引用本文： 于榮國, 張慧, 張曉敏, 邵先鋒, 李筱榮. 糖尿病視網膜病變患者循環外泌體中炎癥相關蛋白S100A8的表達. 中華眼底病雜志, 2021, 37(1): 32-39. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200616-00285 復制
糖尿病視網膜病變（DR）進行性視網膜損傷特征是毛細血管阻塞、新生血管形成、炎癥浸潤和血視網膜屏障破壞[1]。盡管機制尚未完全闡明，但越來越多的證據表明，慢性、無菌性的亞臨床炎癥是DR進展的重要原因[2-3]。外泌體是活細胞分泌的直徑為30～150 nm囊泡，在正常生理過程中發揮介導細胞間通訊的功能。血漿中存在大量外泌體，其來源廣泛，參與眼底疾病的發生和進展[4-5]。近年研究表明，糖尿病患者的循環外泌體可以介導內皮細胞損傷、血管炎癥和血視網膜屏障功能障礙等病理過程[6-7]，外泌體通過轉運促血管生成因子和炎癥因子可加重DR進展[8]。有研究表明，糖尿病模型鼠和糖尿病患者血液中外泌體含量高于正常對照組[9]。外泌體數量的增加和內容物的變化反映了糖尿病狀態下細胞分泌活動增強，與微血管并發癥和炎癥進展相關。鈣結合S100A8蛋白（S100A8）又稱為MRP8，主要表達于髓系細胞，其可以作用于細胞表面的Toll樣受體4（TLR4），激活核因子（NF）-κB通路[10]，在調節炎癥過程和免疫反應中發揮重要作用。研究已證實，高濃度循環S100A8蛋白是關節炎、慢性腸炎和葡萄膜炎等多種炎癥性疾病的標志物[11-13]。但關于S100A8參與糖尿病微血管并發癥的報道較少。本課題組前期對DR患者血漿外泌體進行蛋白質組學分析，發現其S100A8表達水平較無DR的2型糖尿病（T2DM）患者升高[14]。本研究擬觀察T2DM伴或不伴DR和無糖尿病的健康受試者血漿外泌體、微囊泡（MV）、血漿和玻璃體中S100A8表達水平，并在糖尿病大鼠視網膜組織中進行驗證，探討其與DR的相關性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
病例對照研究及基礎研究。本研究經天津醫科大學附屬眼科醫院倫理委員會審批（批準號：2017KY-01）。所有研究對象均知情同意；試驗程序遵循《赫爾辛基宣言》原則。
1.1 主要試劑和儀器
鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司），S100A8酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（日本MBL公司）；CD9一抗（ab92726）、CD63一抗（ab216130）、CD81一抗（ab10920）、β-肌動蛋白（actin）一抗（CST4970）、S100A8一抗（ab180735）（美國Abcam公司），二抗山羊抗兔（CST7074S）（美國CST公司）；免疫組織化學染色通用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（SP）試劑盒（中國中杉金橋生物技術有限公司）；快速考馬斯亮藍染色劑（北京索萊寶科技有限公司）。超高速離心機（德國貝克曼公司）；透射電子顯微鏡HT7700（日本日立公司）；納米粒度分析儀NS300（德國馬爾文公司）；凝膠成像系統（中國上海天能科技有限公司）；Olympus顯微鏡BX51（日本Olympus公司）。
1.2 受試者分組
2018年9月至2019年12月于天津醫科大學眼科醫院就診的T2DM患者、住院行玻璃體切割手術的患者以及同期健康體檢者共計73名納入本研究。其中，采集血漿32名，收集玻璃體液41名，并據此分為血漿樣本研究隊列和玻璃體樣本研究隊列。納入標準：（1）年齡40～85歲；（2）確診T2DM（健康體檢者血漿隊列研究除外）。排除標準：（1）糖尿病以外的代謝綜合征；（2）全身或眼部免疫性疾病；（3）除增生型DR（PDR）以外的血管病變，包括視網膜靜脈或動脈阻塞；（4）有眼外傷史；（5）青光眼。參照文獻[15]的分類方法，將受試者分為未發生眼底改變的單純糖尿病組（DM組）、非PDR組（NPDR組）和PDR組；健康體檢者作為正常對照組（NC組）。因健康人的玻璃體液無法獲取，故以黃斑前膜（ERM）或黃斑裂孔（MH）患者玻璃體液作為對照組。
1.3 大鼠STZ模型建立及分組
