被用于小鼠、大鼠、狗、豬和兔子等多種動物誘導DR[16,21]。四氧嘧啶是通過抑制葡萄糖激酶介導誘導β細胞死亡的，并且其作用具有胰島β細胞特異性，對α、δ和胰腺外分泌細胞沒有毒性作用。與STZ相比，四氧嘧啶效率較低，在室溫和體溫下及水中性質也不穩定。小鼠單劑量注射四氧嘧啶，可誘導高血糖癥導致糖尿病[22]。Fot_FB菌株小鼠靜脈注射60～80 mg/kg四氧嘧啶后，7 d內可觀察周細胞和視網膜神經節細胞（RGC）丟失，21 d出現微血管瘤及無細胞毛細血管的增多[22] ；C57小鼠靜脈注射75 mg/kg四氧嘧啶后3個月時視網膜小膠質細胞胞體增厚，樹突變短[23]。
1.3 高半乳糖飲食
由30%～50%高半乳糖飲食持續喂養小鼠所形成的DR模型，小鼠在6周齡時出現高血糖，15個月后觀察到內皮細胞丟失和無細胞毛細血管增多[24]，21個月后觀察到周細胞丟失、微血管瘤和視網膜增厚[24-25]。這些小鼠DR表征發生時間晚，但其存活時間長達26個月，用于實驗及觀察的時間較其他模型更長，但此模型無視網膜新生血管形成。
1.4 其他方法
除上述建模方法外，還有胰腺切除手術誘發模型及堿燒傷模型。胰腺切除手術是誘導糖尿病較為古老的方法，操作困難，對動物傷害大，通常適用于大型靈長類動物，如猴。研究發現，猴在6～15歲時切除胰腺導致胰島素依賴和高血糖癥，高血糖1年內會出現血視網膜屏障滲漏，但在胰腺切除10年后，猴仍未出現類似PDR的病理表現[26]。由于動物倫理問題、猴的繁殖能力低、實驗研究時間長、研究成本高等因素限制了該模型的使用。堿燒傷模型將浸泡在1 mmol/L氫氧化鈉中的2 mm濾光片放置在成年小鼠眼表[27]，導致細胞因子活性增加，產生DR樣新生血管[28]，造模過程對小鼠更為痛苦，不提倡采用。
2 OIR模型
OIR模型是利用高氧或低氧造成視網膜無灌注區，誘發促血管生成因子顯著上調，從而形成病理性新生血管。該模型能較好地模擬缺血性新生血管的形成，最初用來模擬早產兒視網膜病變（ROP）的病理表現，目前在DR視網膜血管病變的機制研究及對抗血管藥物或治療靶點的評估中發揮重要的作用。
2.1 嚙齒類動物OIR模型
OIR模型中最常用的是小鼠，OIR小鼠模型是將出生后7～12 d（P7～P12）的新生小鼠置于濃度75%的氧氣中，P12時恢復到室內空氣（濃度21%的氧氣）[28]。P7～P12高氧迅速引起小鼠視網膜血管閉塞，并在高氧后48 h達到峰值。由于發育中的視網膜對氧氣需求增加，血管閉塞區的血運從P9～P12開始重建，出現的病理性視網膜新生血管主要分布在無血管區和血管區交界處，在P17時最為明顯，隨后新生血管開始消退，直到P25時新生血管幾乎完全消失。中心血管閉塞和視網膜新生血管化緊密相關，前者在很大程度上決定了后者的時間進程和嚴重性[29]，兩者都可以在視網膜平面上進行評測。
新生血管的定量分析主要采用全視網膜鋪片的免疫熒光染色，共聚焦觀察并定量分析新生血管團簇的面積；也可采用蘇木精-伊紅染色病理切片，在光學顯微鏡下計數內界膜玻璃體側的新生血管細胞核來定量新生血管化[29]。然而傳統的定量方法難以將缺血誘導的新生血管和先前存在的視網膜脈管系統區分開，近期有研究報道了一種更加客觀的來量化視網膜新生血管的方法，胸苷類似物5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）可以用于標記新合成的DNA，在P11后持續給予OIR小鼠腹腔注射100mg / kg BrdU至安樂死，再結合內皮細胞特異性標志物對視網膜進行熒光染色，則可以在共聚焦下觀察到已被標記的增生的內皮細胞，為視網膜新生血管的客觀量化以及抗新生血管干預方法的效果評估提供了一種靈敏高效的方法[30]。
