玻璃體腔注射抗VEGF藥物已逐漸成為治療糖尿病視網膜病變（DR）的一線方案。但由于DR血視網膜屏障損傷所引發的糖尿病黃斑水腫（DME）對抗VEGF藥物的敏感性較差，尋找可有效保護血管壁結構的補充藥物或替代藥物十分必要。褪黑激素是一種主要由松果體分泌的激素，可在人體內發揮調節生物節律、抗氧化應激、抗炎等多項功能。近年來，國內外研究表明，褪黑激素可在視網膜病變中通過多種機制改善神經細胞退行性變、保護血管結構。在對視網膜毛細血管結構的保護作用方面，褪黑激素可通過抗氧化應激、抗炎癥、抑制細胞凋亡等途徑改善早期DR內皮細胞及周細胞的損傷，保護血視網膜屏障結構的完整性，提示褪黑激素或可為DR尤其DME的防治提供新思路。
引用本文： 孫丹丹, 許迅. 褪黑激素對糖尿病視網膜病變內皮細胞及周細胞的保護作用研究現狀與進展. 中華眼底病雜志, 2020, 36(9): 745-748. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190321-00106 復制
玻璃體腔注射抗VEGF藥物已逐漸成為治療糖尿病視網膜病變（DR）的一線方案。但有研究表明，單獨抗VEGF藥物治療并不足以改善DR過程中毛細血管內皮細胞及周細胞的損傷以及由此導致的糖尿病黃斑水腫（DME）[1-2]。而目前常采用的玻璃體腔注射糖皮質激素治療雖可通過抗炎改善視力，但易誘發白內障、眼壓升高等并發癥[3]。因此，尋找有效的補充藥物或替代藥物來緩解甚至逆轉DR過程中血視網膜屏障（BRB）的破壞十分必要。通過保護毛細血管結構而減少VEGF的生成，預防視網膜新生血管（RNV）的出現，并有效治療DME，以彌補抗VEGF藥物治療的局限性。褪黑激素（melatonin）是一種主要由松果體分泌的激素，具有控制體內若干種生理節律的重要作用，同時也是最強大的天然自由基清除劑[4]。現有研究表明，褪黑激素水平異常可能與DR進展相關，褪黑激素治療可通過改善視網膜神經細胞退行性變、保護毛細血管結構、抑制RNV等途徑在包含DR在內的多種視網膜疾病中發揮保護作用[5-9]。現就褪黑激素對DR毛細血管內皮細胞和周細胞保護作用的研究現狀與進展作一綜述，以期為褪黑激素用于早期DR防治提供新的思路。
1 DR病理生理機制
糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝綜合征。糖代謝功能的異常及異常代謝產物的積累激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）通路和己糖胺通路等，并導致晚期糖基化終產物（AGEs）的累積，誘發進一步的氧化應激損傷、炎癥反應、細胞凋亡等多種損傷[10-11]。
持續高血糖狀態導致線粒體電子傳遞鏈功能異常，誘導NADPH氧化酶2和同工酶Nox 4的表達增加，催化產生過量的ROS[12]。細胞內氧化還原平衡狀態的破壞直接引發胞內蛋白質、脂質、核酸等生物大分子的氧化反應，并繼發細胞炎癥反應及細胞凋亡[13]。
高血糖作用下不斷積累的AGEs可被Toll樣受體、AGEs受體識別，刺激炎癥核因子（NF）-κB表達增加，從基因轉錄水平上調多種炎癥介質的表達，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、誘導型NO合酶（iNOS）、環氧化酶（COX）-2、細胞間黏附因子（ICAM）-1，血管細胞黏附因子（VACM）-1等[14]。視網膜毛細血管管周白細胞黏附是DR發展中的初始事件[15-16]。
