引用本文： 李媛, 秦廷玉, 郭龍, 李淑珍, 侯習武. 骨髓間充質干細胞來源的外泌體miR-183靶向調控視網膜脫氫酶11對視網膜色素上皮細胞的影響. 中華眼底病雜志, 2022, 38(8): 688-695. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201119-00574 復制
視網膜色素變性（RP）是以光感受器細胞和視網膜色素上皮（RPE）細胞退行性變為主的視網膜變性疾病，可導致患者出現中樞性視覺喪失甚至失明[1-2]。RP的致盲原因是RPE細胞死亡或在消耗光感受器外節碎片的吞噬過程中失效[3]，而視網膜脫氫酶11（RDH11）也是RP的誘發基因之一[4-5]。研究表明，移植骨髓間充質干細胞（BMSC）是治療視網膜退行性疾病的一種有效策略[6]。BMSC等多種細胞均可分泌外泌體，可通過其攜帶的蛋白質、核酸、脂類等調節受體細胞的生物學活性[7]。研究發現，miR-183簇可在BMSC中增加，并可觸發BMSC對視網膜神經元特別是光感受器細胞的重編程，從而控制RP的發展[8-9]。為進一步探討BMSC來源外泌體（BMSC-exo）對RPE細胞增生、凋亡的可能作用及機制，本研究觀察分析了BMSC-exo上miR-183、RDH11的表達，初步探討兩者靶向關系以及對RPE細胞的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
不同鼠齡C57BL/6（C57）小鼠5只、視網膜變性10（rd10）小鼠25只，雌雄不限，清潔級。其中，C57小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供；rd10小鼠由美國Jackson實驗室提供。小鼠飼養于22 ℃，12 h明/12 h暗循環條件下，濕度45%～55%。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得商丘市第一人民醫院動物倫理委員會許可（倫理編號：20200314）。
C57小鼠5只過量麻醉處死。股骨、脛骨的骨髓細胞置于含10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素的Dulbecco改良Eagle（DMEM）完全培養基中，37 ℃、95%空氣、5%CO2培養箱中培養，每3天換液傳代。取第3代BMSC重新培養，應用磷酸鹽緩沖液（PBS）調節細胞濃度至1×106個/ml（200 μl）。
C57小鼠5只、rd10小鼠5只過量麻醉處死，摘除眼球。參照文獻[10]的方法培養RPE細胞。剝除視網膜，將后眼杯（鞏膜脈絡膜RPE細胞）移至培養皿，速凍。PBS沖洗20次，將包含棕色塊狀釋放物質（RPE細胞）的PBS移到2 ml離心管中，加入1.8 ml RNAlater，靜置10 min，過濾。取第5、6代細胞培養于含20 ng/ml重組表皮生長因子的DMEM培養基中。
1.2 BMSC轉染和分組、外泌體提取和鑒定
BMSC接種于6孔板中，待細胞培養至60%融合時進行轉染。一管中加入250 μl不含血清的DMEM培養基稀釋各轉染序列，室溫混勻靜置5 min；另一管中加入稀釋的5 μl脂質體TM2000于250 μl無血清培養基中。將上述兩管混合，室溫靜置45 min；洗滌細胞2次，加入1.5 ml無抗生素、無血清DMEM培養基。將上述混合物加入6孔板中，37 ℃培養4～6 h后換成完全培養基繼續培養。將BMSC分為空白組、模擬空白對照組（mimic-NC組）、miR-183模擬組（miR-183-mimic組）。空白組加入未轉染的BMSC；mimic-NC組加入轉染miR-183模擬物陰性對照物；miR-183-mimic組加入轉染miR-183模擬物。miR-183模擬物及陰性對照物購于上海吉瑪有限公司。
外泌體提取：各組轉染的BMSC融合至80%～90%時，收集細胞培養液，2000×g離心10 min除去細胞碎片，再經0.45 μg無菌濾膜過濾到15 ml超濾離心管中，4 ℃條件下，2000×g離心10 min，得到外泌體濃縮液。將濃縮液移至15 ml超濾離心管中，4 ℃條件下，100 000×g離心15 min，按照ExoQuick提取試劑盒說明提取外泌體。PBS洗滌沉淀后重新懸浮，－80 ℃冷凍備用。實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測轉染后各組外泌體中miR-183 mRNA相對表達量。
外泌體鑒定：銅網上滴加20 μl外泌體，靜置3 min，滴加30 μl磷鎢酸溶液（pH 6.8）復染5 min加深背景，濾紙去除多余染色劑。透射電子顯微鏡觀察外泌體形態。納米粒度分析檢測粒子直徑。PBS將外泌體稀釋至1 ml體積，注入1 ml注射器中并裝載在納米粒度分析儀載物臺上，檢測粒子直徑。實驗重復3次，取平均值。蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測外泌體表面特異性標志蛋白腫瘤易感基因101（TSG101）、CD63、CD81的表達。二喹啉甲酸（BCA）試劑盒鑒定濃縮外泌體懸液，測定蛋白含量。變性后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行蛋白質分離。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參照。
