引用本文： 胡立影, 李志清, 張琰, 邵先鋒, 郭小雪, 于大為, 李筱榮. 非動脈炎性前部缺血性視神經病變模型大鼠視網膜蛋白質組學定量分析. 中華眼底病雜志, 2021, 37(3): 206-213. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201124-00522 復制
非動脈炎性前部缺血性視神經病變（NAION）早期表現為視盤充血水腫，隨病程進展出現視網膜神經節細胞及其軸突丟失，最終導致視神經萎縮[1-2]。目前NAION發病機制尚不清楚，炎性反應、氧化應激、谷氨酸誘導的興奮性毒性以及某些藥物的副作用可能在NAION的發病中起到重要作用[3-5]。蛋白質組學是獲取生物體內蛋白質信息的最新研究技術，可用于研究疾病的發病機制及發展過程，從而尋找新的治療靶點。近年來已應用到多種眼部疾病的研究中，如糖尿病視網膜病變、青光眼和角膜病變等[6-8]，但有關NAION的蛋白質組學相關研究鮮見報道。SWATH（sequential windowed acquisition of all theoretical mass spectra）是近年出現的新型蛋白質組質譜定量技術[9]，與傳統蛋白質組定量方法比較，其定量準確性、靈敏度及蛋白鑒定覆蓋率更高，重復性更好，對樣品需求量及樣本處理技術要求更低[10-11]。本研究應用SWATH定量質譜技術對NAION模型大鼠視網膜蛋白表達譜進行分析，篩選差異表達蛋白，并初步分析差異表達蛋白在NAION發生發展中的作用，為進一步研究NAION的發病機制、尋找治療靶點奠定實驗基礎。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及實驗動物
Spargue-Dawley大鼠20只，鼠齡8周，體重220～250 g，無特定病原體級，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供［動物生產許可證號SCXK（京）2016-0006］。大鼠飼養于天津醫科大學眼科醫院研究所，均置于同一間動物房，溫度控制在20～22 ℃，12 h循環光照，自由飲食。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會許可（倫理編號TJYY2021041029）。所有大鼠實驗前經散瞳檢查排除眼部疾病。
1.2 分組、建模
根據隨機數字表法將大鼠分為正常對照組、NAION動物（rNAION）模型組、單純激光照射組、單純光敏劑孟加拉玫瑰紅（RB）注射組（單純光敏劑RB組），每組各為5只，均以右眼為實驗眼。
rNAION模型組大鼠采用光動力療法建立rNAION模型[12-13]。按體重0.35 ml/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，丙美卡因點眼表面麻醉。采用美國Lumenis公司532眼底激光機（Novus Spectra），激光波長532 nm，能量50 mW，光斑直徑500 μm。按體重1 ml/kg的劑量經鼠尾靜脈注入2.5 mmol/L光敏劑RB（美國Sigma公司）并對準視盤上2/3區域照射12 s。注射RB溶液至激光照射結束時間控制在1 min以內。建模后3 d，行裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、熒光素眼底血管造影（FFA）檢查，以大鼠出現視神經水腫為建模成功；排除眼底出血、視網膜脫離等其他眼底病變。單純激光照射組，僅對視盤進行激光照射，參數設置同rNAION模型組；單純光敏劑RB組，僅注射RB溶液，注射劑量同rNAION模型組；正常對照組不給予任何處理。
建模后3 d，大鼠深度麻醉后摘除眼球，置于冰上，摘除其眼前節，取出晶狀體和玻璃體，鈍性分離視網膜，置于液氮中，?80 ℃冰箱凍存。
1.3 樣本制備及蛋白質譜分析
提取大鼠視網膜組織蛋白，裂解后冰上超聲破碎、離心、二喹啉甲酸法測濃度，經還原、烷基化后加入胰酶，終止酶切后制成肽段，取2 μg進行質譜定量檢測。高效液相分離后行一級質譜和二級質譜分析，使用SWATH Variable Window Calculator_V1.1程序計算每個可變窗口的質量范圍。應用ProteinPilot軟件（版本5.0.1）對原始數據進行檢索，將其結果導入Peakview軟件內置的SWATH（版本2.0）插件中，選擇對應的SWATH原始數據。每個蛋白選取6個肽段，每個肽段選取6個翻譯數肽段，可信度設置為99%，假陽性率設置為1%，排除修飾肽段，峰提取窗口10 min，質量偏差＜50 ppm。使用Bioconducter軟件包pheatmap繪制差異表達蛋白的基因熱圖。