線粒體是細胞中的關鍵細胞器，涉及ATP產生、脂質和鐵代謝、細胞凋亡等多種細胞基本功能。高糖所導致的氧化應激、炎癥損傷導致線粒體膜通透性增加，細胞色素C等促凋亡因子釋放至細胞質并誘導細胞凋亡。另一方面，氧化應激失衡影響內質網蛋白質合成，錯誤折疊的蛋白質不斷累積導致內質網應激，最終誘導細胞走向凋亡結局[17]。
血管壁中內皮細胞和周細胞之間的相互作用是血管形成、穩定、重塑和功能調節的核心過程，對維持視網膜血管正常功能及穩態環境至關重要[18]。氧化應激、炎癥、細胞凋亡使得內皮細胞和周細胞發生損傷后打破正常血管平衡，出現血管結構和功能異常，由此繼發的視網膜缺氧狀態刺激VEGF表達上調，周細胞和內皮細胞移行、增生，血管通透性進一步增加，導致血管滲漏乃至晚期新生血管形成[19]。
綜上，氧化應激、炎癥、細胞凋亡是早期DR內皮細胞及周細胞損傷的三種主要機制。而已有研究證明，在DR及相關RNV疾病中，褪黑激素可分別針對抗氧化應激、抗炎癥、抑制細胞凋亡方向對內皮細胞及周細胞發揮保護作用，有效保護BRB結構的完整性。
2 褪黑激素的抗氧化應激作用
氧化應激在包含DR在內的糖尿病微血管并發癥的發病機制中起核心作用。除了直接造成胞內蛋白質、脂質、核酸等生物大分子的氧化反應，ROS也可直接激活NF-κB，從而誘導炎癥級聯反應；亦或通過激活多元醇通路、PKC通路、己糖胺通路和AGEs形成等，間接刺激NF-κB，誘發線粒體功能障礙和細胞凋亡，上調VEGF等的表達等。ROS的不斷積累最終導致視網膜病變、心血管病變、腎病和神經病變等多種糖尿病并發癥[20]。因此，抑制DR發病過程中氧化應激水平的升高是首要的早期治療目標。褪黑激素作為一種強有力的抗氧化劑，可通過其自由基清除活性直接發揮抗氧化作用，保護內皮細胞和周細胞。研究發現，在DR大鼠模型內褪黑激素治療可顯著降低視網膜內ROS水平及脂質過氧化反應標志物之一的丙二醛，改善血管變性[21-22]。
除了直接清除氧自由基，褪黑激素尚可激活一系列抗氧化酶，間接發揮抗氧化作用。谷胱甘肽（GSH）是一種內源性的抗氧化物，與其他自由基清除劑具有協同作用，在糖尿病大鼠的視網膜中GSH水平明顯下降。核因子2相關因子2（Nrf2）是一種關鍵的抗氧化應激轉錄因子，在多種關鍵抗氧化酶的基因內包含一個共同的增強子，即抗氧化反應元件（ARE）。在氧化應激狀態下，被激活的Nrf2可通過作用于ARE增強多種抗氧化酶基因的轉錄活性[23]。實驗證明，在DR大鼠模型內，褪黑激素通過增強蛋白激酶Akt的磷酸化活性來上調Nrf2的胞內表達量，恢復谷氨酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶等多種抗氧化酶的活性，恢復GSH水平，增強細胞的抗氧化能力[24-25]。
3 褪黑激素的抗炎作用
慢性炎癥是DR發展的關鍵因素，近年來受到越來越多的重視[26]。NF-κB是DR慢性炎癥的核心因子[27-28]。褪黑激素的抗炎作用主要圍繞在抑制NF-κB的激活，進而下調IL-6、IL-1β、TNF-α等下游炎癥介質的表達，從而顯著改善DR毛細血管炎癥反應[24]。
iNOS被NF-κB激活后可合成過量的NO，誘發內皮細胞脂質及蛋白質硝化及亞硝基化反應，而糖尿病小鼠模型敲除iNOS基因后不再出現DR毛細血管結構或功能異常[29-30]。生理劑量下，褪黑激素即可通過G蛋白偶聯受體調節視網膜細胞內iNOS活性[31]。對STZ誘導的糖尿病大鼠模型進行褪黑激素處理，12周時與對照組比較后發現，褪黑激素可有效抑制iNOS的活性，減輕視網膜炎癥反應[25]。