健康雄性Brown Norway大鼠18只，2月齡，體重280～320 g，清潔級，購于北京維通利華公司[動物生產許可證：SCXK（京）2016-0006]。所有實驗用鼠于相同條件下飼養，室溫下正常飲食，每日光照時間約12 h。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會許可（倫理編號：TJYY2019091124）。采用隨機數字表法將大鼠分為正常對照組和糖尿病組，每組9只。糖尿病組大鼠按照55 mg/kg劑量腹腔注射STZ，誘導糖尿病模型；正常對照組大鼠腹腔注射等體積緩沖液。注射3 d后糖尿病組大鼠血糖值＞16.7 mmol/L且出現多食、多尿、多飲即為建模成功。建模后5個月用于后續實驗。
1.4 差速離心法分離血漿外泌體和MV
1 ml血漿加入10 ml 磷酸鹽緩沖液（PBS），2000×g離心10 min，棄沉淀，將上清轉移至新的離心管中，10 000×g離心30 min，收集沉淀為MV；將上清轉移入超速離心管中，110 000×g離心120 min，棄上清，適量PBS重懸沉淀，將體積補充至11 ml，110 000×g離心120 min，得到的沉淀為外泌體，以上步驟均在4 ℃或冰上進行。
1.5 血漿外泌體和MV鑒定
20 μl PBS分別重懸外泌體和MV，各吸取10 μl滴于銅網上，沉淀10 min；吸取1%磷鎢酸10 μl滴加于銅網上染色3 min；濾紙吸去浮液，常溫下干燥10 min。上機檢測，80 V成像，透射電子顯微鏡觀察外泌體和MV形態。
PBS將外泌體或MV分別稀釋至1 ml體積，注入1 ml注射器中并裝載在納米粒度分析儀載物臺上，檢測粒子直徑，溫度25 ℃，模式為自動檢測并重復3次。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測外泌體表面標志物。根據二喹啉甲酸（BCA）試劑盒定量檢測的外泌體濃度，15 μg外泌體蛋白加入等體積蛋白上樣緩沖液，95 ℃，5 min。10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白混合物（濃縮膠、分離膠電壓分別為80、100 V），待分離膠前段跑至SDS-PAGE膠底部時停止電泳，以濕轉法將膠上蛋白轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，室溫下5%脫脂牛奶孵育2 h。加入抗CD9（1∶1000）、抗CD63（1∶1000）、抗CD81（1∶500）等一抗過夜。三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBST）洗膜10 min，3次；加入二抗山羊抗兔（1∶2000），室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，3次，增強化學發光法（ECL）顯色，凝膠成像系統曝光條帶。
根據BCA試劑盒定量檢測的外泌體、MV、血漿濃度，各取10 μg蛋白，加入等體積蛋白上樣緩沖液，95 ℃，5 min。10%SDS-PAGE分離蛋白混合物（濃縮膠、分離膠電壓分別為80、100 V），待分離膠前段跑至SDS-PAGE膠底部時停止電泳。加入快速考馬斯亮藍染色劑，室溫孵育2 h；去離子水清洗2 h；使用凝膠拍照系統拍攝SDS-PAGE。
1.6 ELISA檢測樣品中S100A8含量
試劑盒中稀釋液分別將血漿外泌體、MV和玻璃體液稀釋至100 μl，按照試劑盒推薦方法，將樣本、稀釋后標準品加入測量孔中，室溫孵育1 h，清洗緩沖液清洗4次，加入稀釋后鏈霉親和素-辣根過氧化物酶，室溫孵育1 h，清洗緩沖液清洗4次，顯色劑顯色，終止劑停止顯色。酶標儀測量波長分別為450、540 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。
1.7 免疫組織化學染色及Western blot檢測大鼠視網膜S100A8表達
隨機選取糖尿病組、正常對照組大鼠各3只脫頸處死，摘除眼球，10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片。采用SP法行免疫組織化學染色，兔抗大鼠S100A8多克隆抗體標記 S100A8 蛋白，120 ℃，4 min，二氨基聯苯胺顯色、蘇木精復染、分化、沖洗返藍、脫水、透明和中性樹膠封片。
隨機選取糖尿病組、正常對照組大鼠各3只脫頸處死，摘除眼球剝離視網膜，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒定量檢測蛋白濃度，各取50 μg蛋白加入等體積蛋白上樣緩沖液，95 ℃，5 min。10%SDS-PAGE分離蛋白混合物（濃縮膠、分離膠電壓分別為80、100 V電壓），分離膠前段跑至SDS-PAGE膠底部時停止電泳，以濕轉法將膠上的蛋白轉印至PVDF膜上，室溫下5%脫脂牛奶孵育2 h。加入抗S100A8（1:1000）、抗β-actin（1:5000）一抗過夜。TBST洗膜10 min，3次，加入二抗山羊抗兔（1:2000、1:10000），室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，3次，ECL顯色，凝膠成像系統曝光條帶。重復3次，應用Image J軟件進行灰度分析。