1.4 差異表達蛋白篩選
使用R語言stats包篩選rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組、正常對照組差異表達蛋白，篩選標準為差異表達倍數＞1.5且P＜0.05。與正常對照組比較，鑒定rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組差異表達蛋白；rNAION模型組與正常對照組比較的差異表達蛋白中，去除單純激光照射組、單純光敏劑RB組與正常對照組比較的差異表達蛋白。繪制韋恩圖和火山圖。
1.5 統計學分析
對蛋白質原始定量值進行log2轉換，使其滿足正態分布。所有蛋白質組學數據的生物信息學統計分析使用R軟件（版本3.5.3）preprocess Core包進行。采用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析對各組間蛋白表達進行差異分析，篩選差異表達倍數＞1.5且P＜0.05的蛋白作為差異蛋白，使用corrplot包進行Pearson相關性分析，并進行基因注釋（GO）分析以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路顯著性富集分析、加權基因共表達網絡分析（WGCNA）。所有統計檢驗均為雙側，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
FFA檢查結果顯示，rNAION模型組大鼠可見視盤熒光素滲漏（圖1A），建模成功；單純激光照射組、單純光敏劑RB組、正常對照組大鼠均未見視盤熒光素滲漏（圖1B～1D）。
圖1
建模后3 d不同組別大鼠視神經熒光素眼底血管造影像。1A示非動脈炎性前部缺血性視神經病變動物模型組，大鼠視盤可見熒光素滲漏；1B~1D分別示單純激光照射組、單純光敏劑孟加拉玫瑰紅組、正常對照組，大鼠視盤未見熒光素滲漏
Pearson相關性分析結果顯示，rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組分別與正常對照組比較，樣本相關性系數均≥0.9（圖2A）。這提示蛋白質組學分析樣本間的一致性良好。與正常對照組比較，rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組同時表達的差異蛋白為25個，僅在3個組表達的差異蛋白分別為184、96、101個（圖2B）。
圖2
定量蛋白質組學分析結果。2A示rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組、正常對照組Pearson相關分析組內相關系數；2B示韋恩圖；2C示聚類熱圖，下方為差異表達蛋白基因，紅色表示上調蛋白，藍色表示下調蛋白，顏色深淺代表變化幅度大小；2D示火山圖，rNAION模型組與單純激光照射組、單純光敏劑RB組、正常對照組比較差異變化倍數較高的多種蛋白；紅點表示上調蛋白，綠點表示下調蛋白。rNAION：非動脈炎性前部缺血性視神經病變動物；AION：前部缺血性視神經病；RB：孟加拉玫瑰紅；LC：單純激光照射；N：正常組動物
rNAION模型組共篩選出差異表達倍數＞1.5且P＜0.05的蛋白184個（圖2C）。其中，上調蛋白99個，包括染色質可及性復合體1、鳥嘌呤核苷酸交換因子亞基RIC1、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白4（GNG4）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、層粘連蛋白（LAMC）1、14-3-3γ蛋白YWHAG、鋅指蛋白744、前梯度蛋白2、簇集蛋白、Ⅳ型膠原蛋白基因α1、胞質羧肽酶1（AGTPBP1）等；下調蛋白85個，包括Rho相關三磷酸鳥苷（GTP）結合蛋白RHOC、富含亮氨酸膠質瘤失活蛋白1（LGI1）、神經視網膜特定亮氨酸拉鏈蛋白、組蛋白脫乙酰基酶2（HDAC2）、分泌載體膜蛋白（SCAMP）5、網格蛋白外套蛋白AP180（SNAP91）、RNA聚合酶Ⅱ轉錄介體亞基21（MED21）、1-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶D1、F-box蛋白家族30等（圖2D）。