ICAM-1、VACM-1是介導白細胞與內皮細胞黏附及相互作用的重要介質。MMP蛋白家族是促進毛細血管內皮細胞及周細胞遷移和結構重塑的重要調節因子，在增生型DR（PDR）中MMP-2、MMP-9等家族顯著上調，并通過閉合蛋白的水解作用破壞細胞間緊密連接，增加毛細血管壁通透性[32]。在高糖條件下培養人視網膜內皮細胞，其胞內VEGF、ICAM-1、MMP-2及MMP-9水平升高，而給予褪黑激素處理后，上述各細胞因子水平顯著下調[33]。為DR大鼠模型補充褪黑激素還可顯著降低視網膜內MMP-9的濃度，影響糖尿病前期視網膜中的促血管生成信號傳導，改善新生血管形成[34]。
COX-2及其產物前列腺素是重要的炎癥介質之一，褪黑激素可在藥理學劑量降低視網膜細胞COX-2的表達[31, 35]。在視神經炎大鼠模型中，褪黑激素可通過降低COX-2及前列腺素水平而有效減輕視神經損傷[36]。而有研究在晚期DR患者剝離的視網膜前新生血管內皮細胞中檢測到異常升高的COX-2[37]。褪黑激素是否可在DR中通過降低COX-2及其產物前列腺素的水平來發揮抗炎作用亟待進一步實驗證實。
4 褪黑激素的抗凋亡作用
在氧化應激、炎癥損傷的作用下，線粒體膜通透性增加并釋放細胞色素C等促凋亡因子是凋亡的關鍵始動因素。因此，保護細胞線粒體功能對阻止細胞凋亡進程至關重要。通過上述自由基清除活性及抗炎作用，褪黑激素可有效保護內皮細胞和周細胞的線粒體功能，間接發揮抗細胞凋亡作用[38]。多項研究證明，褪黑激素的此種抗凋亡效應在DR模型、老年性黃斑變性模型、視網膜缺血再灌注損傷模型等多種氧化應激、炎癥相關視網膜疾病中發揮作用[39-41]。
而另一方面，褪黑激素還可調節細胞內凋亡相關因子的表達直接影響細胞凋亡。Bcl-2蛋白是bcl-2原癌基因的編碼產物，為細胞存活促進因子。而bax基因是人體最主要的凋亡基因，同屬于bcl-2基因家族，其編碼的bax蛋白可與bcl-2蛋白形成異二聚體，抑制bal-2的活性，發揮促進細胞凋亡的作用。Bax/bcl-2兩蛋白之間的比例關系是調節細胞凋亡水平的重要因素。研究發現，褪黑激素通過抑制bax基因的表達并提高bcl-2蛋白水平，顯著降低DR大鼠視網膜細胞內bax/bcl-2的比例，減輕周細胞凋亡，緩解DR的發展[42]。以上研究結果說明，褪黑激素可直接或間接抑制DR過程中內皮細胞和周細胞的細胞凋亡。
5 褪黑激素治療DR的前景展望
在內皮細胞和周細胞保護作用方面，褪黑激素可通過清除自由基和激活抗氧化酶等多種機制改善DR病程中的氧化應激損傷。另外，褪黑激素可通過抑制NF-κB信號通路，發揮強大的抗炎作用。而通過其自由基清除活性和抗炎功能，以及下調胞內bax/bcl-2蛋白比例等方式，褪黑激素還可直接或間接抑制DR內皮細胞及周細胞凋亡。由此可見，褪黑激素作為抗VEGF藥物的補充治療在DR并發DME患者的治療應用中具有巨大的潛力。此外，作為一種內源性的抗氧化劑，補充褪黑激素可以恢復DR所致的視網膜內下降的褪黑激素水平[43-45]，且其口服給藥的方式與現有DR治療手段相比，無注射并發癥、手術并發癥等問題，價格低廉而易于患者接受。
