微血管功能障礙是糖尿病視網膜病變（DR）的關鍵病理機制。近年來研究發現，糖尿病患者普遍存在“代謝記憶”現象，即使其血糖控制良好，也無法避免糖尿病微血管病變。因此，從基因角度來探索DR的發病機制非常必要。miR-126是血管內皮細胞唯一特異性表達的microRNA，與新生血管的形成關系密切，可影響DR微血管的穩定性及內皮細胞的萌芽和遷移，且其基因水平與血管內皮細胞生長因子的表達呈顯著負相關。細胞內和循環中的miR-126在DR微血管穩態調節、早期診療和病程監測等方面的潛在價值受到了極大的關注，但這一領域的研究報道多以假說為驅動，仍有一定局限性。相信隨著基因組學的快速發展，miRNA譜及其在眼發育和眼部疾病中的分子機制將會逐漸清晰，未來可能會在個別難治性視網膜疾病的干預中率先獲得突破，建立一種新型的miRNA診療手段。
引用本文： 王瑞, 羅向霞, 胡婷婷, 張鈺潔. miR-126在糖尿病視網膜病變發病機制及診療應用中的作用研究進展. 中華眼底病雜志, 2021, 37(11): 906-910. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201103-00531 復制
miR-126是最早由Lagos-Quintana等[1]在小鼠心臟和小腦中發現的一種長約20～25 nt的非編碼RNA，位于表皮生長因子樣結構域7基因7號內含子內，其核酸序列為5'-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3'。它的合成過程與信使RNA類似，涉及位于細胞核和細胞質中的多種RNA酶[2]。miR-126通常存在于細胞內環境中，能夠識別多個同源靶mRNA的3'非編碼區，并與之不同程度結合，于轉錄水平負向調控這些目的基因，使其降解或抑制翻譯過程，但是其本身不編碼任何蛋白質[3-4]。它也可在細胞外環境中存在，如循環miR-126，具有高度的保守性、時間特異性和組織特異性[5]，這種非編碼RNA屬于表觀遺傳學范疇。目前發現，miR-126、miR-122、miR-200b、miR-146、miR-150、miR-31、let-7等與糖尿病視網膜病變（DR）新生血管形成均有一定聯系[6-8]，而miR-126是血管內皮細胞（VECs）唯一特異性表達的microRNA。VECs分泌miR-126后，進入循環系統，參加了多種病理生理的調節過程，包括正常血管和腫瘤組織血管的增生、分化、凋亡、代謝及免疫作用等[9-11]。由此可見，miR-126屬于調控血管生成的靶基因miRNA，可調節VECs的功能和新生血管的完整性。miR-126與新生血管的形成關系密切，可影響DR微血管的穩定性及內皮細胞的萌芽和遷移，且其基因水平與血管內皮細胞生長因子（VEGF）的表達呈顯著負相關。這提示miR-126對DR的診治可能具有重要價值。現就miR-126在對DR的調控機制及其在DR診療中的應用價值研究現狀及進展作一綜述。
1 miR-126對DR的調控機制
DR的關鍵病理機制是微血管功能障礙[11]，而近年來發現糖尿病患者普遍存在“代謝記憶”現象，即使血糖控制良好的糖尿病患者，也無法避免糖尿病微血管病變[12-13]。因此，從基因角度來探索DR是非常必要的，這與miR-126調控微血管方面的機制相契合。miR-126在DR、老年性黃斑變性、視網膜母細胞瘤和角膜新生血管與移植等眼科疾病的發生和發展中均發揮一定作用，其中DR與之關系密切[6, 9, 14]。但是，miR-126對DR的微血管調控機制非常復雜，主要表現為微血管異常和炎癥反應，其中涉及多種信號分子和通路[15]。
1.1 調控微血管穩態