1.8 統計學方法
采用SPSS 20.0軟件行統計學分析。計量數據以均數±標準差（
）表示。兩組間計量數據經正態性分布檢驗后采用t檢驗；多組間計量數據經正態性和方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，組內兩兩比較采取最小顯著性差異法，方差不齊時采用秩和檢驗。各組性別構成比比較行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
血漿樣本研究隊列中，NC組、DM組、NPDR組、PDR組受試者均為8例。4個組患者間年齡、性別構成比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；糖化血紅蛋白（HbA1c）水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中PDR組患者HbA1c水平較高。玻璃體樣本研究隊列中，對照組、DM組、PDR組各11例，NPDR組8例。NC組、DM組中，ERM、MH分別為7、4例和9、2例；NPDR組11例均為ERM。4個組患者間年齡、性別構成比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；HbA1c水平比較，差異有統計學意義（F=3.456，P=0.046），其中PDR組患者HbA1c水平較高。兩隊列研究中，各組患者間糖尿病病程、體重和基本生化指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1，2）。
表1
血漿樣本隊列研究4個組受試者基本信息
表2
玻璃體樣本隊列研究4個組受試者基本信息
透射電子顯微鏡觀察結果顯示，外泌體具有典型雙層膜結構，呈“茶托”樣（圖1A）；粒子直徑50.0～200.0 nm，平均直徑136.1 nm。MV呈圓形囊泡結構（圖1B），粒子直徑＞200.0 nm，平均直徑248.8 nm。外泌體表達經典標志物CD9、CD63、CD81（圖1C）。考馬斯亮藍凝膠染色顯示，血漿具有高豐度蛋白，相對分子質量72×103；外泌體、MV未見血漿中的高豐度蛋白。外泌體具有相對分子質量130～250×103、72～95×103的特征性蛋白組分；MV具有相對分子質量36×103的特征性蛋白條帶（圖1D）。
圖1
血漿外泌體、MV鑒定結果。1A示透射電子顯微鏡像，外泌體呈典型“茶托”樣雙層膜結構 負染 標尺：200 nm；1B示透射電子顯微鏡像，MV呈圓形囊泡樣 負染 標尺：200 nm；1C示電泳圖，外泌體表達經典標志物CD9、CD63、CD81；1D示電泳圖，外泌體、血漿和MV具有不同的蛋白質分布
血漿樣本隊列研究，4個組受試者之間血漿外泌體中S100A8質量濃度總體比較，差異有統計學意義（F=6.185，P=0.002）；PDR組患者血漿外泌體中S100A8質量濃度較NPDR組、DM組和NC組升高，差異有統計學意義（P=0.039、0.020、0.002）（圖2A）；4個組受試者之間血漿MV、血漿的S100A8質量濃度總體比較，差異無統計學意義（F=0.015、0.283，P=0.998、0.838）（圖2B，2C）。玻璃體樣本隊列研究，4個組患者間玻璃體S100A8質量濃度總體比較，差異有統計學意義（F=19.500，P＜0.001）；PDR組患者玻璃體中S100A8質量濃度較NPDR組、DM組和對照組升高，差異有統計學意義（P=0.002，P＜0.000、＜0.000）（圖2D）。
圖2
各組受試者血漿外泌體、MV、血漿和玻璃體液S100A8表達水平比較。2A示血漿外泌體S100A8水平；2B示血漿MV S100A8水平；2C示血漿S100A8水平；2D示玻璃體S100A8水平。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.000。NC組：正常對照組；DM組：糖尿病組；NPDR組：非增生型糖尿病視網膜病變組；PDR組：增生型糖尿病視網膜病變組
免疫組織化學染色結果顯示，正常對照組大鼠各層細胞排列整齊（圖3A）；糖尿病組大鼠視網膜神經節細胞、雙極細胞、視錐視桿細胞和血管內皮細胞均表達S100A8蛋白（圖3B）。Western blot檢測結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病組大鼠視網膜組織中S100A8表達水平升高，差異有統計學意義（t=8.028，P=0.001）（圖3C）。