然而，臨床若將褪黑激素作為DR的常規補充治療尚需解決以下幾個問題。首先，關于褪黑激素對DR保護作用所涉及的具體機制僅得概貌。進一步的研究應將目光鎖定在揭示其所涉及的分子生物學機制，使其復雜的作用網絡逐漸清晰。其次，盡管目前研究已初步證實褪黑激素對DR的保護作用，但尚停留在體外實驗及DR動物模型的實驗階段，褪黑激素在人細胞和DR患者體內的有效性及安全性等問題尚存疑。因此，逐步開展針對人體細胞的基礎實驗和相關臨床試驗以獲取更多證據支持十分迫切和必要。最后，即使褪黑激素對DR的防治作用得以證實，用藥適應證、用藥時間窗、劑量等關于治療策略制定等問題仍需要長久的探索。揭開褪黑激素對DR保護作用的面紗，將有助于進一步加深對DR發病機制的認識，亦將為DR的臨床治療開辟出新的思路。
玻璃體腔注射抗VEGF藥物已逐漸成為治療糖尿病視網膜病變（DR）的一線方案。但有研究表明，單獨抗VEGF藥物治療并不足以改善DR過程中毛細血管內皮細胞及周細胞的損傷以及由此導致的糖尿病黃斑水腫（DME）[1-2]。而目前常采用的玻璃體腔注射糖皮質激素治療雖可通過抗炎改善視力，但易誘發白內障、眼壓升高等并發癥[3]。因此，尋找有效的補充藥物或替代藥物來緩解甚至逆轉DR過程中血視網膜屏障（BRB）的破壞十分必要。通過保護毛細血管結構而減少VEGF的生成，預防視網膜新生血管（RNV）的出現，并有效治療DME，以彌補抗VEGF藥物治療的局限性。褪黑激素（melatonin）是一種主要由松果體分泌的激素，具有控制體內若干種生理節律的重要作用，同時也是最強大的天然自由基清除劑[4]。現有研究表明，褪黑激素水平異常可能與DR進展相關，褪黑激素治療可通過改善視網膜神經細胞退行性變、保護毛細血管結構、抑制RNV等途徑在包含DR在內的多種視網膜疾病中發揮保護作用[5-9]。現就褪黑激素對DR毛細血管內皮細胞和周細胞保護作用的研究現狀與進展作一綜述，以期為褪黑激素用于早期DR防治提供新的思路。
1 DR病理生理機制
糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝綜合征。糖代謝功能的異常及異常代謝產物的積累激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）通路和己糖胺通路等，并導致晚期糖基化終產物（AGEs）的累積，誘發進一步的氧化應激損傷、炎癥反應、細胞凋亡等多種損傷[10-11]。
持續高血糖狀態導致線粒體電子傳遞鏈功能異常，誘導NADPH氧化酶2和同工酶Nox 4的表達增加，催化產生過量的ROS[12]。細胞內氧化還原平衡狀態的破壞直接引發胞內蛋白質、脂質、核酸等生物大分子的氧化反應，并繼發細胞炎癥反應及細胞凋亡[13]。
高血糖作用下不斷積累的AGEs可被Toll樣受體、AGEs受體識別，刺激炎癥核因子（NF）-κB表達增加，從基因轉錄水平上調多種炎癥介質的表達，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、誘導型NO合酶（iNOS）、環氧化酶（COX）-2、細胞間黏附因子（ICAM）-1，血管細胞黏附因子（VACM）-1等[14]。視網膜毛細血管管周白細胞黏附是DR發展中的初始事件[15-16]。
線粒體是細胞中的關鍵細胞器，涉及ATP產生、脂質和鐵代謝、細胞凋亡等多種細胞基本功能。高糖所導致的氧化應激、炎癥損傷導致線粒體膜通透性增加，細胞色素C等促凋亡因子釋放至細胞質并誘導細胞凋亡。另一方面，氧化應激失衡影響內質網蛋白質合成，錯誤折疊的蛋白質不斷累積導致內質網應激，最終誘導細胞走向凋亡結局[17]。
