引用本文： 施曉萌, 李亞, 謝坤鵬, 游雅, 雷博. 2型Usher綜合征和視網膜色素變性家系USH2A基因突變及臨床表型分析. 中華眼底病雜志, 2020, 36(3): 178-183. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190912-00286 復制
Usher綜合征（USH）是一種以耳聾和視網膜色素變性（RP）為特征的常染色體隱性遺傳性疾病[1]。臨床上2型USH（USH2）是最為常見的亞型，其中約70%的USH2患者是由于USH2A基因突變所致[2]；同時也是常染色體隱性遺傳非綜合征性RP最常見的致病基因[3]。USH2A基因定位于1號染色體長臂，具有高度遺傳異質性，目前已鑒定出400余種USH2A的突變，包括錯義突變、無義突變、截短突變、染色體復制等多種形式[4-6]。我們采用基于靶向捕獲的二代測序技術對1個USH2家系和2個RP家系進行了基因突變檢測，發現3個家系致病基因均為USH2A。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。遵循赫爾辛基宣言；所有受檢者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2018年8月至2019年1月于河南省立眼科醫院就診的USH2和RP 3個家系的4例患者和11名正常家系成員納入本研究。
詳細詢問病史和家族史并繪制家系圖。行視力、裂隙燈顯微鏡、眼底彩色照相、OCT、視野、全視野ERG檢查。所有患者病史、家族史及臨床表現符合RP診斷標準[7]。USH2：符合典型RP眼底改變, 且伴中等程度的耳聾，前庭功能正常[7]。3個家系中（圖1），家系1為USH2；家系2、3為RP。排除近期接受放射治療或化學藥物治療者。
圖1
家系圖。1A~1C分別示家系1~3。□：正常男性，○：正常女性；■：男性患者，●：女性患者；↗：先證者。M1:c.13877-13880 del AGAC（p. Q4626P）; M2：c.798 del T（p. F266L）；M3：c.15178T > c（p. S5060P）（M3）；M4：c.6986C > A（p. P2329H）；M5:c.5836C>T（p. R1946X）；M6：c.14951C>T (p. P4984L)；M7：c.11156G>A (p. R3719H)
抽取受檢者外周靜脈血3～5 ml，EDTA抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組DNA提取試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA，紫外分光光度計定量。家系1應用北京信諾佰世醫學研究所提供的遺傳眼病目標基因試劑盒對目前已知的1651個致病基因的外顯子及相鄰內含子區域進行捕獲；家系2應用杭州科寧生物科技有限公司提供的睿視寧檢測模塊對256個與視網膜疾病相關的基因編碼區進行檢測。家系3應用我院自主研發的與視網膜遺傳病相關的試劑盒進行檢測。
應用SIFT、Polyphen2、Mutation Taster預測氨基酸突變對蛋白功能的影響。應用千人基因組計劃、人類基因突變數據庫（HGMD）、ExAc、ClinVar數據庫收錄的信息進行對比。對檢測出的可疑致病突變均通過Sanger測序進行驗證，并在家系成員中進行共分離。數據解讀規則參考美國醫學遺傳學和基因組學學院相關指南。對新發現的變異進行氨基酸保守性分析。
2 結果