OIR大鼠多采用高氧-低氧交替方式進行誘導，van Wijngaarden等[31]將出生后大鼠置于高氧環境中11～14 d，隨后置于常氧狀態飼養，在P18時視網膜出現星形細胞變性，內核層及內從狀層厚度降低，并出現新生血管。Soetikno等[32]將出生后大鼠置于濃度50%與10%氧交替暴露的環境下，14 d時恢復到正常氧環境，缺氧-再灌注導致大鼠出現視網膜新生血管。與小鼠相比，大鼠模型的視網膜新生血管形成不穩定，可能會偶發視網膜脫離。但大鼠模型的優勢在于新生血管特征與ROP相似，血管閉塞和新生血管的形成主要出現在視網膜周邊部，而小鼠模型的血管閉塞和新生血管發生在視網膜中央區[33]。
2.2 斑馬魚OIR模型
斑馬魚OIR模型建立方法是將斑馬魚置于常氧水中，然后在48～72 h內逐漸降低氧分壓至10%，在這種環境中維持15 d，暴露后新生血管明顯增多，視網膜新生血管在P12時達到高峰[34]。Cao等[35]對斑馬魚采用口服給藥的方式進行抗新生血管藥物的研究，發現給藥方便簡單易操作。但與嚙齒類動物相比，斑馬魚模型尚未廣泛應用，缺乏豐富的研究基礎。
3 自發遺傳性模型
自發遺傳性模型與人類糖尿病發病進展最為接近，多采用有自發性糖尿病傾向的純種動物，按照對應的飼養方式進行喂養使其成模。目前自發性T1DM模型有NOD小鼠、Ins2akita小鼠和BB大鼠；自發性T2DM模型有db/db小鼠、KKAy小鼠、OLETF大鼠、GK大鼠、ZDF大鼠、SDT大鼠和WBN/Kob大鼠等[3]。其中Ins2akita小鼠和db/db小鼠模型在DR研究中應用廣泛。
Ins2akita小鼠是一種自發的T1DM模型，由于胰島素2基因的錯義突變導致胰島素蛋白的構象變化，蛋白在胰島β細胞中積累致β細胞死亡。4周時小鼠血糖水平顯著升高；高血糖8周后小鼠血管壁白細胞增多，星形膠質細胞和小膠質細胞形態發生改變；高血糖12周后視網膜血管通透性增加[36]；高血糖3個月后RGC軸突和樹突減少[37]；高血糖22周后視網膜內叢狀層和內核層厚度減少；高血糖36周后無細胞毛細血管增加[36]。Ins2akita小鼠可在短時間內檢測到RGC丟失，有助于研究DR早期進展的分子機制并用于評估藥物的神經保護作用[37]。
db/db小鼠是一種自發的T2DM模型，由于小鼠缺乏瘦素受體，出生后4～8周便自發發展為與肥胖相關的糖尿病，通常于10個月時死于胰島嚴重枯竭和心肌疾病。純合子動物表現為慢性高血糖癥、病態肥胖和胰腺β細胞萎縮，最終出現低胰島素血癥。出生6周后，db/db小鼠視網膜中央的RGC數量減少[38]；15周時周細胞丟失和內細胞丟失，基底膜增厚，血視網膜屏障破壞，神經細胞凋亡，膠質細胞重新激活，反應性神經膠質增生。由于該模型突變體的易獲得性，db/db小鼠現已成為研究DR早期發病機制的一種動物模型[39]。
4 基因模型
動物基因模型是一項具有前景的新型誘導技術，通過轉基因、基因敲除和誘發突變等方法尋找DR相關基因在發病及治療中的作用。目前常用的轉基因動物模型包括IR/IRS-1基因敲除雜合小鼠、Kimba小鼠和Akimba小鼠。
Kimba小鼠是一種轉基因的視網膜新生血管模型，由光感受器細胞中暫時過表達的VEGF所誘導。小鼠P7時可出現神經節細胞層、內核層，外核層和整個視網膜層的厚度降低；小鼠P28時出現視網膜微血管瘤和血管滲漏[40]；6周時，在小鼠的靜脈和毛細血管中發現黏附的白細胞和無細胞毛細血管數量增加；9周時血管紆曲和周細胞丟失明顯，但由于VEGF的表達水平逐漸下降，血管滲漏在9周后不再繼續[41]。Kimba小鼠缺乏高血糖背景，該模型的視網膜新生血管與高血糖癥無相關性[42]。