1.3 RPE細胞外泌體攝取和共培養
RPE細胞外泌體攝取：RPE細胞按照3×104個/孔的細胞密度接種于24孔板中，貼壁后按照蛋白濃度80 μg/ml將PKH26[研載生物科技（上海）有限公司]預染的BMSC-exo加入孔板中，培養0（初始時間）、48 h后將細胞爬片置于4%多聚甲醛中固定20 min，PBS洗3次，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室溫染色1 h，PBS洗3次，抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察拍照。
轉染BMSC-exo與來自rd10小鼠的RPE細胞共培養。以細胞密度5×103個/孔接種于96孔板中，添加基質膠，37 ℃培養24 h，分為對照組、外泌體組、mimic-NC-外泌體組（mimic-NC-exo組）、miR-183-mimic-外泌體組（miR-183-mimic-exo組）。對照組未加入外泌體；外泌體組與未轉染的BMSC-exo共培養；mimic-NC-exo組與轉染miR-183模擬物陰性對照物BMSC-exo共培養；miR-183-mimic-exo組與轉染miR-183模擬物BMSC-exo共培養。
1.4 細胞計數試劑盒8（CCK-8）檢測BMSC-exo上miR-183對RPE細胞增生的影響
來自rd10小鼠的對數生長期RPE細胞以3×103個/孔的細胞密度接種于96孔板中，培養24、48、72 h后，棄上清液后每孔加入10 μl CCK-8試劑孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，繪制生長曲線。實驗重復3次，取平均值。
1.5 qRT-PCR檢測不同來源小鼠RPE細胞和各組小鼠RPE細胞中miR-183、RDH11 mRNA相對表達量
取BMSC-exo與RPE細胞共培養后的RPE細胞，提取總RNA進行反轉錄。按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后進行擴增。采用Premier5.0軟件設計引物（表1）。以U6為miR-183的內參照，以GAPDH為RDH11的內參照；使用標準SYBR-GreenRT-PCR試劑盒[寶日醫生物技術（北京）有限公司]進行檢測，按照2?ΔΔCt計算各組miR-183、RDH11 mRNA的相對表達量。
表1
miR-183、RDH11引物序列
1.6 Western blot檢測對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組RPE細胞中RDH11蛋白相對表達量
采用放射免疫沉淀法裂解緩沖液提取視網膜細胞總蛋白。4 ℃條件下，以離心半徑8 cm、12 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。PAGE分離蛋白并轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入抗體RDH11，4 ℃過夜，辣根過氧化物酶-共軛二抗孵育后行增強化學發光定影、顯影，Image Lab凝膠成像系統成像。以GAPDH作為內參照，進行灰度分析。實驗重復3次，取平均值。
1.7 原位末端標記（TUNEL）法檢測RPE細胞凋亡情況
rd10小鼠20只按照注射外泌體類型分為對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組，各組均為5只小鼠。小鼠腹腔麻醉后右眼視網膜下腔注射1 μl外泌體。注射后7 d，過量麻醉處死小鼠，摘除眼球，視網膜組織采用4%甲醛溶液固定，孵育后Triton X-100進行滲透（0.1% PBS），TUNEL染色，DAPI復染，防淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡觀察RPE細胞形態學變化；掃描共焦顯微鏡觀察RPE細胞凋亡情況。
1.8 生物信息學網站及雙熒光素酶報告分析miR-183與RDH11的靶向關系
應用Jefferson等在線網站對miR-183與RDH11靶向關系結合位點進行預測分析，雙熒光素酶報告基因實驗對其進行驗證。293T細胞于24孔板中培養過夜，將測序正確的熒光素酶報告質粒WT-RDH11、MUT-RDH11和miR-183模擬物及其陰性對照共轉染至細胞中。培養36 h后，螢火蟲/紅紫色熒光雙熒光素酶報告基因測定系統根據說明書計算熒光素酶相對活性。實驗重復3次，取平均值。
1.9 統計學分析
采用SPSS21.0軟件行統計學分析。定量資料以均數±標準差（
）表示。呈正態分布的數據兩兩比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，Tukey's進行事后檢驗；各組間不同時間點數據比較采用重復測量方差分析，Bonferroni進行事后檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同來源小鼠RPE細胞中miR-183、RDH11 mRNA相對表達量比較
與C57小鼠RPE細胞比較，rd10小鼠RPE細胞中miR-183 mRNA相對表達量下調，RDH11 mRNA相對表達量上調，差異均有統計學意義（t=5.230、8.548，P=0.006、0.001）（圖1）。
圖1