家系1 先證者（Ⅱ5），女，56歲。自述雙眼視力下降伴夜盲、耳聾40余年。前庭功能未見異常。右眼BCVA 0.3（－2.00 DS），左眼BCVA 0.15（－0.75DS/－1.50 DC×15）。雙眼視盤邊界清楚、顏色蒼白。視網膜血管纖細，中周部視網膜呈椒鹽狀，可見骨細胞樣色素團塊（圖2A）。視野呈環形暗點（圖2B）。神經上皮外層變薄且結構紊亂，RPE粗糙變薄（圖2C）。全視野ERG明適應、暗適應a、b波熄滅型。家系成員Ⅱ3、Ⅲ2視力、眼底、視野、OCT、全視野ERG檢查均未見異常。基因檢測結果顯示，先證者（Ⅱ5）USH2A基因第64、5號外顯子分別存在c.13877-13880 del AGAC（p. Q4626P）（M1）、c.798 del T（p. F266L）（M2）2個雜合性移碼突變（圖3）。2個變異均未在正常人群數據庫中檢出且HGMD數據庫未報道。Polyphen2蛋白預測軟件評分M1為0.800，M2為0.994。家系成員中，Ⅱ3基因檢測結果未見異常；Ⅲ2攜帶M2。
圖2
家系1先證者左眼彩色眼底、視野、OCT、ERG像。2A示彩色眼底像，視盤邊界清楚、顏色蒼白，視網膜血管纖細，中周部視網膜呈椒鹽狀，可見骨細胞樣色素團塊；2B示視野檢查像，視野呈環形暗點；2C示OCT像，神經上皮外層變薄且結構紊亂，RPE粗糙變薄
圖3
家系1先證者和家系成員基因測序圖。3A示先證者（Ⅱ5）USH2A基因第64號外顯子存在c.13877-13880 del AGAC（p. Q4626P）雜合性移碼突變（黑箭）；3B、3C分別示家系成員Ⅱ3、Ⅲ2該位點不存在突變。3D示先證者（Ⅱ5）USH2A基因第5號外顯子c.798 del T（p. F266L）雜合性移碼突變（黑箭）；3E示家系成員Ⅱ3該位點不存在突變；3F示家系成員Ⅲ2攜帶該位點突變（黑箭）
家系2 先證者（Ⅱ1），男，40歲。主訴雙眼自幼視力差伴夜盲。右眼BCVA 0.6（－2.25 DS），左眼BCVA 0.4（－2.00 DS）。雙眼視盤邊界清楚、顏色蒼白；視網膜血管纖細，周邊可見骨細胞樣色素沉著。雙眼均呈管狀視野。外核層及其后極部外顆粒層變薄，部分消失；除黃斑中心凹外橢圓體帶缺失，RPE粗糙變薄。全視野ERG明適應、暗適應均呈熄滅型。先證者弟弟（Ⅱ3），38歲，臨床表型符合RP診斷。家系成員Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅲ1、Ⅲ3、Ⅲ4視力、眼底、視野、OCT、全視野ERG檢查均未見異常。基因檢測結果顯示，先證者及其弟弟（Ⅱ3） USH2A基因第70、37、29號外顯子分別存在c.15178T＞c（p. S5060P）（M3）、c.6986C＞A（p. P2329H）（M4）2個雜合性錯義突變和c.5836C＞T（p. R1946X）（M5）終止突變（圖4）。M3在ExAc數據庫中檢出頻率為0.000 0329 5，M4為0.000 0247 1, HGMD數據庫均未報道。Polyphen2評分M3為0.979，M4為1.000。家系成員中，Ⅰ1攜帶M3、M4，Ⅰ2攜帶M5；Ⅲ1攜帶M3、M4，Ⅲ3攜帶M3、M4，Ⅲ4攜帶M5（圖4）。對該家系進行分析顯示符合家系共分離。
圖4
家系2先證者和家系成員基因測序圖。4A~4C示先證者（Ⅱ1），4D~4F示患者Ⅱ3；4G~4U分別示家系成員Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅲ1、Ⅲ3、Ⅲ4。先證者及患者Ⅱ3 USH2A第50、37、29號外顯子分別存在c.15178T＞c（p. S5060P）、c.6986C＞A（p. P2329H）2個雜合性錯義突變（黑箭）和c.5836C＞T（p. R1946X）終止突變（黑箭）。家系成員中Ⅰ1攜帶M3、M4（黑箭），Ⅰ2攜帶M5（黑箭）；Ⅲ1攜帶M3、M4（黑箭），Ⅲ3攜帶M3、M4（黑箭），Ⅲ4攜帶M5（黑箭）
家系3 先證者（Ⅱ2），女，55歲。自述雙眼夜盲20余年。右眼視力0.8，左眼視力0.5；均不能矯正。雙眼視盤邊界清楚、顏色蠟黃；視網膜血管纖細并呈青灰色，可見散在色素沉著，累及黃斑。雙眼視野向心性縮小。黃斑外圍外層視網膜變薄，結構紊亂。視錐和視桿細胞功能重度降低。家系成員Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ4視力、眼底、視野、OCT、全視野ERG檢查均未見異常。基因檢測結果顯示，先證者USH2A基因第67、57號外顯子分別存在c.14951C＞T (p. P4984L)（M6）、c.11156G＞A (p. R3719H)（M7）2個雜合錯義突變。M6在ExAc數據庫中檢出頻率為0.000 0576 5，且HGMD數據庫未見報道，Polyphen2評分為0.978。家系成員Ⅰ2、Ⅱ1分別攜帶M6、M7；Ⅱ3、Ⅱ4該位點未見突變（圖5）。