圖3
正常對照組、糖尿病組大鼠視網膜S100A8表達。3A、3B分別示正常對照組、糖尿病組大鼠免疫組織化學染色像，正常對照組大鼠各層細胞排列整齊；糖尿病大鼠各層細胞結構紊亂，異常血管內皮細胞核表達S100A8（黑箭）免疫組織化學染色 標尺：20 μm；3C示電泳圖，糖尿病組大鼠視網膜S100A8表達量升高
3 討論
糖尿病患者和糖尿病動物模型研究證實，DR進展伴隨眼內慢性炎癥反應[16]。NPDR患者眼組織中各種炎癥細胞因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8，腫瘤壞死因子-α和單核細胞趨化蛋白-1升高[17]。這提示炎癥反應在DR早期即已出現，可能參與增生性病變的進展。已有研究發現，血漿S100A8水平與DR進展相關[18]。本研究結果顯示，DR患者血漿外泌體和玻璃體S100A8水平高于NC組和DM組，進一步證明了該蛋白質含量增加與DR嚴重程度相關。這些發現表明外泌體及其內含有的S100A8蛋白可能與DR發病機制及炎癥進展相關。
既往研究表明，糖尿病模型鼠和糖尿病患者血液中外泌體含量高于正常對照組，糖尿病患者血漿中存在大量外泌體通過轉運促血管生成因子加重DR進展[8]。外泌體數量的增加和內容物的變化反映了糖尿病狀態下細胞分泌活動改變，與微血管并發癥進展相關。Huang等[9]證實DR患者血漿外泌體攜帶的補體數量增加，經血液循環可到達視網膜微血管，激活炎癥通路并促進DR患者視網膜微血管滲漏。在糖尿病患者體內炎癥狀態下，單核細胞與內皮細胞聯系尤為密切。經高糖處理后，單核細胞被激活，其外泌體中細胞間黏附分子-1表達增加，可進一步激活內皮細胞，加劇血管炎癥[9]。由此可知，循環外泌體在激活內皮細胞、運輸炎癥因子等方面均發揮重要作用。本研究結果表明，DR患者血漿外泌體中含有的S100A8蛋白水平升高且隨著DR進展加重，其變化趨勢與玻璃體中S100A8變化趨勢一致，進一步證實了血漿外泌體與DR炎癥進展密切相關。本研究結果顯示，血漿外泌體中S100A8含量與血漿中S100A8含量變化趨勢不一致。我們分析其可能的原因是，外泌體是由母細胞經過加工后分泌的小囊泡，可以反映母細胞的生理病理狀態，并且具有傳遞信息的功能，而血漿中的蛋白處于游離狀態，可能會被降解，或者以二聚體等復合體形式存在，并不能發揮相應的作用。并且，血漿外泌體和血漿的蛋白質分布具有極大的差異，血漿中含有大量的高豐度蛋白，極易掩蓋低豐度蛋白，而外泌體中的蛋白分布比較均勻。因此，我們推測外泌體中的蛋白更具有作為生物標志物的價值。
S100A8是嗜中性粒細胞和單核細胞表達的促炎蛋白，屬于損傷相關的分子模式蛋白家族，其促炎活性包括募集白細胞，促進細胞因子和趨化因子產生，以及調節白細胞的黏附和遷移。近期研究表明，房水和血清中S100A8表達水平升高分別反映了復發性實驗性自身免疫性葡萄膜炎和青少年特發性關節炎相關葡萄膜炎的眼內炎癥[13,19]。以上結果表明，S100A8在炎癥反應過程中發揮作用。本研究結果證實DR患者玻璃體內S100A8含量高于NC組和DM組，表明DR眼內微環境存在炎癥特征。DM組較NC組含量并無差異，但PDR組顯著高于NPDR組和對照組（NC組和DM組）。我們推測糖尿病初期炎癥反應并不顯著，而視網膜病變的發生和進展伴隨炎癥反應的積累。
本研究結果顯示，大鼠視網膜多種細胞均表達S100A8，STZ誘導的糖尿病大鼠視網膜S100A8表達水平高于正常對照組。這進一步證實了S100A8參與視網膜炎癥反應。研究表明，S100A8作為炎癥反應的標志物，可能通過多種機制參與DR進展。高水平S100A8可以通過與模式識別受體結合以刺激先天免疫細胞，包括TLR4和晚期糖基化終產物受體等[20-21]，進一步激活黏附分子及炎性細胞因子，增加白細胞的黏附性，招募炎性細胞發生聚集，最終導致視網膜血管內皮細胞、周細胞和視網膜神經節細胞的損傷[22]。此外，S100A8與多種新生血管性疾病相關。膽管癌細胞含有高水平S100A8。Pan等[23]發現，S100A8通過激活TLR4/NF-κB通路上調VEGF表達，最終促進膽管癌組織內血管內皮細胞遷移。眼科研究中，Li等[24-25]通過動物實驗表明S100A8參與炎癥相關的角膜新生血管生成，體外實驗進一步證實低濃度的S100A8蛋白可以引起血管內皮細胞的增生、遷移和血管形成。以上結果說明，在DR進展過程中，S100A8介導的炎癥反應可能與新生血管存在相互作用，最終導致增生性病變的發生。