GO功能富集分析結果顯示，細胞成分方面，細胞外外泌體、光感受器外節、囊泡、中間絲、神經絲、突觸、細胞膜、細胞質及線粒體等被顯著富集（P＜0.05）；細胞功能方面，Rab-GTP家族蛋白結合、蛋白結合、絲氨酸蛋白酶抑制劑活性、多聚RNA結合、泛素蛋白連接酶活性、GTP激酶激活活性、結構分子活性、金屬離子結合等被顯著富集（P＜0.05）；生物學過程方面，急性反應、金屬離子反應、突觸可塑性調節、生長發育、凋亡及炎癥反應等被顯著富集（P＜0.05）（圖3）。
圖3
差異表達蛋白參與的生物學進程、細胞成分、分子功能的基因注釋富集分析結果
KEGG信號通路富集分析結果顯示，NAION主要參與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、補體和凝血酶聯反應、免疫反應、信號轉導等通路（圖4）。
圖4
京都基因與基因組百科全書的信號通路富集分析結果。差異蛋白參與的信號通路。ECM：細胞外基質；PI3K/Akt：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B
WGCNA結果顯示，與NAION相關性最高的上調蛋白為AGTPBP1、Ral GTPase激活蛋白亞基β、轉移相關蛋白MTA2、E3泛素蛋白連接酶LRSAM1、三結構域蛋白67，下調蛋白為SNAP91、SCAMP5、HDAC2、線粒體解偶聯蛋白4、MED21等。上調蛋白參與的分子功能包括神經傳導、生長發育、細胞代謝、蛋白質合成與分解、信號轉導等；下調蛋白參與的分子功能包括囊泡介導的轉運、能量代謝、神經發育、細胞代謝、離子通道運輸等（圖5）。
圖5
WGCNA結果。5A示非動脈炎性前部缺血性視神經病變（NAION）動物模型組差異表達蛋白分布于20個顏色模塊中，其中紅色、綠色模塊中的蛋白與NAION相關性最高，綠色表示富集的上調蛋白，紅色表示富集的下調蛋白。AION：前部缺血性視神經病；RB：孟加拉玫瑰紅；LC：單純激光照射；N：正常組動物；RB：孟加拉玫瑰紅。5B示上調蛋白參與的生物學功能。1. 軸突轉運；2. 有機磷酸酯生物合成過程；3. 黃體酮受體信號通路；4. 細胞器官組織的正調控；5. 樹突運輸；6. 細胞生長發育；7. 磷脂代謝過程的調節；8. 調節細胞成分的大小；9. 酰基輔酶A代謝過程；10. 染色體組織調節；11. 蛋白質穩定性調節；12. 脫磷酸化作用；13. 參與細胞蛋白分解代謝過程的蛋白質水解的調節；14. 染色質的組裝或拆卸；15. mRNA加工；16. 蛋白質脫乙酰作用；17. 磷脂代謝過程；18. 蛋白質位置的維持；19. 受體簇；20. 生理性肌肉肥大。 5C示下調蛋白參與的生物學功能。1. 突觸中囊泡介導的轉運；2. 囊泡介導轉運的調節；3. 線粒體跨膜轉運；4. 高爾基體的囊泡轉運；5. 對甲狀腺球蛋白三碘甲狀腺原氨酸的反應；6. 二價金屬離子的轉運；7. 溶酶體組織；8. 神經發生的正調節；9. 突觸后特殊結構的維持；10. 視覺感知；11. 細胞對葡萄糖饑餓的反應；12. 蛋白酶體蛋白分解代謝過程；13. 基于肌動蛋白的過程；14. 碳水化合物的轉運；15. 蛋白質酰化；16. 細胞分解代謝過程的調節；17. 細胞對碳水化合物刺激的反應；18. 胰島素受體信號通路；19. 鐵離子傳輸；20. 藥物運輸金屬離子的轉運；7. 溶酶體組織；8. 神經發生的正調節；9. 突觸后特殊結構的維持；10. 視覺感知；11. 細胞對葡萄糖饑餓的反應；12. 蛋白酶體蛋白分解代謝過程；13. 基于肌動蛋白的過程；14. 碳水化合物的轉運；15. 蛋白質酰化；16. 細胞分解代謝過程的調節；17. 細胞對碳水化合物刺激的反應；18. 胰島素受體信號通路；19. 鐵離子傳輸；20. 藥物運輸。rNAION：非動脈炎性前部缺血性視神經病變動物；AION：前部缺血性視神經病；RB：孟加拉玫瑰紅；LC：單純激光照射；N：正常組動物；RB：孟加拉玫瑰紅。
3 討論