圖5
家系3先證者和家系成員基因測序圖。5A、5B示先證者（Ⅱ2）；5C~5J分別示家系成員Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ4。先證者USH2A基因第67、57號外顯子分別存在c.14951C＞T (p. P4984L)（M6）、c.11156G＞A (p. R3719H)（M7）2個雜合錯義突變（黑箭）；家系成員Ⅰ2、Ⅱ1分別攜帶M6、M7（黑箭），Ⅱ3、Ⅱ4該位點未見突變
SIFT、Polyphen2、Mutation Taster預測結果顯示，M1、M2、M5、M7具有致病性；M3、M4、M6可能致病。其中，M1～M4、M6為新發現突變位點。蛋白序列同源性分析結果顯示，USH2A p. Q4626P、p. F266L、p. S5060P、p. P2329H、p. P4984L所對應的氨基酸位點在多個物種中均高度保守（圖6）。
圖6
USH2A蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖。USH2A p. Q4626P、p. F266L、p. S5060P、p. P2329H、p. P4984L所對應的氨基酸位點在人（Human）、小鼠（Mouse）、豚鼠（Cavpo）、家犬（Canlf）、松鼠（Icttr）、獼猴（Macmu）、猩猩（Pantr）哺乳動物中均高度保守（黑箭）
3 討論
本研究中3個家系的臨床表型不同，分別為累及聽覺系統的USH2和非綜合征性RP。基因檢測結果致病基因均為USH2A，但其變異類型不同。3個家系共發現7個變異，其中包括5個新發現變異和2個既往文獻已報道的變異。
USH2A包含72個外顯子，編碼5202個氨基酸。其有兩種選擇性剪切異構體，較短的異構體命名為a，包含21個外顯子；較長的異構體命名為b，是短異構體3’末端后的51個外顯子。異構體a被認為是參與蛋白質之間或蛋白質-基質相互作用的細胞外基質蛋白。異構體b編碼的Usherin蛋白是一種跨膜蛋白，表達于耳蝸毛細胞的靜纖毛及哺乳生物的視網膜光感受器中，位于連接纖毛上，連接視網膜光感受器內段和外段，對于視覺和聽覺功能十分重要[8-11]。USH2A由N端信號肽、層粘連蛋白G樣結構域、層粘連蛋白N端、層粘連蛋白表皮生長因子結構域、層粘連蛋白G結構域、Ⅲ型纖維連接蛋白結構域、跨膜區以及位于細胞膜內羧基末端的PDZ結合結構域組成[12]。目前已證實USH2A基因突變與常染色體隱性USH2和非綜合征性RP相關[4, 13]。
本研究結果顯示，家系1先證者USH2A基因存在的2個雜合移碼突變M1和M2既往均未見文獻報道，也未在正常人數據庫中檢出，為新發現的突變位點。蛋白序列同源性分析發現新突變位點在多物種中均具有高度保守性；SIFT、Polyphen2、Mutation Taster軟件對其進行功能和致病性預測，結果顯示M1、M2均為移碼突變，具有致病性；可導致氨基酸的異常翻譯，提前終止多肽鏈的合成，為功能喪失型變異。上述新發現的變異既往已有多篇移碼變異及無義變異致病的報道。根據現有證據，上述雜合變異均定義為致病性變異。
家系2先證者和患者USH2A基因存在2個新的雜合錯義突變M3和M4，以及一個已知的致病雜合突變M5。M3、M4均來自先證者父親，位于同一等位基因；M5來自先證者母親，位于另一個等位基因。McGee等[14]曾在1例USH2患者中檢測到M5雜合突異。保守性分析發現具有高度保守性。M3、M4在本家系中均同時存在，但兩者致病性卻具有一定差異。其中2個新的雜合突變均為錯義突變，導致氨基酸序列發生改變，剪接位點發生改變，蛋白功能可能受到影響。M3可能為單核苷酸多態性改變，其致病性尚未見報道。預測結果顯示M4致病性較高。M5是一個已報道的終止變異，該變異使得蛋白合成提前終止。這些變異同時存在可導致RP，單獨不致病，并且無耳聾表型。