本研究結果表明，與不患有DR的糖尿病患者相比，DR患者的循環外泌體和玻璃體S100A8水平升高，糖尿病大鼠視網膜S100A8亦水平升高。這表明S100A8蛋白可能是DR炎癥環境的影響因素，是潛在的抗炎治療靶點。但S100A8在炎癥、血管生成等PDR病理過程中的作用機制還需要進一步深入探究。
糖尿病視網膜病變（DR）進行性視網膜損傷特征是毛細血管阻塞、新生血管形成、炎癥浸潤和血視網膜屏障破壞[1]。盡管機制尚未完全闡明，但越來越多的證據表明，慢性、無菌性的亞臨床炎癥是DR進展的重要原因[2-3]。外泌體是活細胞分泌的直徑為30～150 nm囊泡，在正常生理過程中發揮介導細胞間通訊的功能。血漿中存在大量外泌體，其來源廣泛，參與眼底疾病的發生和進展[4-5]。近年研究表明，糖尿病患者的循環外泌體可以介導內皮細胞損傷、血管炎癥和血視網膜屏障功能障礙等病理過程[6-7]，外泌體通過轉運促血管生成因子和炎癥因子可加重DR進展[8]。有研究表明，糖尿病模型鼠和糖尿病患者血液中外泌體含量高于正常對照組[9]。外泌體數量的增加和內容物的變化反映了糖尿病狀態下細胞分泌活動增強，與微血管并發癥和炎癥進展相關。鈣結合S100A8蛋白（S100A8）又稱為MRP8，主要表達于髓系細胞，其可以作用于細胞表面的Toll樣受體4（TLR4），激活核因子（NF）-κB通路[10]，在調節炎癥過程和免疫反應中發揮重要作用。研究已證實，高濃度循環S100A8蛋白是關節炎、慢性腸炎和葡萄膜炎等多種炎癥性疾病的標志物[11-13]。但關于S100A8參與糖尿病微血管并發癥的報道較少。本課題組前期對DR患者血漿外泌體進行蛋白質組學分析，發現其S100A8表達水平較無DR的2型糖尿病（T2DM）患者升高[14]。本研究擬觀察T2DM伴或不伴DR和無糖尿病的健康受試者血漿外泌體、微囊泡（MV）、血漿和玻璃體中S100A8表達水平，并在糖尿病大鼠視網膜組織中進行驗證，探討其與DR的相關性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
病例對照研究及基礎研究。本研究經天津醫科大學附屬眼科醫院倫理委員會審批（批準號：2017KY-01）。所有研究對象均知情同意；試驗程序遵循《赫爾辛基宣言》原則。
1.1 主要試劑和儀器
鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司），S100A8酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（日本MBL公司）；CD9一抗（ab92726）、CD63一抗（ab216130）、CD81一抗（ab10920）、β-肌動蛋白（actin）一抗（CST4970）、S100A8一抗（ab180735）（美國Abcam公司），二抗山羊抗兔（CST7074S）（美國CST公司）；免疫組織化學染色通用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（SP）試劑盒（中國中杉金橋生物技術有限公司）；快速考馬斯亮藍染色劑（北京索萊寶科技有限公司）。超高速離心機（德國貝克曼公司）；透射電子顯微鏡HT7700（日本日立公司）；納米粒度分析儀NS300（德國馬爾文公司）；凝膠成像系統（中國上海天能科技有限公司）；Olympus顯微鏡BX51（日本Olympus公司）。
1.2 受試者分組
2018年9月至2019年12月于天津醫科大學眼科醫院就診的T2DM患者、住院行玻璃體切割手術的患者以及同期健康體檢者共計73名納入本研究。其中，采集血漿32名，收集玻璃體液41名，并據此分為血漿樣本研究隊列和玻璃體樣本研究隊列。納入標準：（1）年齡40～85歲；（2）確診T2DM（健康體檢者血漿隊列研究除外）。排除標準：（1）糖尿病以外的代謝綜合征；（2）全身或眼部免疫性疾病；（3）除增生型DR（PDR）以外的血管病變，包括視網膜靜脈或動脈阻塞；（4）有眼外傷史；（5）青光眼。參照文獻[15]的分類方法，將受試者分為未發生眼底改變的單純糖尿病組（DM組）、非PDR組（NPDR組）和PDR組；健康體檢者作為正常對照組（NC組）。因健康人的玻璃體液無法獲取，故以黃斑前膜（ERM）或黃斑裂孔（MH）患者玻璃體液作為對照組。
1.3 大鼠STZ模型建立及分組
健康雄性Brown Norway大鼠18只，2月齡，體重280～320 g，清潔級，購于北京維通利華公司[動物生產許可證：SCXK（京）2016-0006]。所有實驗用鼠于相同條件下飼養，室溫下正常飲食，每日光照時間約12 h。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會許可（倫理編號：TJYY2019091124）。采用隨機數字表法將大鼠分為正常對照組和糖尿病組，每組9只。糖尿病組大鼠按照55 mg/kg劑量腹腔注射STZ，誘導糖尿病模型；正常對照組大鼠腹腔注射等體積緩沖液。注射3 d后糖尿病組大鼠血糖值＞16.7 mmol/L且出現多食、多尿、多飲即為建模成功。建模后5個月用于后續實驗。