NAION是臨床常見視神經病變，蛋白質組學技術是探究生物體內與疾病相關致病蛋白及尋找治療靶點的一種重要技術手段，然而目前NAION蛋白質組學的相關研究鮮見報道。許多研究均已證實該模型可模擬NAION的病理過程，為NAION的相關基礎研究提供幫助[3, 12, 14-15]。本研究采用SWATH技術對NAION急性期大鼠模型的視網膜進行蛋白質組學分析，從而尋找NAION相關的生物學標記物。Fard等[16]發現，在嚙齒動物缺血性視神經病變發生后8 d時有43%的神經節細胞丟失，而臨床中絕大多數患者為急性期就診患者，因此我們選擇的取材時間點定于造模后第3天來模擬急性期NAION的病理過程。
本研究結果顯示，rNAION模型組上調蛋白、下調蛋白變化明顯的分別為GFAP、GNG4、LAMC1、YWHAG等和LGI1、SNAP91、SCAMP5等。其中，GFAP在哺乳動物中被用作視網膜和視神經星形膠質細胞的標志物，在缺血再灌注、外傷性視神經病變及青光眼的視神經中，GFAP陽性細胞的密度顯著增加[17-19]。這說明膠質細胞激活。本研究中GFAP蛋白表達上調，這提示膠質細胞激活參與了NAION的發病過程。
PI3K/AKT信號通路在高眼壓、視神經炎、缺血缺氧性腦損傷及神經退行性病變造成的神經損害方面發揮著重要作用[20-22]。本研究富集分析結果顯示，PI3K/AKT信號通路在NAION疾病中發揮重要作用，涉及的候選蛋白有GNG4、LAMC1及YWHAG。LAMC是一種細胞外基質蛋白，通過在施旺細胞表面組裝基底膜以促進周圍神經髓鞘形成[23]，LAMC1參與神經元的發育。既往研究表明，LAMC1在斑馬魚視杯形態發生過程起重要作用，干擾LAMC1蛋白功能損害基底收縮力和視杯折疊[24]。囊胚的神經發育受復雜轉錄程序的嚴格調控，LAMC1蛋白表達失調與轉錄因子Rest表型異常密切相關，從而影響胚胎干細胞神經發育過程中多能基因的表達[25]。此外，LAMC1蛋白還可通過PI3K/AKT通路參與腫瘤細胞增生和代謝等多種過程[26]。GNG4是幾種跨膜信號系統的調制器和換能器[27]，在止血和胰高血糖素反應中發揮重要作用[28]，目前尚無其在眼部功能的研究報道。GNG4在神經發育過程中具有重要意義，是衰老過程中認知功能下降的神經遞質途徑基因, 與阿爾茨海默病密切相關，并且在膠質母細胞瘤發生發展中具有抑制腫瘤細胞生長的作用[29-30]。YWHAG蛋白屬于蛋白質14-3-3家族，通過與絲氨酸蛋白磷酸化的相互作用參與信號轉導[31]。其在中樞神經系統中高度表達，通過影響皮質發育和神經元遷移來參與神經系統發育[32-33]。YWHAG蛋白表達異常可引起智力障礙、癲癇、自閉癥及阿爾茨海默病等[34-36]。此外，YWHAG蛋白上調可抑制膠質母細胞瘤細胞活力、增生、遷移、侵襲和有絲分裂[37]。目前未見YWHAG蛋白在人類眼部的研究報道，但在小鼠視網膜中可檢測到其表達[38]。我們推測，GNG4、LAMC1、YWHAG蛋白等可能與NAION發病后神經細胞再生與修復過程密切相關。
rNAION模型組表達下降的蛋白有LGI1、SNAP91、SCAMP5。LGI1蛋白是一種分泌蛋白，定位于谷氨酸能突觸，可影響軸突的再生和樹突修剪，在神經系統發育中起著至關重要的作用[39-40]，在NAION中可能與視神經損傷后軸突再生功能相關。此外，NAION發生時患眼出現視盤水腫，軸漿流運輸障礙[15]。因此，與突觸囊泡運輸功能相關的蛋白表達往往出現異常，如SNAP91、SCAMP5。SNAP91可編碼一種突觸相關蛋白，人體不同部位均有表達，其在大腦中表達最高[41]。既往研究結果表明，SNAP91與帕金森及精神分裂癥的發病具有一定相關性[39, 42]；表達水平降低與膠質瘤發病亦密切相關，且與病變等級呈負相關[43]。SCAMP是一類完整的膜蛋白家族，在動物體內普遍表達，并且在分泌膜中含量很高[44]。SCAMP5在神經元中高表達, 高濃度匯聚于突觸小泡中[45]。SCAMP5的降低可表現出明顯的突觸抑制，其功能障礙可改變大腦神經元網絡的興奮和（或）抑制平衡，從而可導致自閉癥、癲癇發作[46-47]。目前雖缺乏SCAMP5在眼部的研究報道，但其未來有可能成為新的研究靶點。
本研究存在的不足：（1）rNAION模型尚不能完全模擬NAION患者疾病發病過程。（2）蛋白質組學技術本身存在局限性，如不能全部檢出生物體內的蛋白，并且檢出的蛋白存在假陽性的可能等，本研究未能進行個體蛋白的功能驗證，我們后續將根據差異蛋白表達倍數及其生物學功能選擇靶蛋白進一步進行驗證。（3）本研究僅進行了急性期蛋白質組學分析，未進行慢性期蛋白質組學分析，尚不能觀察差異蛋白的動態發展變化，并會遺漏部分僅表達于慢性期的差異蛋白。