在高糖缺氧環境中，miR-126通過多種途徑調節視網膜VEGF、缺氧誘導因子-1（HIF-1）和胰島素樣生長因子等，進而促進VECs完整性，同時抑制增生的VECs遷移所導致的新生血管萌芽；若異常新生血管已經出芽，miR-126可促使其穩定發育，減少滲漏及出血[16-18]。研究表明，miR-126主要通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路磷酸化的負調控作用來調節VEGF、血管生成因子和堿性成纖維細胞生長因子等主要血管生長因子的表達水平，進而影響血管細胞遷移、骨架重組、毛細管網穩定性和細胞生存環境穩態，最終減緩視網膜新生血管的發生[19-20]。在小鼠DR模型和人臍靜脈血管內皮細胞模型中，miR-126與VEGF的表達存在時間依賴的相關性，隨著DR不斷進展，miR-126和VEGF通過相互影響來調控DR引發的視網膜新生血管[21]。目前來看，這與阻斷VEGF/PI3K/AKT信號通路中的VEGFA和PIK3受體2有關，而miR-126表達的正常化，可能通過阻滯內皮細胞周期和抑制VEGF及基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達，進而減少缺氧誘導的新生血管[22]。另外，miR-126a/b基因還能靶向調節其關鍵的下游信號因子p21-激活激酶1，進而促進MMP-9對上述途徑的協同作用，抑制VECs的遷移，共同調控血管形成[23-25]。此外，VECs中的C-RAF原癌基因絲蘇氨酸蛋白激酶（Raf1）/細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路也受到miR-126的調控，當miR-126表達明顯下調時，激活p38和ERK信號分子，同樣也能抑制DR的新生血管萌芽，緩解DR微血管損害[26]。而在視網膜周細胞中，高糖/低氧條件下，骨髓間充質干細胞分泌的細胞外小泡能夠下調周細胞中miR-126的表達，同時VEGF/HIF-1α信號通路被激活，導致DR微血管穩態失衡[27]。高糖缺氧環境下誘導的增生型DR（PDR）小鼠模型miR-126表達降低，而玻璃體腔注射miR-126可明顯減少小鼠視網膜新生血管的生成[28]。這說明miR-126基因缺陷后可能造成血管完整性受損，通透性增加。Chen等[29]和Zhao等[30]的研究也支持miR-126穩定微血管的說法。通過miR-126基因的后天干預與該基因先天性缺失引起的血管病理改變是相近的，miR-126通過穩定微血管和保證內皮細胞完整性來干預DR的發生和發展[31]。總的來說，miR-126在DR的發生發展中能穩定微血管生長，同時又可以通過不同信號通路結合多個靶標[18, 32]，并且可能起到正向或負向調節作用，其具體的生物學效應取決于相應的途徑[25]。
1.2 抑制炎癥反應
炎癥反應伴隨著DR全過程，與視網膜內促炎性細胞因子和趨化因子的表達、炎性細胞浸潤、新生血管形成、血管通透性的增加、視網膜水腫和組織破壞密切相關[33]。DR患者在高血糖環境下產生大量細胞因子，激活內皮細胞上調黏附分子，如血管細胞黏附分子1（VCAM-1）的表達，促使白細胞向炎癥部位的運輸，介導白細胞與內皮細胞的黏附。VECs釋放的miR-126可抑制VCAM-1表達，減輕炎癥反應，而當miR-126的寡核苷酸轉染下調時，VECs會上調腫瘤壞死因子α的表達，進而刺激VCAM-1表達[34]。高血糖顯著增加了糖尿病大鼠或人類視網膜內皮細胞（HRECs）的炎癥反應，其中白細胞介素（IL）-1β、半胱天冬酶（Caspase）-1和IL-18的表達水平明顯升高，這時由于miR-126在間充質干細胞來源的外切體中的高表達，下調高遷移率族蛋白1信號通路，進而減輕高血糖誘導的視網膜炎癥[35]。Chen等[36]利用HRECs實驗證明了IL-17A是miR-126的靶標，且被該基因負向調節。因此，miR-126可以調節多種黏附分子和炎癥因子的表達，對DR血管炎癥進行多位點負調控。