家系3先證者USH2A基因存在一個新的錯義突變M6和1個已知致病錯義突變M7。M6具有高度保守性。該突變位點可導致氨基酸序列發生改變影響蛋白功能。M7為既往已報道致病突變，其使氨基酸序列發生改變，剪接位點發生改變，蛋白功能受到影響[15]。
由USH2A突變引起的常染色體隱性USH2和非綜合征性RP可能與其高度遺傳異質性有關。有學者發現USH2A基因變異導致非綜合征性RP，其變異位點位于USH2A基因編碼的長異構體b上[16]。異構體b在視網膜和耳蝸中均有表達，但主要表達于視網膜，而在耳蝸中轉錄水平低。盡管USH2A的長異構體b上有2個錯義突變，殘留的Usherin蛋白也完全可以滿足內耳靜纖毛的功能，但卻不能維持視網膜上光感受器的功能。因此該變異對聽力不會產生明顯損害，但可導致RP[16]。也有學者提出2個新的錯義突變組成的復合雜合變異可能是不伴聽力損失RP的原因[15]。本研究3個家系患者均為USH2A基因變突變所致，但臨床表型卻不同。家系1為USH2A基因突變所引起的移碼變異，家系2為錯義突變和終止突變，家系3為錯義突變。因此有可能是因為不同變異在不同程度影響蛋白質翻譯和合成，引起蛋白功能的改變，從而引起累及聽覺系統的USH2和非綜合征性RP。因USH2A基因過大，目前對其功能研究有限。隨著病例數的增加和對突變位點功能及機制的研究，可能會對這一結論做出論證。
目前基因替代治療臨床試驗在某些基因所致的RP患者中取得良好效果，但對USH2A基因突變所導致的USH2和RP尚未取得突破性進展。對于USH2A的具體功能，尤其在視網膜中參與什么通路依然未知。本研究結果擴大了已知USH2A突變和相關臨床表型的范圍，提供了一些基因型和表型的相關聯系，為其具有高度的遺傳異質性提供了新的證據。這些發現為USH2A的機制研究提供了依據，也為診斷USH2和非綜合征性RP以及將基因治療應用于與USH2A突變相關的疾病奠定了基礎。
Usher綜合征（USH）是一種以耳聾和視網膜色素變性（RP）為特征的常染色體隱性遺傳性疾病[1]。臨床上2型USH（USH2）是最為常見的亞型，其中約70%的USH2患者是由于USH2A基因突變所致[2]；同時也是常染色體隱性遺傳非綜合征性RP最常見的致病基因[3]。USH2A基因定位于1號染色體長臂，具有高度遺傳異質性，目前已鑒定出400余種USH2A的突變，包括錯義突變、無義突變、截短突變、染色體復制等多種形式[4-6]。我們采用基于靶向捕獲的二代測序技術對1個USH2家系和2個RP家系進行了基因突變檢測，發現3個家系致病基因均為USH2A。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。遵循赫爾辛基宣言；所有受檢者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2018年8月至2019年1月于河南省立眼科醫院就診的USH2和RP 3個家系的4例患者和11名正常家系成員納入本研究。
詳細詢問病史和家族史并繪制家系圖。行視力、裂隙燈顯微鏡、眼底彩色照相、OCT、視野、全視野ERG檢查。所有患者病史、家族史及臨床表現符合RP診斷標準[7]。USH2：符合典型RP眼底改變, 且伴中等程度的耳聾，前庭功能正常[7]。3個家系中（圖1），家系1為USH2；家系2、3為RP。排除近期接受放射治療或化學藥物治療者。
圖1
家系圖。1A~1C分別示家系1~3。□：正常男性，○：正常女性；■：男性患者，●：女性患者；↗：先證者。M1:c.13877-13880 del AGAC（p. Q4626P）; M2：c.798 del T（p. F266L）；M3：c.15178T > c（p. S5060P）（M3）；M4：c.6986C > A（p. P2329H）；M5:c.5836C>T（p. R1946X）；M6：c.14951C>T (p. P4984L)；M7：c.11156G>A (p. R3719H)