非動脈炎性前部缺血性視神經病變（NAION）早期表現為視盤充血水腫，隨病程進展出現視網膜神經節細胞及其軸突丟失，最終導致視神經萎縮[1-2]。目前NAION發病機制尚不清楚，炎性反應、氧化應激、谷氨酸誘導的興奮性毒性以及某些藥物的副作用可能在NAION的發病中起到重要作用[3-5]。蛋白質組學是獲取生物體內蛋白質信息的最新研究技術，可用于研究疾病的發病機制及發展過程，從而尋找新的治療靶點。近年來已應用到多種眼部疾病的研究中，如糖尿病視網膜病變、青光眼和角膜病變等[6-8]，但有關NAION的蛋白質組學相關研究鮮見報道。SWATH（sequential windowed acquisition of all theoretical mass spectra）是近年出現的新型蛋白質組質譜定量技術[9]，與傳統蛋白質組定量方法比較，其定量準確性、靈敏度及蛋白鑒定覆蓋率更高，重復性更好，對樣品需求量及樣本處理技術要求更低[10-11]。本研究應用SWATH定量質譜技術對NAION模型大鼠視網膜蛋白表達譜進行分析，篩選差異表達蛋白，并初步分析差異表達蛋白在NAION發生發展中的作用，為進一步研究NAION的發病機制、尋找治療靶點奠定實驗基礎。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及實驗動物
Spargue-Dawley大鼠20只，鼠齡8周，體重220～250 g，無特定病原體級，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供［動物生產許可證號SCXK（京）2016-0006］。大鼠飼養于天津醫科大學眼科醫院研究所，均置于同一間動物房，溫度控制在20～22 ℃，12 h循環光照，自由飲食。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會許可（倫理編號TJYY2021041029）。所有大鼠實驗前經散瞳檢查排除眼部疾病。
1.2 分組、建模
根據隨機數字表法將大鼠分為正常對照組、NAION動物（rNAION）模型組、單純激光照射組、單純光敏劑孟加拉玫瑰紅（RB）注射組（單純光敏劑RB組），每組各為5只，均以右眼為實驗眼。
rNAION模型組大鼠采用光動力療法建立rNAION模型[12-13]。按體重0.35 ml/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，丙美卡因點眼表面麻醉。采用美國Lumenis公司532眼底激光機（Novus Spectra），激光波長532 nm，能量50 mW，光斑直徑500 μm。按體重1 ml/kg的劑量經鼠尾靜脈注入2.5 mmol/L光敏劑RB（美國Sigma公司）并對準視盤上2/3區域照射12 s。注射RB溶液至激光照射結束時間控制在1 min以內。建模后3 d，行裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、熒光素眼底血管造影（FFA）檢查，以大鼠出現視神經水腫為建模成功；排除眼底出血、視網膜脫離等其他眼底病變。單純激光照射組，僅對視盤進行激光照射，參數設置同rNAION模型組；單純光敏劑RB組，僅注射RB溶液，注射劑量同rNAION模型組；正常對照組不給予任何處理。
建模后3 d，大鼠深度麻醉后摘除眼球，置于冰上，摘除其眼前節，取出晶狀體和玻璃體，鈍性分離視網膜，置于液氮中，?80 ℃冰箱凍存。
1.3 樣本制備及蛋白質譜分析
提取大鼠視網膜組織蛋白，裂解后冰上超聲破碎、離心、二喹啉甲酸法測濃度，經還原、烷基化后加入胰酶，終止酶切后制成肽段，取2 μg進行質譜定量檢測。高效液相分離后行一級質譜和二級質譜分析，使用SWATH Variable Window Calculator_V1.1程序計算每個可變窗口的質量范圍。應用ProteinPilot軟件（版本5.0.1）對原始數據進行檢索，將其結果導入Peakview軟件內置的SWATH（版本2.0）插件中，選擇對應的SWATH原始數據。每個蛋白選取6個肽段，每個肽段選取6個翻譯數肽段，可信度設置為99%，假陽性率設置為1%，排除修飾肽段，峰提取窗口10 min，質量偏差＜50 ppm。使用Bioconducter軟件包pheatmap繪制差異表達蛋白的基因熱圖。