血管壁中內皮細胞和周細胞之間的相互作用是血管形成、穩定、重塑和功能調節的核心過程，對維持視網膜血管正常功能及穩態環境至關重要[18]。氧化應激、炎癥、細胞凋亡使得內皮細胞和周細胞發生損傷后打破正常血管平衡，出現血管結構和功能異常，由此繼發的視網膜缺氧狀態刺激VEGF表達上調，周細胞和內皮細胞移行、增生，血管通透性進一步增加，導致血管滲漏乃至晚期新生血管形成[19]。
綜上，氧化應激、炎癥、細胞凋亡是早期DR內皮細胞及周細胞損傷的三種主要機制。而已有研究證明，在DR及相關RNV疾病中，褪黑激素可分別針對抗氧化應激、抗炎癥、抑制細胞凋亡方向對內皮細胞及周細胞發揮保護作用，有效保護BRB結構的完整性。
2 褪黑激素的抗氧化應激作用
氧化應激在包含DR在內的糖尿病微血管并發癥的發病機制中起核心作用。除了直接造成胞內蛋白質、脂質、核酸等生物大分子的氧化反應，ROS也可直接激活NF-κB，從而誘導炎癥級聯反應；亦或通過激活多元醇通路、PKC通路、己糖胺通路和AGEs形成等，間接刺激NF-κB，誘發線粒體功能障礙和細胞凋亡，上調VEGF等的表達等。ROS的不斷積累最終導致視網膜病變、心血管病變、腎病和神經病變等多種糖尿病并發癥[20]。因此，抑制DR發病過程中氧化應激水平的升高是首要的早期治療目標。褪黑激素作為一種強有力的抗氧化劑，可通過其自由基清除活性直接發揮抗氧化作用，保護內皮細胞和周細胞。研究發現，在DR大鼠模型內褪黑激素治療可顯著降低視網膜內ROS水平及脂質過氧化反應標志物之一的丙二醛，改善血管變性[21-22]。
除了直接清除氧自由基，褪黑激素尚可激活一系列抗氧化酶，間接發揮抗氧化作用。谷胱甘肽（GSH）是一種內源性的抗氧化物，與其他自由基清除劑具有協同作用，在糖尿病大鼠的視網膜中GSH水平明顯下降。核因子2相關因子2（Nrf2）是一種關鍵的抗氧化應激轉錄因子，在多種關鍵抗氧化酶的基因內包含一個共同的增強子，即抗氧化反應元件（ARE）。在氧化應激狀態下，被激活的Nrf2可通過作用于ARE增強多種抗氧化酶基因的轉錄活性[23]。實驗證明，在DR大鼠模型內，褪黑激素通過增強蛋白激酶Akt的磷酸化活性來上調Nrf2的胞內表達量，恢復谷氨酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶等多種抗氧化酶的活性，恢復GSH水平，增強細胞的抗氧化能力[24-25]。
3 褪黑激素的抗炎作用
慢性炎癥是DR發展的關鍵因素，近年來受到越來越多的重視[26]。NF-κB是DR慢性炎癥的核心因子[27-28]。褪黑激素的抗炎作用主要圍繞在抑制NF-κB的激活，進而下調IL-6、IL-1β、TNF-α等下游炎癥介質的表達，從而顯著改善DR毛細血管炎癥反應[24]。
iNOS被NF-κB激活后可合成過量的NO，誘發內皮細胞脂質及蛋白質硝化及亞硝基化反應，而糖尿病小鼠模型敲除iNOS基因后不再出現DR毛細血管結構或功能異常[29-30]。生理劑量下，褪黑激素即可通過G蛋白偶聯受體調節視網膜細胞內iNOS活性[31]。對STZ誘導的糖尿病大鼠模型進行褪黑激素處理，12周時與對照組比較后發現，褪黑激素可有效抑制iNOS的活性，減輕視網膜炎癥反應[25]。
ICAM-1、VACM-1是介導白細胞與內皮細胞黏附及相互作用的重要介質。MMP蛋白家族是促進毛細血管內皮細胞及周細胞遷移和結構重塑的重要調節因子，在增生型DR（PDR）中MMP-2、MMP-9等家族顯著上調，并通過閉合蛋白的水解作用破壞細胞間緊密連接，增加毛細血管壁通透性[32]。在高糖條件下培養人視網膜內皮細胞，其胞內VEGF、ICAM-1、MMP-2及MMP-9水平升高，而給予褪黑激素處理后，上述各細胞因子水平顯著下調[33]。為DR大鼠模型補充褪黑激素還可顯著降低視網膜內MMP-9的濃度，影響糖尿病前期視網膜中的促血管生成信號傳導，改善新生血管形成[34]。