rd10小鼠、C57BL/6小鼠RPE細胞中miR-183、RDH11 mRNA相對表達量比較（n=3），*P＜0.05。rd10：視網膜變性10；RPE：視網膜色素上皮
2.2 外泌體鑒定、外泌體中miR-183表達及RPE細胞外泌體的攝入
透射電子顯微鏡觀察發現，BMSC-exo為圓形或橢圓形膜性小囊泡，其內存在低電子密度成分（圖2A）。Western blot檢測結果顯示，與BMSC比較，外泌體表面TSG101、CD63、CD81蛋白表達更明顯（圖2B）。qRT-PCR檢測結果顯示，與空白組、mimic-NC組比較，miR-183-mimics組外泌體中miR-183 mRNA相對表達量顯著上升，差異有統計學意義（F=60.130，P＜0.001）（圖2C）。熒光顯微鏡觀察發現，培養0 h時，外泌體未進入RPE細胞且細胞數較少（圖2D）；24 h時，外泌體進入RPE細胞并沿細胞核膜聚集（圖2E）。
圖2
外泌體鑒定、外泌體中miR-183表達及RPE細胞外泌體攝入結果。2A示透射電子顯微鏡像。外泌體呈圓形或橢圓形膜性小囊泡，囊泡內存在低電子密度成分 ×200。2B示電泳圖。外泌體表達TSG101、CD63、CD81。2C示各組外泌體中miR-183 mRNA相對表達量比較。1～3分別為空白組（n=3）、mimic-NC組、miR-183-mimics組（n=3）。*與mimic-NC組比較，P＜0.05。2D、2F分別示培養0、24 h熒光顯微鏡像。0 h，DAPI標記的RPE細胞呈藍色熒光，外泌體未進入 ×200；24 h，PKH26標記的外泌體呈紅色熒光，沿RPE細胞核膜聚集 ×200。RPE：視網膜色素上皮；TSG101：腫瘤易感基因101；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
2.3 BMSC來源外泌體miR-183對體外RPE細胞增生的影響
qRT-PCR檢測結果顯示，外泌體組、對照組RPE細胞中miR-183 mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（t=1.749，P=0.155）；miR-183-mimic-exo組RPE細胞中miR-183 mRNA相對表達量較mimic-NC-exo組顯著升高，差異有統計學意義（t=7.311，P=0.002）（圖3A）。CCK-8增生分析法結果顯示，共培養后72 h，對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組A值分別為1.00±0.10、1.60±0.10、1.80±0.12、2.40±0.20。與對照組比較，外泌體組RPE細胞增生能力提高，差異有統計學意義（F=9.726，P=0.031）；miR-183-mimic-exo組RPE細胞增生能力較mimic-NC-exo組增強，差異有統計學意義（F=10.949，P=0.012）（圖3B）。
圖3
MSC來源的外泌體miR-183對體外RPE細胞增生的影響。3A示對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組轉染MSC外泌體與RPE細胞共培養后miR-183 mRNA相對表達量比較（n=3）。*與mimic-NC-exo組比較，P＜0.05。3B示4組間不同時間A值比較（n=3）。*與對照組比較，#與mimic-NC-exo組比較，P＜0.05。MSC：骨髓間充質干細胞；RPE：視網膜色素上皮
2.4 BMSC來源的外泌體miR-183對rd10小鼠RPE細胞凋亡的影響
熒光顯微鏡觀察發現，外泌體組RPE細胞凋亡數量較對照組減少，差異有統計學意義（t=4.571，P=0.002）；miR-183-mimic-exo組RPE細胞凋亡數量較mimic-NC-exo組減少，差異有統計學意義（t=4.954，P=0.001）（圖4）。
圖4
BMSC來源的外泌體miR-183對rd10小鼠視網膜組織細胞凋亡的影響。4A示熒光顯微鏡像。活細胞采用DAPI染色顯示藍色熒光，凋亡細胞采用TUNEL染色顯示綠色熒光 ×200。4B示4組間凋亡細胞比較（n=5）。1～4分別為對照組、外泌體組、minic-NC-exo組、miR-183-minic-exo組。*與對照組比較，#與mimic-NC-exo組比較，P＜0.05。BMSC：骨髓間充質干細胞；rd10：視網膜變性10；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；TUNEL：原位末端標記法
2.5 miR-183與RDH11具有靶向關系
雙熒光素酶報告基因實驗驗證結果顯示，生物信息學網站查詢miR-183與RDH11具有結合位點；與mimic-NC組比較，miR-183-mimic組野生型WT-RDH11共轉染組的熒光素酶相對活性下降，差異有統計學意義（t=5.476，P=0.005）；MUT-RDH11的熒光素酶相對活性差異無統計學意義（t=0.316，P＞0.05）（圖5）。
圖5
miR-183與RDH11具有靶向關系。5A示生物信息學Jefferson網站預測miR-183與RDH11的結合位點。5B示mimic-NC組、miR-183-mimic組野生型WT-RDH11與MUT-RDH11的熒光素酶相對活性比較（n=3）。*與mimic-NC組比較，P＜0.05。RDH11：視網膜脫氫酶11
2.6 miR-183可靶向調控RDH11的表達