1.4 差異表達蛋白篩選
使用R語言stats包篩選rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組、正常對照組差異表達蛋白，篩選標準為差異表達倍數＞1.5且P＜0.05。與正常對照組比較，鑒定rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組差異表達蛋白；rNAION模型組與正常對照組比較的差異表達蛋白中，去除單純激光照射組、單純光敏劑RB組與正常對照組比較的差異表達蛋白。繪制韋恩圖和火山圖。
1.5 統計學分析
對蛋白質原始定量值進行log2轉換，使其滿足正態分布。所有蛋白質組學數據的生物信息學統計分析使用R軟件（版本3.5.3）preprocess Core包進行。采用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析對各組間蛋白表達進行差異分析，篩選差異表達倍數＞1.5且P＜0.05的蛋白作為差異蛋白，使用corrplot包進行Pearson相關性分析，并進行基因注釋（GO）分析以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路顯著性富集分析、加權基因共表達網絡分析（WGCNA）。所有統計檢驗均為雙側，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
FFA檢查結果顯示，rNAION模型組大鼠可見視盤熒光素滲漏（圖1A），建模成功；單純激光照射組、單純光敏劑RB組、正常對照組大鼠均未見視盤熒光素滲漏（圖1B～1D）。
圖1
建模后3 d不同組別大鼠視神經熒光素眼底血管造影像。1A示非動脈炎性前部缺血性視神經病變動物模型組，大鼠視盤可見熒光素滲漏；1B~1D分別示單純激光照射組、單純光敏劑孟加拉玫瑰紅組、正常對照組，大鼠視盤未見熒光素滲漏
Pearson相關性分析結果顯示，rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組分別與正常對照組比較，樣本相關性系數均≥0.9（圖2A）。這提示蛋白質組學分析樣本間的一致性良好。與正常對照組比較，rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組同時表達的差異蛋白為25個，僅在3個組表達的差異蛋白分別為184、96、101個（圖2B）。
圖2
定量蛋白質組學分析結果。2A示rNAION模型組、單純激光照射組、單純光敏劑RB組、正常對照組Pearson相關分析組內相關系數；2B示韋恩圖；2C示聚類熱圖，下方為差異表達蛋白基因，紅色表示上調蛋白，藍色表示下調蛋白，顏色深淺代表變化幅度大小；2D示火山圖，rNAION模型組與單純激光照射組、單純光敏劑RB組、正常對照組比較差異變化倍數較高的多種蛋白；紅點表示上調蛋白，綠點表示下調蛋白。rNAION：非動脈炎性前部缺血性視神經病變動物；AION：前部缺血性視神經病；RB：孟加拉玫瑰紅；LC：單純激光照射；N：正常組動物
rNAION模型組共篩選出差異表達倍數＞1.5且P＜0.05的蛋白184個（圖2C）。其中，上調蛋白99個，包括染色質可及性復合體1、鳥嘌呤核苷酸交換因子亞基RIC1、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白4（GNG4）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、層粘連蛋白（LAMC）1、14-3-3γ蛋白YWHAG、鋅指蛋白744、前梯度蛋白2、簇集蛋白、Ⅳ型膠原蛋白基因α1、胞質羧肽酶1（AGTPBP1）等；下調蛋白85個，包括Rho相關三磷酸鳥苷（GTP）結合蛋白RHOC、富含亮氨酸膠質瘤失活蛋白1（LGI1）、神經視網膜特定亮氨酸拉鏈蛋白、組蛋白脫乙酰基酶2（HDAC2）、分泌載體膜蛋白（SCAMP）5、網格蛋白外套蛋白AP180（SNAP91）、RNA聚合酶Ⅱ轉錄介體亞基21（MED21）、1-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶D1、F-box蛋白家族30等（圖2D）。