COX-2及其產物前列腺素是重要的炎癥介質之一，褪黑激素可在藥理學劑量降低視網膜細胞COX-2的表達[31, 35]。在視神經炎大鼠模型中，褪黑激素可通過降低COX-2及前列腺素水平而有效減輕視神經損傷[36]。而有研究在晚期DR患者剝離的視網膜前新生血管內皮細胞中檢測到異常升高的COX-2[37]。褪黑激素是否可在DR中通過降低COX-2及其產物前列腺素的水平來發揮抗炎作用亟待進一步實驗證實。
4 褪黑激素的抗凋亡作用
在氧化應激、炎癥損傷的作用下，線粒體膜通透性增加并釋放細胞色素C等促凋亡因子是凋亡的關鍵始動因素。因此，保護細胞線粒體功能對阻止細胞凋亡進程至關重要。通過上述自由基清除活性及抗炎作用，褪黑激素可有效保護內皮細胞和周細胞的線粒體功能，間接發揮抗細胞凋亡作用[38]。多項研究證明，褪黑激素的此種抗凋亡效應在DR模型、老年性黃斑變性模型、視網膜缺血再灌注損傷模型等多種氧化應激、炎癥相關視網膜疾病中發揮作用[39-41]。
而另一方面，褪黑激素還可調節細胞內凋亡相關因子的表達直接影響細胞凋亡。Bcl-2蛋白是bcl-2原癌基因的編碼產物，為細胞存活促進因子。而bax基因是人體最主要的凋亡基因，同屬于bcl-2基因家族，其編碼的bax蛋白可與bcl-2蛋白形成異二聚體，抑制bal-2的活性，發揮促進細胞凋亡的作用。Bax/bcl-2兩蛋白之間的比例關系是調節細胞凋亡水平的重要因素。研究發現，褪黑激素通過抑制bax基因的表達并提高bcl-2蛋白水平，顯著降低DR大鼠視網膜細胞內bax/bcl-2的比例，減輕周細胞凋亡，緩解DR的發展[42]。以上研究結果說明，褪黑激素可直接或間接抑制DR過程中內皮細胞和周細胞的細胞凋亡。
5 褪黑激素治療DR的前景展望
在內皮細胞和周細胞保護作用方面，褪黑激素可通過清除自由基和激活抗氧化酶等多種機制改善DR病程中的氧化應激損傷。另外，褪黑激素可通過抑制NF-κB信號通路，發揮強大的抗炎作用。而通過其自由基清除活性和抗炎功能，以及下調胞內bax/bcl-2蛋白比例等方式，褪黑激素還可直接或間接抑制DR內皮細胞及周細胞凋亡。由此可見，褪黑激素作為抗VEGF藥物的補充治療在DR并發DME患者的治療應用中具有巨大的潛力。此外，作為一種內源性的抗氧化劑，補充褪黑激素可以恢復DR所致的視網膜內下降的褪黑激素水平[43-45]，且其口服給藥的方式與現有DR治療手段相比，無注射并發癥、手術并發癥等問題，價格低廉而易于患者接受。
然而，臨床若將褪黑激素作為DR的常規補充治療尚需解決以下幾個問題。首先，關于褪黑激素對DR保護作用所涉及的具體機制僅得概貌。進一步的研究應將目光鎖定在揭示其所涉及的分子生物學機制，使其復雜的作用網絡逐漸清晰。其次，盡管目前研究已初步證實褪黑激素對DR的保護作用，但尚停留在體外實驗及DR動物模型的實驗階段，褪黑激素在人細胞和DR患者體內的有效性及安全性等問題尚存疑。因此，逐步開展針對人體細胞的基礎實驗和相關臨床試驗以獲取更多證據支持十分迫切和必要。最后，即使褪黑激素對DR的防治作用得以證實，用藥適應證、用藥時間窗、劑量等關于治療策略制定等問題仍需要長久的探索。揭開褪黑激素對DR保護作用的面紗，將有助于進一步加深對DR發病機制的認識，亦將為DR的臨床治療開辟出新的思路。