抽取受檢者外周靜脈血3～5 ml，EDTA抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組DNA提取試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA，紫外分光光度計定量。家系1應用北京信諾佰世醫學研究所提供的遺傳眼病目標基因試劑盒對目前已知的1651個致病基因的外顯子及相鄰內含子區域進行捕獲；家系2應用杭州科寧生物科技有限公司提供的睿視寧檢測模塊對256個與視網膜疾病相關的基因編碼區進行檢測。家系3應用我院自主研發的與視網膜遺傳病相關的試劑盒進行檢測。
應用SIFT、Polyphen2、Mutation Taster預測氨基酸突變對蛋白功能的影響。應用千人基因組計劃、人類基因突變數據庫（HGMD）、ExAc、ClinVar數據庫收錄的信息進行對比。對檢測出的可疑致病突變均通過Sanger測序進行驗證，并在家系成員中進行共分離。數據解讀規則參考美國醫學遺傳學和基因組學學院相關指南。對新發現的變異進行氨基酸保守性分析。
2 結果
家系1 先證者（Ⅱ5），女，56歲。自述雙眼視力下降伴夜盲、耳聾40余年。前庭功能未見異常。右眼BCVA 0.3（－2.00 DS），左眼BCVA 0.15（－0.75DS/－1.50 DC×15）。雙眼視盤邊界清楚、顏色蒼白。視網膜血管纖細，中周部視網膜呈椒鹽狀，可見骨細胞樣色素團塊（圖2A）。視野呈環形暗點（圖2B）。神經上皮外層變薄且結構紊亂，RPE粗糙變薄（圖2C）。全視野ERG明適應、暗適應a、b波熄滅型。家系成員Ⅱ3、Ⅲ2視力、眼底、視野、OCT、全視野ERG檢查均未見異常。基因檢測結果顯示，先證者（Ⅱ5）USH2A基因第64、5號外顯子分別存在c.13877-13880 del AGAC（p. Q4626P）（M1）、c.798 del T（p. F266L）（M2）2個雜合性移碼突變（圖3）。2個變異均未在正常人群數據庫中檢出且HGMD數據庫未報道。Polyphen2蛋白預測軟件評分M1為0.800，M2為0.994。家系成員中，Ⅱ3基因檢測結果未見異常；Ⅲ2攜帶M2。
圖2
家系1先證者左眼彩色眼底、視野、OCT、ERG像。2A示彩色眼底像，視盤邊界清楚、顏色蒼白，視網膜血管纖細，中周部視網膜呈椒鹽狀，可見骨細胞樣色素團塊；2B示視野檢查像，視野呈環形暗點；2C示OCT像，神經上皮外層變薄且結構紊亂，RPE粗糙變薄
圖3
家系1先證者和家系成員基因測序圖。3A示先證者（Ⅱ5）USH2A基因第64號外顯子存在c.13877-13880 del AGAC（p. Q4626P）雜合性移碼突變（黑箭）；3B、3C分別示家系成員Ⅱ3、Ⅲ2該位點不存在突變。3D示先證者（Ⅱ5）USH2A基因第5號外顯子c.798 del T（p. F266L）雜合性移碼突變（黑箭）；3E示家系成員Ⅱ3該位點不存在突變；3F示家系成員Ⅲ2攜帶該位點突變（黑箭）
家系2 先證者（Ⅱ1），男，40歲。主訴雙眼自幼視力差伴夜盲。右眼BCVA 0.6（－2.25 DS），左眼BCVA 0.4（－2.00 DS）。雙眼視盤邊界清楚、顏色蒼白；視網膜血管纖細，周邊可見骨細胞樣色素沉著。雙眼均呈管狀視野。外核層及其后極部外顆粒層變薄，部分消失；除黃斑中心凹外橢圓體帶缺失，RPE粗糙變薄。全視野ERG明適應、暗適應均呈熄滅型。先證者弟弟（Ⅱ3），38歲，臨床表型符合RP診斷。家系成員Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅲ1、Ⅲ3、Ⅲ4視力、眼底、視野、OCT、全視野ERG檢查均未見異常。基因檢測結果顯示，先證者及其弟弟（Ⅱ3） USH2A基因第70、37、29號外顯子分別存在c.15178T＞c（p. S5060P）（M3）、c.6986C＞A（p. P2329H）（M4）2個雜合性錯義突變和c.5836C＞T（p. R1946X）（M5）終止突變（圖4）。M3在ExAc數據庫中檢出頻率為0.000 0329 5，M4為0.000 0247 1, HGMD數據庫均未報道。Polyphen2評分M3為0.979，M4為1.000。家系成員中，Ⅰ1攜帶M3、M4，Ⅰ2攜帶M5；Ⅲ1攜帶M3、M4，Ⅲ3攜帶M3、M4，Ⅲ4攜帶M5（圖4）。對該家系進行分析顯示符合家系共分離。