2 miR-126對DR的診斷和治療前景
當前研究發現，在DR患者的血漿、尿液和淚液中都可以檢測出miR-126，它以非常穩定的兩種形式存在：被包裹在微粒中形成外泌體，或被組裝成復合物，通過VECs、周細胞等分泌釋放出胞體后進入循環，因此可以免受內源性核糖核酸酶的溶解[37-39]。與無明顯并發癥的2型糖尿病患者相比，有并發癥的2型糖尿病患者，尤其是伴有大血管并發癥和DR者血清miR-126的表達水平明顯降低[40]。同樣，在一大批1型糖尿病患者中，miR-126水平與糖尿病的微血管并發癥，特別是增生性視網膜病變相關[41]。研究表明，DR患者血漿miR-126的相對含量隨DR嚴重程度加重而減少[42]。Qin等[43]研究表明，當血清miR-126含量≤5.02時，發生PDR的可能性增大。Liu等[44]一項臨床試驗表明，PDR的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期患者血漿miR-126的表達水平均顯著高于特發性黃斑裂孔患者，且其表達水平隨著PDR嚴重程度加重而增加。其中，VEGF表達水平與miR-126表達水平呈負相關。另外，Zampetaki等[45]對1型糖尿病患者（包括有/無并發癥患者）的混合血清樣本進行了miRNA圖譜分析，在25個差異表達的血清miRNA中同樣驗證了miR-126的診斷價值。因此，循環miR-126圖譜具有疾病特異性，一定程度上代表了疾病的分子特征[46]。
近年來，DR的治療手段越來越豐富，除了傳統的激光光凝、玻璃體切割手術外，抗VEGF藥物等新型治療手段也得到了眼科醫生的認可，但這些治療方案主要集中于PDR，且都是侵入性的，存在眼內炎、眼底再次出血等嚴重不良反應，因此具有一定的局限性[47]。在新生血管形成過程中，miR-126對基質蛋白積累和血管通透性方面影響較大，而這些都是引起黃斑水腫而造成患者視力喪失的重要因素[14]。在糖尿病并發創面的研究中，負壓創面療法可上調創面和血漿中miR-126的表達，促進創面的毛細血管修復[10]。而在糖尿病傷口愈合的不同階段，miRNA對DR血管修復均具有促進效應[48]。血管內皮功能障礙的關鍵是VECs的衰老。在衰老的血管內皮細胞中HIF-1α和miR-126表達水平均降低，而miR-126的抑制會降低HIF-1α的蛋白表達，說明miR-126/HIF-1α通路可能在其中起到正調節作用[11]。另外，螢光素酶報告系統證明了循環系統miR-126通過調節轉錄后循環系統組織因子的表達來影響DR脈管系統的止血平衡，進而減少血栓形成而導致的出血[49]。Wang和Yan[50]應用煙酸緩釋片治療DR大鼠，結果顯示大鼠視網膜中miR-126表達增加，VEGF/VEGFR、VCAM-1/CD45表達降低，同時細胞凋亡和血視網膜屏障的破壞減少，提示miR-126通路可能參與了煙酸緩釋片治療的正面調節效應。
總體來看，非侵入性、經濟有效的循環miR-126可作為DR的新型生物標志物，在早期診斷和鑒別診斷、中期監測和晚期預后評估方面具有巨大的潛在價值，尤其在目前糖尿病大流行背景下，可僅基于血尿樣本對糖尿病和DR患者進行大規模篩查，實用意義較大。但是目前miR-126有效的遞送系統及其特異性仍然需要深入挖掘，其診斷的穩定性和特異性還有待進一步的大數據研究。
3 小結
細胞內和循環中的miR-126在DR視網膜微血管穩態中的調節、早期診斷、進程監測和治療等方面的潛在價值受到了極大的關注，但是在這一領域的研究仍有一定局限性。（1）多數報道是以假說為驅動的，仍需要大量的隨機對照試驗等高級別的臨床試驗證據加以說明其潛在的臨床價值。（2）單一的生物標志物本身對疾病的診斷和預測的敏感性和特異性較差，聯合檢測幾個標志物可以提高對疾病的診斷能力。（3）目前利用miR-126治療DR還僅限于動物實驗研究，而且這些研究的重復性不高。（4）現有的臨床研究缺少標準的研究方案，miR-126的水平與微血管損害之間的關系缺少量化標準。（5）目前臨床中尚無專門檢測miR-126水平的儀器，同時受樣本質量和患者本身的影響，結果缺乏可靠性[37, 51]。