1.4 差速離心法分離血漿外泌體和MV
1 ml血漿加入10 ml 磷酸鹽緩沖液（PBS），2000×g離心10 min，棄沉淀，將上清轉移至新的離心管中，10 000×g離心30 min，收集沉淀為MV；將上清轉移入超速離心管中，110 000×g離心120 min，棄上清，適量PBS重懸沉淀，將體積補充至11 ml，110 000×g離心120 min，得到的沉淀為外泌體，以上步驟均在4 ℃或冰上進行。
1.5 血漿外泌體和MV鑒定
20 μl PBS分別重懸外泌體和MV，各吸取10 μl滴于銅網上，沉淀10 min；吸取1%磷鎢酸10 μl滴加于銅網上染色3 min；濾紙吸去浮液，常溫下干燥10 min。上機檢測，80 V成像，透射電子顯微鏡觀察外泌體和MV形態。
PBS將外泌體或MV分別稀釋至1 ml體積，注入1 ml注射器中并裝載在納米粒度分析儀載物臺上，檢測粒子直徑，溫度25 ℃，模式為自動檢測并重復3次。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測外泌體表面標志物。根據二喹啉甲酸（BCA）試劑盒定量檢測的外泌體濃度，15 μg外泌體蛋白加入等體積蛋白上樣緩沖液，95 ℃，5 min。10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白混合物（濃縮膠、分離膠電壓分別為80、100 V），待分離膠前段跑至SDS-PAGE膠底部時停止電泳，以濕轉法將膠上蛋白轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，室溫下5%脫脂牛奶孵育2 h。加入抗CD9（1∶1000）、抗CD63（1∶1000）、抗CD81（1∶500）等一抗過夜。三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBST）洗膜10 min，3次；加入二抗山羊抗兔（1∶2000），室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，3次，增強化學發光法（ECL）顯色，凝膠成像系統曝光條帶。
根據BCA試劑盒定量檢測的外泌體、MV、血漿濃度，各取10 μg蛋白，加入等體積蛋白上樣緩沖液，95 ℃，5 min。10%SDS-PAGE分離蛋白混合物（濃縮膠、分離膠電壓分別為80、100 V），待分離膠前段跑至SDS-PAGE膠底部時停止電泳。加入快速考馬斯亮藍染色劑，室溫孵育2 h；去離子水清洗2 h；使用凝膠拍照系統拍攝SDS-PAGE。
1.6 ELISA檢測樣品中S100A8含量
試劑盒中稀釋液分別將血漿外泌體、MV和玻璃體液稀釋至100 μl，按照試劑盒推薦方法，將樣本、稀釋后標準品加入測量孔中，室溫孵育1 h，清洗緩沖液清洗4次，加入稀釋后鏈霉親和素-辣根過氧化物酶，室溫孵育1 h，清洗緩沖液清洗4次，顯色劑顯色，終止劑停止顯色。酶標儀測量波長分別為450、540 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。
1.7 免疫組織化學染色及Western blot檢測大鼠視網膜S100A8表達
隨機選取糖尿病組、正常對照組大鼠各3只脫頸處死，摘除眼球，10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片。采用SP法行免疫組織化學染色，兔抗大鼠S100A8多克隆抗體標記 S100A8 蛋白，120 ℃，4 min，二氨基聯苯胺顯色、蘇木精復染、分化、沖洗返藍、脫水、透明和中性樹膠封片。
隨機選取糖尿病組、正常對照組大鼠各3只脫頸處死，摘除眼球剝離視網膜，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒定量檢測蛋白濃度，各取50 μg蛋白加入等體積蛋白上樣緩沖液，95 ℃，5 min。10%SDS-PAGE分離蛋白混合物（濃縮膠、分離膠電壓分別為80、100 V電壓），分離膠前段跑至SDS-PAGE膠底部時停止電泳，以濕轉法將膠上的蛋白轉印至PVDF膜上，室溫下5%脫脂牛奶孵育2 h。加入抗S100A8（1:1000）、抗β-actin（1:5000）一抗過夜。TBST洗膜10 min，3次，加入二抗山羊抗兔（1:2000、1:10000），室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，3次，ECL顯色，凝膠成像系統曝光條帶。重復3次，應用Image J軟件進行灰度分析。