圖4
家系2先證者和家系成員基因測序圖。4A~4C示先證者（Ⅱ1），4D~4F示患者Ⅱ3；4G~4U分別示家系成員Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅲ1、Ⅲ3、Ⅲ4。先證者及患者Ⅱ3 USH2A第50、37、29號外顯子分別存在c.15178T＞c（p. S5060P）、c.6986C＞A（p. P2329H）2個雜合性錯義突變（黑箭）和c.5836C＞T（p. R1946X）終止突變（黑箭）。家系成員中Ⅰ1攜帶M3、M4（黑箭），Ⅰ2攜帶M5（黑箭）；Ⅲ1攜帶M3、M4（黑箭），Ⅲ3攜帶M3、M4（黑箭），Ⅲ4攜帶M5（黑箭）
家系3 先證者（Ⅱ2），女，55歲。自述雙眼夜盲20余年。右眼視力0.8，左眼視力0.5；均不能矯正。雙眼視盤邊界清楚、顏色蠟黃；視網膜血管纖細并呈青灰色，可見散在色素沉著，累及黃斑。雙眼視野向心性縮小。黃斑外圍外層視網膜變薄，結構紊亂。視錐和視桿細胞功能重度降低。家系成員Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ4視力、眼底、視野、OCT、全視野ERG檢查均未見異常。基因檢測結果顯示，先證者USH2A基因第67、57號外顯子分別存在c.14951C＞T (p. P4984L)（M6）、c.11156G＞A (p. R3719H)（M7）2個雜合錯義突變。M6在ExAc數據庫中檢出頻率為0.000 0576 5，且HGMD數據庫未見報道，Polyphen2評分為0.978。家系成員Ⅰ2、Ⅱ1分別攜帶M6、M7；Ⅱ3、Ⅱ4該位點未見突變（圖5）。
圖5
家系3先證者和家系成員基因測序圖。5A、5B示先證者（Ⅱ2）；5C~5J分別示家系成員Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ4。先證者USH2A基因第67、57號外顯子分別存在c.14951C＞T (p. P4984L)（M6）、c.11156G＞A (p. R3719H)（M7）2個雜合錯義突變（黑箭）；家系成員Ⅰ2、Ⅱ1分別攜帶M6、M7（黑箭），Ⅱ3、Ⅱ4該位點未見突變
SIFT、Polyphen2、Mutation Taster預測結果顯示，M1、M2、M5、M7具有致病性；M3、M4、M6可能致病。其中，M1～M4、M6為新發現突變位點。蛋白序列同源性分析結果顯示，USH2A p. Q4626P、p. F266L、p. S5060P、p. P2329H、p. P4984L所對應的氨基酸位點在多個物種中均高度保守（圖6）。
圖6
USH2A蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖。USH2A p. Q4626P、p. F266L、p. S5060P、p. P2329H、p. P4984L所對應的氨基酸位點在人（Human）、小鼠（Mouse）、豚鼠（Cavpo）、家犬（Canlf）、松鼠（Icttr）、獼猴（Macmu）、猩猩（Pantr）哺乳動物中均高度保守（黑箭）
3 討論
本研究中3個家系的臨床表型不同，分別為累及聽覺系統的USH2和非綜合征性RP。基因檢測結果致病基因均為USH2A，但其變異類型不同。3個家系共發現7個變異，其中包括5個新發現變異和2個既往文獻已報道的變異。