與mimic-NC組比較，miR-183-mimic組外泌體中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量均降低，差異有統計學意義（t=5.361、6.591，P=0.006、0.003）。共培養后，與對照組比較，外泌體組RPE細胞中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量差異無統計學意義（t=0.169、1.134，P=0.874、0.320）；與mimic-NC-exo組比較，miR-183-mimic-exo組RPE細胞中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量均降低，差異有統計學意義（t=5.554、5.546，P=0.005、0.005）（圖6）。
圖6
miR-183可靶向調控RDH11的表達。6A、6B分別示空白組、mimic-NC組、miR-183-mimic組外泌體中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3）。*與mimic-NC組比較，P＜0.05。6C、6D分別示對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組轉染MSC外泌體與RPE細胞共培養后RDH11 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3）。*與mimic-NC-exo組比較，P＜0.05。RDH11：視網膜脫氫酶11；MSC：骨髓間充質干細胞；RPE：視網膜色素上皮；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶
3 討論
RP是一種慢性、進行性、遺傳性以及營養不良性視網膜退行性變。既往研究已證實，RP病理改變中，桿狀細胞外節盤膜早期即已喪失；細胞外盤膜崩解物殖留，堆積形成一層障礙物，影響營養物質從脈絡膜到達視網膜的運轉，從而引起視細胞進行性營養不良及逐漸的變性和消失[11-12]。RPE細胞可組成RPE層與脈絡膜相連，具有支持和營養光感受器細胞、遮光、散熱以及再生和修復等作用[13]。因此，RPE細胞的消失可能是RP進展的原因之一。間充質干細胞是一種多功能干細胞，具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在臨床應用較多。BMSC可減少視網膜光感受器細胞凋亡，對視網膜損傷具有保護作用[14-15]。外泌體是幾乎所有細胞類型都可產生的一種膜性囊泡，是細胞間通訊的關鍵信使，干細胞來源的外泌體包含多種功能蛋白和信號脂質，通過與細胞膜融合將脂質、核酸、蛋白質等多種生物活性物質傳遞給受體細胞，引起受體細胞功能或活性改變，發揮細胞間物質交換和信息交流的作用[16]。
miRNAs是一類小的、非編碼RNA分子，代表著基因表達的重要調節因子。在細胞指定過程中扮演著“微調子”的角色，以確保在細胞分化的特定階段精確的基因表達[17]。Kinoshita等[18]研究表明，miR-183在視網膜組織形態發生中起著至關重要的作用，可保護視網膜，減少視網膜細胞損傷。多項研究表明，BMSC或BMSC來源的外泌體可恢復或促進miR-183的表達，進而一定程度的減少視網膜變性的發生[19-21]。RDH11存在于小鼠視網膜組織中，可參與氧化應激的調節且是RP的誘發基因之一[4-5]。Xie等[22]研究發現，RDH11的有害突變會導致新的RP綜合征。本研究從BMSC中提取外泌體，使用透射電子顯微鏡、納米顆粒示蹤及Western blot進行鑒定，轉染miR-183模擬物后miR-183-mimics組miR-183表達顯著上升，rd10小鼠RPE細胞中miR-183表達下調，RDH11表達上調。BMSC來源的外泌體與RPE細胞共培養24 h時，外泌體成功進入RPE細胞；與對照組比較，外泌體組RPE細胞中miR-183表達無明顯變化，miR-183-mimic-exo組RPE細胞中miR-183表達較mimic-NC-exo組顯著升高；外泌體組RPE細胞增生能力提高，miR-183-mimic-exo組RPE細胞增生能力較mimic-NC-exo組增強。這提示BMSC來源的外泌體轉染miR-183成功，RPE細胞成功攝入外泌體且BMSC來源的外泌體miR-183能促進RPE細胞的增生。
本研究結果顯示，與對照組比較，外泌體組視網膜組織細胞凋亡較少；miR-183-mimic-exo組視網膜組織細胞凋亡較mimic-NC-exo組減少。這提示BMSC來源的外泌體miR-183能減少視網膜組織細胞的凋亡。生物信息學網站查詢miR-183與RDH11具有結合位點，雙熒光素酶報告結果顯示miR-183與RDH11具有靶向關系。與mimic-NC組比較，miR-183-mimic mRNA及蛋白相對表達量均降低；BMSC來源的外泌體與RPE細胞共培養后，外泌體組RPE細胞中RDH11 mRNA和蛋白相對表達量與對照組比較無明顯變化，miR-183-mimic-exo組RPE細胞中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量較mimic-NC-exo組顯著降低。該結果提示miR-183能靶向調控RDH11的表達。