但是，隨著基因組學的快速發展，通過獲取“分子簽名”等組學方法可更好的進行生物標記物的研究，miRNA譜及其在眼發育和眼部疾病中的分子機制將會逐漸清晰，未來可能會在個別難治性視網膜疾病的干預中率先獲得突破，建立一種新型的miRNA診療手段。
miR-126是最早由Lagos-Quintana等[1]在小鼠心臟和小腦中發現的一種長約20～25 nt的非編碼RNA，位于表皮生長因子樣結構域7基因7號內含子內，其核酸序列為5'-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3'。它的合成過程與信使RNA類似，涉及位于細胞核和細胞質中的多種RNA酶[2]。miR-126通常存在于細胞內環境中，能夠識別多個同源靶mRNA的3'非編碼區，并與之不同程度結合，于轉錄水平負向調控這些目的基因，使其降解或抑制翻譯過程，但是其本身不編碼任何蛋白質[3-4]。它也可在細胞外環境中存在，如循環miR-126，具有高度的保守性、時間特異性和組織特異性[5]，這種非編碼RNA屬于表觀遺傳學范疇。目前發現，miR-126、miR-122、miR-200b、miR-146、miR-150、miR-31、let-7等與糖尿病視網膜病變（DR）新生血管形成均有一定聯系[6-8]，而miR-126是血管內皮細胞（VECs）唯一特異性表達的microRNA。VECs分泌miR-126后，進入循環系統，參加了多種病理生理的調節過程，包括正常血管和腫瘤組織血管的增生、分化、凋亡、代謝及免疫作用等[9-11]。由此可見，miR-126屬于調控血管生成的靶基因miRNA，可調節VECs的功能和新生血管的完整性。miR-126與新生血管的形成關系密切，可影響DR微血管的穩定性及內皮細胞的萌芽和遷移，且其基因水平與血管內皮細胞生長因子（VEGF）的表達呈顯著負相關。這提示miR-126對DR的診治可能具有重要價值。現就miR-126在對DR的調控機制及其在DR診療中的應用價值研究現狀及進展作一綜述。
1 miR-126對DR的調控機制
DR的關鍵病理機制是微血管功能障礙[11]，而近年來發現糖尿病患者普遍存在“代謝記憶”現象，即使血糖控制良好的糖尿病患者，也無法避免糖尿病微血管病變[12-13]。因此，從基因角度來探索DR是非常必要的，這與miR-126調控微血管方面的機制相契合。miR-126在DR、老年性黃斑變性、視網膜母細胞瘤和角膜新生血管與移植等眼科疾病的發生和發展中均發揮一定作用，其中DR與之關系密切[6, 9, 14]。但是，miR-126對DR的微血管調控機制非常復雜，主要表現為微血管異常和炎癥反應，其中涉及多種信號分子和通路[15]。
1.1 調控微血管穩態
在高糖缺氧環境中，miR-126通過多種途徑調節視網膜VEGF、缺氧誘導因子-1（HIF-1）和胰島素樣生長因子等，進而促進VECs完整性，同時抑制增生的VECs遷移所導致的新生血管萌芽；若異常新生血管已經出芽，miR-126可促使其穩定發育，減少滲漏及出血[16-18]。研究表明，miR-126主要通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路磷酸化的負調控作用來調節VEGF、血管生成因子和堿性成纖維細胞生長因子等主要血管生長因子的表達水平，進而影響血管細胞遷移、骨架重組、毛細管網穩定性和細胞生存環境穩態，最終減緩視網膜新生血管的發生[19-20]。