USH2A包含72個外顯子，編碼5202個氨基酸。其有兩種選擇性剪切異構體，較短的異構體命名為a，包含21個外顯子；較長的異構體命名為b，是短異構體3’末端后的51個外顯子。異構體a被認為是參與蛋白質之間或蛋白質-基質相互作用的細胞外基質蛋白。異構體b編碼的Usherin蛋白是一種跨膜蛋白，表達于耳蝸毛細胞的靜纖毛及哺乳生物的視網膜光感受器中，位于連接纖毛上，連接視網膜光感受器內段和外段，對于視覺和聽覺功能十分重要[8-11]。USH2A由N端信號肽、層粘連蛋白G樣結構域、層粘連蛋白N端、層粘連蛋白表皮生長因子結構域、層粘連蛋白G結構域、Ⅲ型纖維連接蛋白結構域、跨膜區以及位于細胞膜內羧基末端的PDZ結合結構域組成[12]。目前已證實USH2A基因突變與常染色體隱性USH2和非綜合征性RP相關[4, 13]。
本研究結果顯示，家系1先證者USH2A基因存在的2個雜合移碼突變M1和M2既往均未見文獻報道，也未在正常人數據庫中檢出，為新發現的突變位點。蛋白序列同源性分析發現新突變位點在多物種中均具有高度保守性；SIFT、Polyphen2、Mutation Taster軟件對其進行功能和致病性預測，結果顯示M1、M2均為移碼突變，具有致病性；可導致氨基酸的異常翻譯，提前終止多肽鏈的合成，為功能喪失型變異。上述新發現的變異既往已有多篇移碼變異及無義變異致病的報道。根據現有證據，上述雜合變異均定義為致病性變異。
家系2先證者和患者USH2A基因存在2個新的雜合錯義突變M3和M4，以及一個已知的致病雜合突變M5。M3、M4均來自先證者父親，位于同一等位基因；M5來自先證者母親，位于另一個等位基因。McGee等[14]曾在1例USH2患者中檢測到M5雜合突異。保守性分析發現具有高度保守性。M3、M4在本家系中均同時存在，但兩者致病性卻具有一定差異。其中2個新的雜合突變均為錯義突變，導致氨基酸序列發生改變，剪接位點發生改變，蛋白功能可能受到影響。M3可能為單核苷酸多態性改變，其致病性尚未見報道。預測結果顯示M4致病性較高。M5是一個已報道的終止變異，該變異使得蛋白合成提前終止。這些變異同時存在可導致RP，單獨不致病，并且無耳聾表型。
家系3先證者USH2A基因存在一個新的錯義突變M6和1個已知致病錯義突變M7。M6具有高度保守性。該突變位點可導致氨基酸序列發生改變影響蛋白功能。M7為既往已報道致病突變，其使氨基酸序列發生改變，剪接位點發生改變，蛋白功能受到影響[15]。
由USH2A突變引起的常染色體隱性USH2和非綜合征性RP可能與其高度遺傳異質性有關。有學者發現USH2A基因變異導致非綜合征性RP，其變異位點位于USH2A基因編碼的長異構體b上[16]。異構體b在視網膜和耳蝸中均有表達，但主要表達于視網膜，而在耳蝸中轉錄水平低。盡管USH2A的長異構體b上有2個錯義突變，殘留的Usherin蛋白也完全可以滿足內耳靜纖毛的功能，但卻不能維持視網膜上光感受器的功能。因此該變異對聽力不會產生明顯損害，但可導致RP[16]。也有學者提出2個新的錯義突變組成的復合雜合變異可能是不伴聽力損失RP的原因[15]。本研究3個家系患者均為USH2A基因變突變所致，但臨床表型卻不同。家系1為USH2A基因突變所引起的移碼變異，家系2為錯義突變和終止突變，家系3為錯義突變。因此有可能是因為不同變異在不同程度影響蛋白質翻譯和合成，引起蛋白功能的改變，從而引起累及聽覺系統的USH2和非綜合征性RP。因USH2A基因過大，目前對其功能研究有限。隨著病例數的增加和對突變位點功能及機制的研究，可能會對這一結論做出論證。
目前基因替代治療臨床試驗在某些基因所致的RP患者中取得良好效果，但對USH2A基因突變所導致的USH2和RP尚未取得突破性進展。對于USH2A的具體功能，尤其在視網膜中參與什么通路依然未知。本研究結果擴大了已知USH2A突變和相關臨床表型的范圍，提供了一些基因型和表型的相關聯系，為其具有高度的遺傳異質性提供了新的證據。這些發現為USH2A的機制研究提供了依據，也為診斷USH2和非綜合征性RP以及將基因治療應用于與USH2A突變相關的疾病奠定了基礎。