本研究結果表明，rd10小鼠視網膜RPE細胞中，miR-183表達下調，RDH11表達上調；miR-183與RDH11具有靶向關系；BMSC來源的外泌體miR-183促進RPE細胞體外增生；注射轉染miR-183模擬物的BMSC外泌體減少了rd10小鼠視網膜組織中細胞的凋亡。這說明，從機制上講，上調BMSC來源的外泌體miR-183可能通過靶向抑制RDH11的表達而抑制RP的發展。
視網膜色素變性（RP）是以光感受器細胞和視網膜色素上皮（RPE）細胞退行性變為主的視網膜變性疾病，可導致患者出現中樞性視覺喪失甚至失明[1-2]。RP的致盲原因是RPE細胞死亡或在消耗光感受器外節碎片的吞噬過程中失效[3]，而視網膜脫氫酶11（RDH11）也是RP的誘發基因之一[4-5]。研究表明，移植骨髓間充質干細胞（BMSC）是治療視網膜退行性疾病的一種有效策略[6]。BMSC等多種細胞均可分泌外泌體，可通過其攜帶的蛋白質、核酸、脂類等調節受體細胞的生物學活性[7]。研究發現，miR-183簇可在BMSC中增加，并可觸發BMSC對視網膜神經元特別是光感受器細胞的重編程，從而控制RP的發展[8-9]。為進一步探討BMSC來源外泌體（BMSC-exo）對RPE細胞增生、凋亡的可能作用及機制，本研究觀察分析了BMSC-exo上miR-183、RDH11的表達，初步探討兩者靶向關系以及對RPE細胞的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
不同鼠齡C57BL/6（C57）小鼠5只、視網膜變性10（rd10）小鼠25只，雌雄不限，清潔級。其中，C57小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供；rd10小鼠由美國Jackson實驗室提供。小鼠飼養于22 ℃，12 h明/12 h暗循環條件下，濕度45%～55%。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得商丘市第一人民醫院動物倫理委員會許可（倫理編號：20200314）。
C57小鼠5只過量麻醉處死。股骨、脛骨的骨髓細胞置于含10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素的Dulbecco改良Eagle（DMEM）完全培養基中，37 ℃、95%空氣、5%CO2培養箱中培養，每3天換液傳代。取第3代BMSC重新培養，應用磷酸鹽緩沖液（PBS）調節細胞濃度至1×106個/ml（200 μl）。
C57小鼠5只、rd10小鼠5只過量麻醉處死，摘除眼球。參照文獻[10]的方法培養RPE細胞。剝除視網膜，將后眼杯（鞏膜脈絡膜RPE細胞）移至培養皿，速凍。PBS沖洗20次，將包含棕色塊狀釋放物質（RPE細胞）的PBS移到2 ml離心管中，加入1.8 ml RNAlater，靜置10 min，過濾。取第5、6代細胞培養于含20 ng/ml重組表皮生長因子的DMEM培養基中。
1.2 BMSC轉染和分組、外泌體提取和鑒定
BMSC接種于6孔板中，待細胞培養至60%融合時進行轉染。一管中加入250 μl不含血清的DMEM培養基稀釋各轉染序列，室溫混勻靜置5 min；另一管中加入稀釋的5 μl脂質體TM2000于250 μl無血清培養基中。將上述兩管混合，室溫靜置45 min；洗滌細胞2次，加入1.5 ml無抗生素、無血清DMEM培養基。將上述混合物加入6孔板中，37 ℃培養4～6 h后換成完全培養基繼續培養。將BMSC分為空白組、模擬空白對照組（mimic-NC組）、miR-183模擬組（miR-183-mimic組）。空白組加入未轉染的BMSC；mimic-NC組加入轉染miR-183模擬物陰性對照物；miR-183-mimic組加入轉染miR-183模擬物。miR-183模擬物及陰性對照物購于上海吉瑪有限公司。
外泌體提取：各組轉染的BMSC融合至80%～90%時，收集細胞培養液，2000×g離心10 min除去細胞碎片，再經0.45 μg無菌濾膜過濾到15 ml超濾離心管中，4 ℃條件下，2000×g離心10 min，得到外泌體濃縮液。將濃縮液移至15 ml超濾離心管中，4 ℃條件下，100 000×g離心15 min，按照ExoQuick提取試劑盒說明提取外泌體。PBS洗滌沉淀后重新懸浮，－80 ℃冷凍備用。實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測轉染后各組外泌體中miR-183 mRNA相對表達量。
外泌體鑒定：銅網上滴加20 μl外泌體，靜置3 min，滴加30 μl磷鎢酸溶液（pH 6.8）復染5 min加深背景，濾紙去除多余染色劑。透射電子顯微鏡觀察外泌體形態。納米粒度分析檢測粒子直徑。PBS將外泌體稀釋至1 ml體積，注入1 ml注射器中并裝載在納米粒度分析儀載物臺上，檢測粒子直徑。實驗重復3次，取平均值。蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測外泌體表面特異性標志蛋白腫瘤易感基因101（TSG101）、CD63、CD81的表達。二喹啉甲酸（BCA）試劑盒鑒定濃縮外泌體懸液，測定蛋白含量。變性后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行蛋白質分離。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參照。
1.3 RPE細胞外泌體攝取和共培養