在小鼠DR模型和人臍靜脈血管內皮細胞模型中，miR-126與VEGF的表達存在時間依賴的相關性，隨著DR不斷進展，miR-126和VEGF通過相互影響來調控DR引發的視網膜新生血管[21]。目前來看，這與阻斷VEGF/PI3K/AKT信號通路中的VEGFA和PIK3受體2有關，而miR-126表達的正常化，可能通過阻滯內皮細胞周期和抑制VEGF及基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達，進而減少缺氧誘導的新生血管[22]。另外，miR-126a/b基因還能靶向調節其關鍵的下游信號因子p21-激活激酶1，進而促進MMP-9對上述途徑的協同作用，抑制VECs的遷移，共同調控血管形成[23-25]。此外，VECs中的C-RAF原癌基因絲蘇氨酸蛋白激酶（Raf1）/細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路也受到miR-126的調控，當miR-126表達明顯下調時，激活p38和ERK信號分子，同樣也能抑制DR的新生血管萌芽，緩解DR微血管損害[26]。而在視網膜周細胞中，高糖/低氧條件下，骨髓間充質干細胞分泌的細胞外小泡能夠下調周細胞中miR-126的表達，同時VEGF/HIF-1α信號通路被激活，導致DR微血管穩態失衡[27]。高糖缺氧環境下誘導的增生型DR（PDR）小鼠模型miR-126表達降低，而玻璃體腔注射miR-126可明顯減少小鼠視網膜新生血管的生成[28]。這說明miR-126基因缺陷后可能造成血管完整性受損，通透性增加。Chen等[29]和Zhao等[30]的研究也支持miR-126穩定微血管的說法。通過miR-126基因的后天干預與該基因先天性缺失引起的血管病理改變是相近的，miR-126通過穩定微血管和保證內皮細胞完整性來干預DR的發生和發展[31]。總的來說，miR-126在DR的發生發展中能穩定微血管生長，同時又可以通過不同信號通路結合多個靶標[18, 32]，并且可能起到正向或負向調節作用，其具體的生物學效應取決于相應的途徑[25]。
1.2 抑制炎癥反應
炎癥反應伴隨著DR全過程，與視網膜內促炎性細胞因子和趨化因子的表達、炎性細胞浸潤、新生血管形成、血管通透性的增加、視網膜水腫和組織破壞密切相關[33]。DR患者在高血糖環境下產生大量細胞因子，激活內皮細胞上調黏附分子，如血管細胞黏附分子1（VCAM-1）的表達，促使白細胞向炎癥部位的運輸，介導白細胞與內皮細胞的黏附。VECs釋放的miR-126可抑制VCAM-1表達，減輕炎癥反應，而當miR-126的寡核苷酸轉染下調時，VECs會上調腫瘤壞死因子α的表達，進而刺激VCAM-1表達[34]。高血糖顯著增加了糖尿病大鼠或人類視網膜內皮細胞（HRECs）的炎癥反應，其中白細胞介素（IL）-1β、半胱天冬酶（Caspase）-1和IL-18的表達水平明顯升高，這時由于miR-126在間充質干細胞來源的外切體中的高表達，下調高遷移率族蛋白1信號通路，進而減輕高血糖誘導的視網膜炎癥[35]。Chen等[36]利用HRECs實驗證明了IL-17A是miR-126的靶標，且被該基因負向調節。因此，miR-126可以調節多種黏附分子和炎癥因子的表達，對DR血管炎癥進行多位點負調控。
2 miR-126對DR的診斷和治療前景