GO功能富集分析結果顯示，細胞成分方面，細胞外外泌體、光感受器外節、囊泡、中間絲、神經絲、突觸、細胞膜、細胞質及線粒體等被顯著富集（P＜0.05）；細胞功能方面，Rab-GTP家族蛋白結合、蛋白結合、絲氨酸蛋白酶抑制劑活性、多聚RNA結合、泛素蛋白連接酶活性、GTP激酶激活活性、結構分子活性、金屬離子結合等被顯著富集（P＜0.05）；生物學過程方面，急性反應、金屬離子反應、突觸可塑性調節、生長發育、凋亡及炎癥反應等被顯著富集（P＜0.05）（圖3）。
圖3
差異表達蛋白參與的生物學進程、細胞成分、分子功能的基因注釋富集分析結果
KEGG信號通路富集分析結果顯示，NAION主要參與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、補體和凝血酶聯反應、免疫反應、信號轉導等通路（圖4）。
圖4
京都基因與基因組百科全書的信號通路富集分析結果。差異蛋白參與的信號通路。ECM：細胞外基質；PI3K/Akt：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B
WGCNA結果顯示，與NAION相關性最高的上調蛋白為AGTPBP1、Ral GTPase激活蛋白亞基β、轉移相關蛋白MTA2、E3泛素蛋白連接酶LRSAM1、三結構域蛋白67，下調蛋白為SNAP91、SCAMP5、HDAC2、線粒體解偶聯蛋白4、MED21等。上調蛋白參與的分子功能包括神經傳導、生長發育、細胞代謝、蛋白質合成與分解、信號轉導等；下調蛋白參與的分子功能包括囊泡介導的轉運、能量代謝、神經發育、細胞代謝、離子通道運輸等（圖5）。
圖5
WGCNA結果。5A示非動脈炎性前部缺血性視神經病變（NAION）動物模型組差異表達蛋白分布于20個顏色模塊中，其中紅色、綠色模塊中的蛋白與NAION相關性最高，綠色表示富集的上調蛋白，紅色表示富集的下調蛋白。AION：前部缺血性視神經病；RB：孟加拉玫瑰紅；LC：單純激光照射；N：正常組動物；RB：孟加拉玫瑰紅。5B示上調蛋白參與的生物學功能。1. 軸突轉運；2. 有機磷酸酯生物合成過程；3. 黃體酮受體信號通路；4. 細胞器官組織的正調控；5. 樹突運輸；6. 細胞生長發育；7. 磷脂代謝過程的調節；8. 調節細胞成分的大小；9. 酰基輔酶A代謝過程；10. 染色體組織調節；11. 蛋白質穩定性調節；12. 脫磷酸化作用；13. 參與細胞蛋白分解代謝過程的蛋白質水解的調節；14. 染色質的組裝或拆卸；15. mRNA加工；16. 蛋白質脫乙酰作用；17. 磷脂代謝過程；18. 蛋白質位置的維持；19. 受體簇；20. 生理性肌肉肥大。 5C示下調蛋白參與的生物學功能。1. 突觸中囊泡介導的轉運；2. 囊泡介導轉運的調節；3. 線粒體跨膜轉運；4. 高爾基體的囊泡轉運；5. 對甲狀腺球蛋白三碘甲狀腺原氨酸的反應；6. 二價金屬離子的轉運；7. 溶酶體組織；8. 神經發生的正調節；9. 突觸后特殊結構的維持；10. 視覺感知；11. 細胞對葡萄糖饑餓的反應；12. 蛋白酶體蛋白分解代謝過程；13. 基于肌動蛋白的過程；14. 碳水化合物的轉運；15. 蛋白質酰化；16. 細胞分解代謝過程的調節；17. 細胞對碳水化合物刺激的反應；18. 胰島素受體信號通路；19. 鐵離子傳輸；20. 藥物運輸金屬離子的轉運；7. 溶酶體組織；8. 神經發生的正調節；9. 突觸后特殊結構的維持；10. 視覺感知；11. 細胞對葡萄糖饑餓的反應；12. 蛋白酶體蛋白分解代謝過程；13. 基于肌動蛋白的過程；14. 碳水化合物的轉運；15. 蛋白質酰化；16. 細胞分解代謝過程的調節；17. 細胞對碳水化合物刺激的反應；18. 胰島素受體信號通路；19. 鐵離子傳輸；20. 藥物運輸。rNAION：非動脈炎性前部缺血性視神經病變動物；AION：前部缺血性視神經病；RB：孟加拉玫瑰紅；LC：單純激光照射；N：正常組動物；RB：孟加拉玫瑰紅。
3 討論