RPE細胞外泌體攝取：RPE細胞按照3×104個/孔的細胞密度接種于24孔板中，貼壁后按照蛋白濃度80 μg/ml將PKH26[研載生物科技（上海）有限公司]預染的BMSC-exo加入孔板中，培養0（初始時間）、48 h后將細胞爬片置于4%多聚甲醛中固定20 min，PBS洗3次，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室溫染色1 h，PBS洗3次，抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察拍照。
轉染BMSC-exo與來自rd10小鼠的RPE細胞共培養。以細胞密度5×103個/孔接種于96孔板中，添加基質膠，37 ℃培養24 h，分為對照組、外泌體組、mimic-NC-外泌體組（mimic-NC-exo組）、miR-183-mimic-外泌體組（miR-183-mimic-exo組）。對照組未加入外泌體；外泌體組與未轉染的BMSC-exo共培養；mimic-NC-exo組與轉染miR-183模擬物陰性對照物BMSC-exo共培養；miR-183-mimic-exo組與轉染miR-183模擬物BMSC-exo共培養。
1.4 細胞計數試劑盒8（CCK-8）檢測BMSC-exo上miR-183對RPE細胞增生的影響
來自rd10小鼠的對數生長期RPE細胞以3×103個/孔的細胞密度接種于96孔板中，培養24、48、72 h后，棄上清液后每孔加入10 μl CCK-8試劑孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，繪制生長曲線。實驗重復3次，取平均值。
1.5 qRT-PCR檢測不同來源小鼠RPE細胞和各組小鼠RPE細胞中miR-183、RDH11 mRNA相對表達量
取BMSC-exo與RPE細胞共培養后的RPE細胞，提取總RNA進行反轉錄。按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后進行擴增。采用Premier5.0軟件設計引物（表1）。以U6為miR-183的內參照，以GAPDH為RDH11的內參照；使用標準SYBR-GreenRT-PCR試劑盒[寶日醫生物技術（北京）有限公司]進行檢測，按照2?ΔΔCt計算各組miR-183、RDH11 mRNA的相對表達量。
表1
miR-183、RDH11引物序列
1.6 Western blot檢測對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組RPE細胞中RDH11蛋白相對表達量
采用放射免疫沉淀法裂解緩沖液提取視網膜細胞總蛋白。4 ℃條件下，以離心半徑8 cm、12 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。PAGE分離蛋白并轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入抗體RDH11，4 ℃過夜，辣根過氧化物酶-共軛二抗孵育后行增強化學發光定影、顯影，Image Lab凝膠成像系統成像。以GAPDH作為內參照，進行灰度分析。實驗重復3次，取平均值。
1.7 原位末端標記（TUNEL）法檢測RPE細胞凋亡情況
rd10小鼠20只按照注射外泌體類型分為對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組，各組均為5只小鼠。小鼠腹腔麻醉后右眼視網膜下腔注射1 μl外泌體。注射后7 d，過量麻醉處死小鼠，摘除眼球，視網膜組織采用4%甲醛溶液固定，孵育后Triton X-100進行滲透（0.1% PBS），TUNEL染色，DAPI復染，防淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡觀察RPE細胞形態學變化；掃描共焦顯微鏡觀察RPE細胞凋亡情況。
1.8 生物信息學網站及雙熒光素酶報告分析miR-183與RDH11的靶向關系
應用Jefferson等在線網站對miR-183與RDH11靶向關系結合位點進行預測分析，雙熒光素酶報告基因實驗對其進行驗證。293T細胞于24孔板中培養過夜，將測序正確的熒光素酶報告質粒WT-RDH11、MUT-RDH11和miR-183模擬物及其陰性對照共轉染至細胞中。培養36 h后，螢火蟲/紅紫色熒光雙熒光素酶報告基因測定系統根據說明書計算熒光素酶相對活性。實驗重復3次，取平均值。
1.9 統計學分析
采用SPSS21.0軟件行統計學分析。定量資料以均數±標準差（）表示。呈正態分布的數據兩兩比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，Tukey's進行事后檢驗；各組間不同時間點數據比較采用重復測量方差分析，Bonferroni進行事后檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同來源小鼠RPE細胞中miR-183、RDH11 mRNA相對表達量比較
與C57小鼠RPE細胞比較，rd10小鼠RPE細胞中miR-183 mRNA相對表達量下調，RDH11 mRNA相對表達量上調，差異均有統計學意義（t=5.230、8.548，P=0.006、0.001）（圖1）。
圖1
rd10小鼠、C57BL/6小鼠RPE細胞中miR-183、RDH11 mRNA相對表達量比較（n=3），*P＜0.05。rd10：視網膜變性10；RPE：視網膜色素上皮