1.8 統計學方法
采用SPSS 20.0軟件行統計學分析。計量數據以均數±標準差（）表示。兩組間計量數據經正態性分布檢驗后采用t檢驗；多組間計量數據經正態性和方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，組內兩兩比較采取最小顯著性差異法，方差不齊時采用秩和檢驗。各組性別構成比比較行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
血漿樣本研究隊列中，NC組、DM組、NPDR組、PDR組受試者均為8例。4個組患者間年齡、性別構成比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；糖化血紅蛋白（HbA1c）水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中PDR組患者HbA1c水平較高。玻璃體樣本研究隊列中，對照組、DM組、PDR組各11例，NPDR組8例。NC組、DM組中，ERM、MH分別為7、4例和9、2例；NPDR組11例均為ERM。4個組患者間年齡、性別構成比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；HbA1c水平比較，差異有統計學意義（F=3.456，P=0.046），其中PDR組患者HbA1c水平較高。兩隊列研究中，各組患者間糖尿病病程、體重和基本生化指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1，2）。
表1
血漿樣本隊列研究4個組受試者基本信息
表2
玻璃體樣本隊列研究4個組受試者基本信息
透射電子顯微鏡觀察結果顯示，外泌體具有典型雙層膜結構，呈“茶托”樣（圖1A）；粒子直徑50.0～200.0 nm，平均直徑136.1 nm。MV呈圓形囊泡結構（圖1B），粒子直徑＞200.0 nm，平均直徑248.8 nm。外泌體表達經典標志物CD9、CD63、CD81（圖1C）。考馬斯亮藍凝膠染色顯示，血漿具有高豐度蛋白，相對分子質量72×103；外泌體、MV未見血漿中的高豐度蛋白。外泌體具有相對分子質量130～250×103、72～95×103的特征性蛋白組分；MV具有相對分子質量36×103的特征性蛋白條帶（圖1D）。
圖1
血漿外泌體、MV鑒定結果。1A示透射電子顯微鏡像，外泌體呈典型“茶托”樣雙層膜結構 負染 標尺：200 nm；1B示透射電子顯微鏡像，MV呈圓形囊泡樣 負染 標尺：200 nm；1C示電泳圖，外泌體表達經典標志物CD9、CD63、CD81；1D示電泳圖，外泌體、血漿和MV具有不同的蛋白質分布
血漿樣本隊列研究，4個組受試者之間血漿外泌體中S100A8質量濃度總體比較，差異有統計學意義（F=6.185，P=0.002）；PDR組患者血漿外泌體中S100A8質量濃度較NPDR組、DM組和NC組升高，差異有統計學意義（P=0.039、0.020、0.002）（圖2A）；4個組受試者之間血漿MV、血漿的S100A8質量濃度總體比較，差異無統計學意義（F=0.015、0.283，P=0.998、0.838）（圖2B，2C）。玻璃體樣本隊列研究，4個組患者間玻璃體S100A8質量濃度總體比較，差異有統計學意義（F=19.500，P＜0.001）；PDR組患者玻璃體中S100A8質量濃度較NPDR組、DM組和對照組升高，差異有統計學意義（P=0.002，P＜0.000、＜0.000）（圖2D）。
圖2
各組受試者血漿外泌體、MV、血漿和玻璃體液S100A8表達水平比較。2A示血漿外泌體S100A8水平；2B示血漿MV S100A8水平；2C示血漿S100A8水平；2D示玻璃體S100A8水平。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.000。NC組：正常對照組；DM組：糖尿病組；NPDR組：非增生型糖尿病視網膜病變組；PDR組：增生型糖尿病視網膜病變組
免疫組織化學染色結果顯示，正常對照組大鼠各層細胞排列整齊（圖3A）；糖尿病組大鼠視網膜神經節細胞、雙極細胞、視錐視桿細胞和血管內皮細胞均表達S100A8蛋白（圖3B）。Western blot檢測結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病組大鼠視網膜組織中S100A8表達水平升高，差異有統計學意義（t=8.028，P=0.001）（圖3C）。
圖3