由于Kimba小鼠模型的局限性，有學者通過雜交Kimba小鼠與自發性T1DM模型Ins2Akita小鼠，創建了Akimba模型；其特點是具有兩個親本模型的相加效應，具有高血糖及晚期DR的特征[42]。在8周內出現微動脈瘤，新生血管形成，毛細血管出血、紆曲擴張和滲漏，光相干斷層掃描檢查顯示Akimba小鼠視網膜水腫，光感受器層厚度降低和視網膜脫離；24周時小鼠的RGC數量和神經節細胞層厚度降低，視網膜電圖暗視a波和b波振幅顯著降低[43]。熒光素眼底血管造影檢查發現8周和22～24周的Ins2Akita小鼠均未出現熒光素滲漏改變，Kimba小鼠和Akimba小鼠均出現熒光素滲漏，且Akimba小鼠中由VEGF與高血糖水平相結合所導致的熒光素滲漏改變比Kimba小鼠更嚴重[43-44]。
5 DR模型的比較
誘發性模型是目前最常用于DR研究的動物模型，具有耗時短、成本低、方法簡便、重復性較好和短期內可批量造模等優點。研究者可使用該模型探究DR發病過程中不同細胞、不同病變過程的差異，檢測方法和指標較為明確。但誘發性模型所使用的藥物對實驗動物的全身各器官均有一定的毒副作用，動物死亡風險較大。此外，STZ、四氧嘧啶和高半乳糖飲食誘導均只能模擬NPDR的特征，無法用于PDR病變特征的研究。
OIR模型的表型重復性好、穩定性高且成本相對較低，最典型的優點是具有人類PDR的關鍵特征。OIR模型是由視網膜微血管損傷引起視網膜缺氧，隨后病理性新生血管長入玻璃體腔導致出血，且新生血管的面積可以進行定量分析[30]，因此在抗新生血管藥物的研發中OIR模型發揮重要作用[34-35]，并表現出與血管疾病相關的神經膠質和神經元的損傷[45]。但由于OIR小鼠缺乏全身性高血糖的代謝改變，此模型無法準確反映高血糖狀態下由于代謝情況對視網膜病變的影響。
自發模型的實驗動物具有相同的遺傳背景，可以利用該模型對多種致病因素進行分析。此外，該模型的病理改變較為穩定，具有高血糖和眼部病變的特點，適用于包括視網膜血管滲漏和膠質細胞改變在內的多種病理改變的探究。但由于價格昂貴，且同系繁殖和單基因遺傳會使其糖尿病的遺傳同質性與人類有差異，限制了該模型的廣泛應用。
基因模型的優點是病因明確，模型動物間表現的差異小，不影響其他組織，如化學誘導劑的細胞毒性作用。但也存在明顯的缺點，如對技術、實驗操作和實驗儀器要求高，成本高不適合大批量造模，因此在應用中受到限制。
DR是一種較為復雜的糖尿病微血管并發癥，目前尚沒有某種動物模型可以完全模擬DR的全部發病過程，因此需要研究者根據實驗目的和所探究的指標來選擇合適的動物模型（表2）。
表2
常見DR動物模型分類
6 小結與展望
現階段大多數的DR動物模型較好地模擬了人類DR疾病的早期階段，具有PDR視網膜新生血管特征的動物模型較少，因此限制了疾病晚期的治療研究。目前針對視網膜新生血管、視網膜出血和水腫已開發出抗VEGF藥物，但DR是一種可防不可治愈的致盲疾病，應在疾病的早期尋找到致病的關鍵靶點，從而減緩或抑制疾病的進一步進展。研究者應從特定的研究目的、觀察指標、實驗條件和經費等多方面綜合考量，結合DR模型的特點和局限性，從而選擇最佳的動物模型。此外，仍需開發能夠更精確模擬DR的動物模型，以擴展對DR機制的探索，為研發可行的預防和治療方法提供更加有效的工具。