2.2 外泌體鑒定、外泌體中miR-183表達及RPE細胞外泌體的攝入
透射電子顯微鏡觀察發現，BMSC-exo為圓形或橢圓形膜性小囊泡，其內存在低電子密度成分（圖2A）。Western blot檢測結果顯示，與BMSC比較，外泌體表面TSG101、CD63、CD81蛋白表達更明顯（圖2B）。qRT-PCR檢測結果顯示，與空白組、mimic-NC組比較，miR-183-mimics組外泌體中miR-183 mRNA相對表達量顯著上升，差異有統計學意義（F=60.130，P＜0.001）（圖2C）。熒光顯微鏡觀察發現，培養0 h時，外泌體未進入RPE細胞且細胞數較少（圖2D）；24 h時，外泌體進入RPE細胞并沿細胞核膜聚集（圖2E）。
圖2
外泌體鑒定、外泌體中miR-183表達及RPE細胞外泌體攝入結果。2A示透射電子顯微鏡像。外泌體呈圓形或橢圓形膜性小囊泡，囊泡內存在低電子密度成分 ×200。2B示電泳圖。外泌體表達TSG101、CD63、CD81。2C示各組外泌體中miR-183 mRNA相對表達量比較。1～3分別為空白組（n=3）、mimic-NC組、miR-183-mimics組（n=3）。*與mimic-NC組比較，P＜0.05。2D、2F分別示培養0、24 h熒光顯微鏡像。0 h，DAPI標記的RPE細胞呈藍色熒光，外泌體未進入 ×200；24 h，PKH26標記的外泌體呈紅色熒光，沿RPE細胞核膜聚集 ×200。RPE：視網膜色素上皮；TSG101：腫瘤易感基因101；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
2.3 BMSC來源外泌體miR-183對體外RPE細胞增生的影響
qRT-PCR檢測結果顯示，外泌體組、對照組RPE細胞中miR-183 mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（t=1.749，P=0.155）；miR-183-mimic-exo組RPE細胞中miR-183 mRNA相對表達量較mimic-NC-exo組顯著升高，差異有統計學意義（t=7.311，P=0.002）（圖3A）。CCK-8增生分析法結果顯示，共培養后72 h，對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組A值分別為1.00±0.10、1.60±0.10、1.80±0.12、2.40±0.20。與對照組比較，外泌體組RPE細胞增生能力提高，差異有統計學意義（F=9.726，P=0.031）；miR-183-mimic-exo組RPE細胞增生能力較mimic-NC-exo組增強，差異有統計學意義（F=10.949，P=0.012）（圖3B）。
圖3
MSC來源的外泌體miR-183對體外RPE細胞增生的影響。3A示對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組轉染MSC外泌體與RPE細胞共培養后miR-183 mRNA相對表達量比較（n=3）。*與mimic-NC-exo組比較，P＜0.05。3B示4組間不同時間A值比較（n=3）。*與對照組比較，#與mimic-NC-exo組比較，P＜0.05。MSC：骨髓間充質干細胞；RPE：視網膜色素上皮
2.4 BMSC來源的外泌體miR-183對rd10小鼠RPE細胞凋亡的影響
熒光顯微鏡觀察發現，外泌體組RPE細胞凋亡數量較對照組減少，差異有統計學意義（t=4.571，P=0.002）；miR-183-mimic-exo組RPE細胞凋亡數量較mimic-NC-exo組減少，差異有統計學意義（t=4.954，P=0.001）（圖4）。
圖4
BMSC來源的外泌體miR-183對rd10小鼠視網膜組織細胞凋亡的影響。4A示熒光顯微鏡像。活細胞采用DAPI染色顯示藍色熒光，凋亡細胞采用TUNEL染色顯示綠色熒光 ×200。4B示4組間凋亡細胞比較（n=5）。1～4分別為對照組、外泌體組、minic-NC-exo組、miR-183-minic-exo組。*與對照組比較，#與mimic-NC-exo組比較，P＜0.05。BMSC：骨髓間充質干細胞；rd10：視網膜變性10；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；TUNEL：原位末端標記法
2.5 miR-183與RDH11具有靶向關系
雙熒光素酶報告基因實驗驗證結果顯示，生物信息學網站查詢miR-183與RDH11具有結合位點；與mimic-NC組比較，miR-183-mimic組野生型WT-RDH11共轉染組的熒光素酶相對活性下降，差異有統計學意義（t=5.476，P=0.005）；MUT-RDH11的熒光素酶相對活性差異無統計學意義（t=0.316，P＞0.05）（圖5）。
圖5
miR-183與RDH11具有靶向關系。5A示生物信息學Jefferson網站預測miR-183與RDH11的結合位點。5B示mimic-NC組、miR-183-mimic組野生型WT-RDH11與MUT-RDH11的熒光素酶相對活性比較（n=3）。*與mimic-NC組比較，P＜0.05。RDH11：視網膜脫氫酶11
2.6 miR-183可靶向調控RDH11的表達