當前研究發現，在DR患者的血漿、尿液和淚液中都可以檢測出miR-126，它以非常穩定的兩種形式存在：被包裹在微粒中形成外泌體，或被組裝成復合物，通過VECs、周細胞等分泌釋放出胞體后進入循環，因此可以免受內源性核糖核酸酶的溶解[37-39]。與無明顯并發癥的2型糖尿病患者相比，有并發癥的2型糖尿病患者，尤其是伴有大血管并發癥和DR者血清miR-126的表達水平明顯降低[40]。同樣，在一大批1型糖尿病患者中，miR-126水平與糖尿病的微血管并發癥，特別是增生性視網膜病變相關[41]。研究表明，DR患者血漿miR-126的相對含量隨DR嚴重程度加重而減少[42]。Qin等[43]研究表明，當血清miR-126含量≤5.02時，發生PDR的可能性增大。Liu等[44]一項臨床試驗表明，PDR的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期患者血漿miR-126的表達水平均顯著高于特發性黃斑裂孔患者，且其表達水平隨著PDR嚴重程度加重而增加。其中，VEGF表達水平與miR-126表達水平呈負相關。另外，Zampetaki等[45]對1型糖尿病患者（包括有/無并發癥患者）的混合血清樣本進行了miRNA圖譜分析，在25個差異表達的血清miRNA中同樣驗證了miR-126的診斷價值。因此，循環miR-126圖譜具有疾病特異性，一定程度上代表了疾病的分子特征[46]。
近年來，DR的治療手段越來越豐富，除了傳統的激光光凝、玻璃體切割手術外，抗VEGF藥物等新型治療手段也得到了眼科醫生的認可，但這些治療方案主要集中于PDR，且都是侵入性的，存在眼內炎、眼底再次出血等嚴重不良反應，因此具有一定的局限性[47]。在新生血管形成過程中，miR-126對基質蛋白積累和血管通透性方面影響較大，而這些都是引起黃斑水腫而造成患者視力喪失的重要因素[14]。在糖尿病并發創面的研究中，負壓創面療法可上調創面和血漿中miR-126的表達，促進創面的毛細血管修復[10]。而在糖尿病傷口愈合的不同階段，miRNA對DR血管修復均具有促進效應[48]。血管內皮功能障礙的關鍵是VECs的衰老。在衰老的血管內皮細胞中HIF-1α和miR-126表達水平均降低，而miR-126的抑制會降低HIF-1α的蛋白表達，說明miR-126/HIF-1α通路可能在其中起到正調節作用[11]。另外，螢光素酶報告系統證明了循環系統miR-126通過調節轉錄后循環系統組織因子的表達來影響DR脈管系統的止血平衡，進而減少血栓形成而導致的出血[49]。Wang和Yan[50]應用煙酸緩釋片治療DR大鼠，結果顯示大鼠視網膜中miR-126表達增加，VEGF/VEGFR、VCAM-1/CD45表達降低，同時細胞凋亡和血視網膜屏障的破壞減少，提示miR-126通路可能參與了煙酸緩釋片治療的正面調節效應。
總體來看，非侵入性、經濟有效的循環miR-126可作為DR的新型生物標志物，在早期診斷和鑒別診斷、中期監測和晚期預后評估方面具有巨大的潛在價值，尤其在目前糖尿病大流行背景下，可僅基于血尿樣本對糖尿病和DR患者進行大規模篩查，實用意義較大。但是目前miR-126有效的遞送系統及其特異性仍然需要深入挖掘，其診斷的穩定性和特異性還有待進一步的大數據研究。
3 小結
細胞內和循環中的miR-126在DR視網膜微血管穩態中的調節、早期診斷、進程監測和治療等方面的潛在價值受到了極大的關注，但是在這一領域的研究仍有一定局限性。（1）多數報道是以假說為驅動的，仍需要大量的隨機對照試驗等高級別的臨床試驗證據加以說明其潛在的臨床價值。（2）單一的生物標志物本身對疾病的診斷和預測的敏感性和特異性較差，聯合檢測幾個標志物可以提高對疾病的診斷能力。（3）目前利用miR-126治療DR還僅限于動物實驗研究，而且這些研究的重復性不高。（4）現有的臨床研究缺少標準的研究方案，miR-126的水平與微血管損害之間的關系缺少量化標準。（5）目前臨床中尚無專門檢測miR-126水平的儀器，同時受樣本質量和患者本身的影響，結果缺乏可靠性[37, 51]。
但是，隨著基因組學的快速發展，通過獲取“分子簽名”等組學方法可更好的進行生物標記物的研究，miRNA譜及其在眼發育和眼部疾病中的分子機制將會逐漸清晰，未來可能會在個別難治性視網膜疾病的干預中率先獲得突破，建立一種新型的miRNA診療手段。