正常對照組、糖尿病組大鼠視網膜S100A8表達。3A、3B分別示正常對照組、糖尿病組大鼠免疫組織化學染色像，正常對照組大鼠各層細胞排列整齊；糖尿病大鼠各層細胞結構紊亂，異常血管內皮細胞核表達S100A8（黑箭）免疫組織化學染色 標尺：20 μm；3C示電泳圖，糖尿病組大鼠視網膜S100A8表達量升高
3 討論
糖尿病患者和糖尿病動物模型研究證實，DR進展伴隨眼內慢性炎癥反應[16]。NPDR患者眼組織中各種炎癥細胞因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8，腫瘤壞死因子-α和單核細胞趨化蛋白-1升高[17]。這提示炎癥反應在DR早期即已出現，可能參與增生性病變的進展。已有研究發現，血漿S100A8水平與DR進展相關[18]。本研究結果顯示，DR患者血漿外泌體和玻璃體S100A8水平高于NC組和DM組，進一步證明了該蛋白質含量增加與DR嚴重程度相關。這些發現表明外泌體及其內含有的S100A8蛋白可能與DR發病機制及炎癥進展相關。
既往研究表明，糖尿病模型鼠和糖尿病患者血液中外泌體含量高于正常對照組，糖尿病患者血漿中存在大量外泌體通過轉運促血管生成因子加重DR進展[8]。外泌體數量的增加和內容物的變化反映了糖尿病狀態下細胞分泌活動改變，與微血管并發癥進展相關。Huang等[9]證實DR患者血漿外泌體攜帶的補體數量增加，經血液循環可到達視網膜微血管，激活炎癥通路并促進DR患者視網膜微血管滲漏。在糖尿病患者體內炎癥狀態下，單核細胞與內皮細胞聯系尤為密切。經高糖處理后，單核細胞被激活，其外泌體中細胞間黏附分子-1表達增加，可進一步激活內皮細胞，加劇血管炎癥[9]。由此可知，循環外泌體在激活內皮細胞、運輸炎癥因子等方面均發揮重要作用。本研究結果表明，DR患者血漿外泌體中含有的S100A8蛋白水平升高且隨著DR進展加重，其變化趨勢與玻璃體中S100A8變化趨勢一致，進一步證實了血漿外泌體與DR炎癥進展密切相關。本研究結果顯示，血漿外泌體中S100A8含量與血漿中S100A8含量變化趨勢不一致。我們分析其可能的原因是，外泌體是由母細胞經過加工后分泌的小囊泡，可以反映母細胞的生理病理狀態，并且具有傳遞信息的功能，而血漿中的蛋白處于游離狀態，可能會被降解，或者以二聚體等復合體形式存在，并不能發揮相應的作用。并且，血漿外泌體和血漿的蛋白質分布具有極大的差異，血漿中含有大量的高豐度蛋白，極易掩蓋低豐度蛋白，而外泌體中的蛋白分布比較均勻。因此，我們推測外泌體中的蛋白更具有作為生物標志物的價值。
S100A8是嗜中性粒細胞和單核細胞表達的促炎蛋白，屬于損傷相關的分子模式蛋白家族，其促炎活性包括募集白細胞，促進細胞因子和趨化因子產生，以及調節白細胞的黏附和遷移。近期研究表明，房水和血清中S100A8表達水平升高分別反映了復發性實驗性自身免疫性葡萄膜炎和青少年特發性關節炎相關葡萄膜炎的眼內炎癥[13,19]。以上結果表明，S100A8在炎癥反應過程中發揮作用。本研究結果證實DR患者玻璃體內S100A8含量高于NC組和DM組，表明DR眼內微環境存在炎癥特征。DM組較NC組含量并無差異，但PDR組顯著高于NPDR組和對照組（NC組和DM組）。我們推測糖尿病初期炎癥反應并不顯著，而視網膜病變的發生和進展伴隨炎癥反應的積累。
本研究結果顯示，大鼠視網膜多種細胞均表達S100A8，STZ誘導的糖尿病大鼠視網膜S100A8表達水平高于正常對照組。這進一步證實了S100A8參與視網膜炎癥反應。研究表明，S100A8作為炎癥反應的標志物，可能通過多種機制參與DR進展。高水平S100A8可以通過與模式識別受體結合以刺激先天免疫細胞，包括TLR4和晚期糖基化終產物受體等[20-21]，進一步激活黏附分子及炎性細胞因子，增加白細胞的黏附性，招募炎性細胞發生聚集，最終導致視網膜血管內皮細胞、周細胞和視網膜神經節細胞的損傷[22]。此外，S100A8與多種新生血管性疾病相關。膽管癌細胞含有高水平S100A8。Pan等[23]發現，S100A8通過激活TLR4/NF-κB通路上調VEGF表達，最終促進膽管癌組織內血管內皮細胞遷移。眼科研究中，Li等[24-25]通過動物實驗表明S100A8參與炎癥相關的角膜新生血管生成，體外實驗進一步證實低濃度的S100A8蛋白可以引起血管內皮細胞的增生、遷移和血管形成。以上結果說明，在DR進展過程中，S100A8介導的炎癥反應可能與新生血管存在相互作用，最終導致增生性病變的發生。
本研究結果表明，與不患有DR的糖尿病患者相比，DR患者的循環外泌體和玻璃體S100A8水平升高，糖尿病大鼠視網膜S100A8亦水平升高。這表明S100A8蛋白可能是DR炎癥環境的影響因素，是潛在的抗炎治療靶點。但S100A8在炎癥、血管生成等PDR病理過程中的作用機制還需要進一步深入探究。