與mimic-NC組比較，miR-183-mimic組外泌體中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量均降低，差異有統計學意義（t=5.361、6.591，P=0.006、0.003）。共培養后，與對照組比較，外泌體組RPE細胞中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量差異無統計學意義（t=0.169、1.134，P=0.874、0.320）；與mimic-NC-exo組比較，miR-183-mimic-exo組RPE細胞中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量均降低，差異有統計學意義（t=5.554、5.546，P=0.005、0.005）（圖6）。
圖6
miR-183可靶向調控RDH11的表達。6A、6B分別示空白組、mimic-NC組、miR-183-mimic組外泌體中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3）。*與mimic-NC組比較，P＜0.05。6C、6D分別示對照組、外泌體組、mimic-NC-exo組、miR-183-mimic-exo組轉染MSC外泌體與RPE細胞共培養后RDH11 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3）。*與mimic-NC-exo組比較，P＜0.05。RDH11：視網膜脫氫酶11；MSC：骨髓間充質干細胞；RPE：視網膜色素上皮；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶
3 討論
RP是一種慢性、進行性、遺傳性以及營養不良性視網膜退行性變。既往研究已證實，RP病理改變中，桿狀細胞外節盤膜早期即已喪失；細胞外盤膜崩解物殖留，堆積形成一層障礙物，影響營養物質從脈絡膜到達視網膜的運轉，從而引起視細胞進行性營養不良及逐漸的變性和消失[11-12]。RPE細胞可組成RPE層與脈絡膜相連，具有支持和營養光感受器細胞、遮光、散熱以及再生和修復等作用[13]。因此，RPE細胞的消失可能是RP進展的原因之一。間充質干細胞是一種多功能干細胞，具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在臨床應用較多。BMSC可減少視網膜光感受器細胞凋亡，對視網膜損傷具有保護作用[14-15]。外泌體是幾乎所有細胞類型都可產生的一種膜性囊泡，是細胞間通訊的關鍵信使，干細胞來源的外泌體包含多種功能蛋白和信號脂質，通過與細胞膜融合將脂質、核酸、蛋白質等多種生物活性物質傳遞給受體細胞，引起受體細胞功能或活性改變，發揮細胞間物質交換和信息交流的作用[16]。
miRNAs是一類小的、非編碼RNA分子，代表著基因表達的重要調節因子。在細胞指定過程中扮演著“微調子”的角色，以確保在細胞分化的特定階段精確的基因表達[17]。Kinoshita等[18]研究表明，miR-183在視網膜組織形態發生中起著至關重要的作用，可保護視網膜，減少視網膜細胞損傷。多項研究表明，BMSC或BMSC來源的外泌體可恢復或促進miR-183的表達，進而一定程度的減少視網膜變性的發生[19-21]。RDH11存在于小鼠視網膜組織中，可參與氧化應激的調節且是RP的誘發基因之一[4-5]。Xie等[22]研究發現，RDH11的有害突變會導致新的RP綜合征。本研究從BMSC中提取外泌體，使用透射電子顯微鏡、納米顆粒示蹤及Western blot進行鑒定，轉染miR-183模擬物后miR-183-mimics組miR-183表達顯著上升，rd10小鼠RPE細胞中miR-183表達下調，RDH11表達上調。BMSC來源的外泌體與RPE細胞共培養24 h時，外泌體成功進入RPE細胞；與對照組比較，外泌體組RPE細胞中miR-183表達無明顯變化，miR-183-mimic-exo組RPE細胞中miR-183表達較mimic-NC-exo組顯著升高；外泌體組RPE細胞增生能力提高，miR-183-mimic-exo組RPE細胞增生能力較mimic-NC-exo組增強。這提示BMSC來源的外泌體轉染miR-183成功，RPE細胞成功攝入外泌體且BMSC來源的外泌體miR-183能促進RPE細胞的增生。
本研究結果顯示，與對照組比較，外泌體組視網膜組織細胞凋亡較少；miR-183-mimic-exo組視網膜組織細胞凋亡較mimic-NC-exo組減少。這提示BMSC來源的外泌體miR-183能減少視網膜組織細胞的凋亡。生物信息學網站查詢miR-183與RDH11具有結合位點，雙熒光素酶報告結果顯示miR-183與RDH11具有靶向關系。與mimic-NC組比較，miR-183-mimic mRNA及蛋白相對表達量均降低；BMSC來源的外泌體與RPE細胞共培養后，外泌體組RPE細胞中RDH11 mRNA和蛋白相對表達量與對照組比較無明顯變化，miR-183-mimic-exo組RPE細胞中RDH11 mRNA及蛋白相對表達量較mimic-NC-exo組顯著降低。該結果提示miR-183能靶向調控RDH11的表達。
本研究結果表明，rd10小鼠視網膜RPE細胞中，miR-183表達下調，RDH11表達上調；miR-183與RDH11具有靶向關系；BMSC來源的外泌體miR-183促進RPE細胞體外增生；注射轉染miR-183模擬物的BMSC外泌體減少了rd10小鼠視網膜組織中細胞的凋亡。這說明，從機制上講，上調BMSC來源的外泌體miR-183可能通過靶向抑制RDH11的表達而抑制RP的發展。