NAION是臨床常見視神經病變，蛋白質組學技術是探究生物體內與疾病相關致病蛋白及尋找治療靶點的一種重要技術手段，然而目前NAION蛋白質組學的相關研究鮮見報道。許多研究均已證實該模型可模擬NAION的病理過程，為NAION的相關基礎研究提供幫助[3, 12, 14-15]。本研究采用SWATH技術對NAION急性期大鼠模型的視網膜進行蛋白質組學分析，從而尋找NAION相關的生物學標記物。Fard等[16]發現，在嚙齒動物缺血性視神經病變發生后8 d時有43%的神經節細胞丟失，而臨床中絕大多數患者為急性期就診患者，因此我們選擇的取材時間點定于造模后第3天來模擬急性期NAION的病理過程。
本研究結果顯示，rNAION模型組上調蛋白、下調蛋白變化明顯的分別為GFAP、GNG4、LAMC1、YWHAG等和LGI1、SNAP91、SCAMP5等。其中，GFAP在哺乳動物中被用作視網膜和視神經星形膠質細胞的標志物，在缺血再灌注、外傷性視神經病變及青光眼的視神經中，GFAP陽性細胞的密度顯著增加[17-19]。這說明膠質細胞激活。本研究中GFAP蛋白表達上調，這提示膠質細胞激活參與了NAION的發病過程。
PI3K/AKT信號通路在高眼壓、視神經炎、缺血缺氧性腦損傷及神經退行性病變造成的神經損害方面發揮著重要作用[20-22]。本研究富集分析結果顯示，PI3K/AKT信號通路在NAION疾病中發揮重要作用，涉及的候選蛋白有GNG4、LAMC1及YWHAG。LAMC是一種細胞外基質蛋白，通過在施旺細胞表面組裝基底膜以促進周圍神經髓鞘形成[23]，LAMC1參與神經元的發育。既往研究表明，LAMC1在斑馬魚視杯形態發生過程起重要作用，干擾LAMC1蛋白功能損害基底收縮力和視杯折疊[24]。囊胚的神經發育受復雜轉錄程序的嚴格調控，LAMC1蛋白表達失調與轉錄因子Rest表型異常密切相關，從而影響胚胎干細胞神經發育過程中多能基因的表達[25]。此外，LAMC1蛋白還可通過PI3K/AKT通路參與腫瘤細胞增生和代謝等多種過程[26]。GNG4是幾種跨膜信號系統的調制器和換能器[27]，在止血和胰高血糖素反應中發揮重要作用[28]，目前尚無其在眼部功能的研究報道。GNG4在神經發育過程中具有重要意義，是衰老過程中認知功能下降的神經遞質途徑基因, 與阿爾茨海默病密切相關，并且在膠質母細胞瘤發生發展中具有抑制腫瘤細胞生長的作用[29-30]。YWHAG蛋白屬于蛋白質14-3-3家族，通過與絲氨酸蛋白磷酸化的相互作用參與信號轉導[31]。其在中樞神經系統中高度表達，通過影響皮質發育和神經元遷移來參與神經系統發育[32-33]。YWHAG蛋白表達異常可引起智力障礙、癲癇、自閉癥及阿爾茨海默病等[34-36]。此外，YWHAG蛋白上調可抑制膠質母細胞瘤細胞活力、增生、遷移、侵襲和有絲分裂[37]。目前未見YWHAG蛋白在人類眼部的研究報道，但在小鼠視網膜中可檢測到其表達[38]。我們推測，GNG4、LAMC1、YWHAG蛋白等可能與NAION發病后神經細胞再生與修復過程密切相關。
rNAION模型組表達下降的蛋白有LGI1、SNAP91、SCAMP5。LGI1蛋白是一種分泌蛋白，定位于谷氨酸能突觸，可影響軸突的再生和樹突修剪，在神經系統發育中起著至關重要的作用[39-40]，在NAION中可能與視神經損傷后軸突再生功能相關。此外，NAION發生時患眼出現視盤水腫，軸漿流運輸障礙[15]。因此，與突觸囊泡運輸功能相關的蛋白表達往往出現異常，如SNAP91、SCAMP5。SNAP91可編碼一種突觸相關蛋白，人體不同部位均有表達，其在大腦中表達最高[41]。既往研究結果表明，SNAP91與帕金森及精神分裂癥的發病具有一定相關性[39, 42]；表達水平降低與膠質瘤發病亦密切相關，且與病變等級呈負相關[43]。SCAMP是一類完整的膜蛋白家族，在動物體內普遍表達，并且在分泌膜中含量很高[44]。SCAMP5在神經元中高表達, 高濃度匯聚于突觸小泡中[45]。SCAMP5的降低可表現出明顯的突觸抑制，其功能障礙可改變大腦神經元網絡的興奮和（或）抑制平衡，從而可導致自閉癥、癲癇發作[46-47]。目前雖缺乏SCAMP5在眼部的研究報道，但其未來有可能成為新的研究靶點。
本研究存在的不足：（1）rNAION模型尚不能完全模擬NAION患者疾病發病過程。（2）蛋白質組學技術本身存在局限性，如不能全部檢出生物體內的蛋白，并且檢出的蛋白存在假陽性的可能等，本研究未能進行個體蛋白的功能驗證，我們后續將根據差異蛋白表達倍數及其生物學功能選擇靶蛋白進一步進行驗證。（3）本研究僅進行了急性期蛋白質組學分析，未進行慢性期蛋白質組學分析，尚不能觀察差異蛋白的動態發展變化，并會遺漏部分僅表達于慢性期的差異蛋白。
