老年性黃斑變性（AMD）是一種以視網膜光感受器細胞、RPE細胞和脈絡膜毛細血管退化為特征的眼底疾病，發病機制不明，無有效治療方法。基礎研究發現，動物模型視網膜下腔植入骨髓間充質干細胞、多能干細胞、RPE細胞等細胞療法可減緩或逆轉AMD視力喪失，為AMD的治療帶來新的希望。
引用本文： 彭晶瑩, 周希媛. 老年性黃斑變性細胞療法的基礎研究進展. 中華眼底病雜志, 2020, 36(8): 661-664. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190124-00032 復制
老年性黃斑變性（AMD）發病過程復雜，同時存在環境和遺傳風險關聯以及各種細胞異常的相互影響，包括受損的自噬（一種參與維持細胞內穩態和控制細胞廢物管理的機制）和慢性先天免疫激活。目前尚無有效治療方法以預防和干預其進程。基礎研究發現，動物模型視網膜下腔植入骨髓間充質干細胞（MSC）、多能干細胞（PSC）、RPE細胞等細胞治療方法（細胞療法）可減緩或逆轉AMD視力喪失，并提出多種作用模式，包括細胞替換、挽救以及免疫調節等，以延緩視網膜神經細胞和其他相關細胞的退行性變過程[1]。然而，真正實現挽救AMD患者視力的目標，仍然存在許多挑戰。現就近年AMD細胞療法基礎研究進展作一綜述。
1 AMD的病理生理機制
AMD早期關鍵表現是形成黃斑視網膜細胞外沉積物（玻璃疣），檢眼鏡下表現為黃斑視網膜下微黃色沉積物，其來源于細胞、脂質和炎性廢物。在整個成年期，富含脂質的細胞外沉積物在RPE下的Bruch膜中積累，并隨年齡增長而增加。此外，RPE細胞的自噬能力降低也在AMD發病機制中起重要作用，并與晚期AMD的中心事件Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體的激活密切相關[2-3]。Ban等[4]研究表明，單核細胞的膽固醇清除功能受損，是啟動人類早期AMD發生的關鍵因素。此結果證實了系統免疫和衰老促進AMD發展的重要性，同時也表明與膽固醇轉運和體內平衡相關的基因多態性與發生AMD的高風險相關。
視網膜玻璃疣的形成不僅是AMD發展的一個臨床特征，而且也是其他疾病如阿爾茨海默病和腎臟疾病的標志。迄今為止，對玻璃疣的形成過程了解甚少。部分學者認為玻璃疣蛋白主要來源于光感受器外節和RPE的細胞碎片；而另外一部分學者則認為是脈絡膜細胞或血液來源。最新研究表明，在目前鑒定的玻璃疣蛋白中，只有少數玻璃疣蛋白唯一來源于光感受器或脈絡膜，而多數玻璃疣蛋白唯一來源于血液[5]。此結果間接證實既往部分研究者提出的關于AMD的玻璃疣形成和動脈粥樣硬化斑塊形成之間為同源性假說。
新近研究發現，由光感受器退化引起的晚期視網膜變性動物模型中，雙極細胞和無長突細胞之間的突觸連接丟失[6]。脈絡膜毛細血管內皮細胞丟失是AMD最早可檢測到的事件之一，并且因為RPE依賴于脈絡膜毛細血管作為代謝支持，所以這種丟失可能是AMD進展到更晚期階段的觸發器[7]。此外，RPE在體內的再生能力非常有限，RPE細胞的變性會導致光感受器死亡和不可逆性失明，與AMD的發生和進展有著因果關系，表明RPE對于光感受器的存活和功能至關重要[8]。
AMD以RPE變性為特征，伴有異常細胞內沉淀物（脂褐素）積聚和光感受器死亡。此外，脈絡膜微循環老化、氧化應激、線粒體功能障礙、毛細血管對分子應激源的抵抗力受損、蛋白質和細胞器清除障礙以及膠質細胞功能障礙等，在AMD的發病機制中都起著至關重要的作用。Golestaneh等[9]研究發現，RPE的吞噬功能對維持視網膜和光感受器的完整性尤其重要，其吞噬功能與吞噬廢棄的光感受器外節形成脂褐素密切相關，RPE的自噬功能失調是AMD的一個促發因素。在AMD患者RPE培養中可觀察到脂滴和糖原顆粒的積聚、線粒體的解體和自噬體的增加。與正常人RPE比較，AMD患者的RPE對氧化應激的敏感性增加，在應激條件下產生更高水平的ROS，并表現出線粒體活性的降低。
2 AMD細胞療法的基礎研究進展
2.1 人類視網膜缺乏再生能力是細胞療法出現的根本原因
兩棲動物和魚類等物種具有受損視網膜的再生能力，其細胞來源主要是睫狀緣區的前部視網膜、Müller細胞和RPE細胞這3種依賴于物種和年齡的駐留干細胞，但人類視網膜并不具備這種再生能力。然而，晚期AMD盡管視網膜外層廣泛變性，但內層視網膜具有復雜的神經連接性，并且經由神經節細胞輸出到大腦，其解剖學表現是完整的，使得外層視網膜中的細胞替換促進視力恢復的可能性得以實現。因此，應用新的年輕細胞替換或挽救舊的、死亡的或瀕臨死亡的視網膜細胞成為近年研究熱點[10]。
2.2 細胞療法是治療AMD最有希望的策略之一
細胞療法不僅在于潛在的多重作用機制，還包括在AMD等疾病中具有的各種非疾病特異性效應，如通過產生細胞因子和神經營養因子挽救宿主細胞，并通過免疫調節作用改變視網膜神經退行性過程。研究發現，將MSC植入動物模型的視網膜下腔，可刺激視網膜原位干細胞的內源性激活[11]。最近研究證據也表明，移植的光感受器前體細胞，可以通過細胞質轉移到宿主細胞，而不是依靠單純的細胞整合以恢復細胞活力和視覺功能，細胞療法的潛在神經保護作用可能是其最重要的功能之一，包括刺激視網膜固有的修復過程[12]。
2.3 多種細胞可作為細胞療法的供體來源
多種細胞類型已被證明可在視網膜變性疾病的臨床前模型中挽救光感受器，包括骨髓來源的MSC、脂肪細胞來源的細胞、臍帶組織細胞和神經祖細胞等。盡管骨髓MSC在被注射到視網膜下腔時可以分化為表達感光蛋白的細胞，但它們分化為功能有用的視網膜細胞的能力仍存在爭議，這種現象被認為主要與神經營養因子產生的旁分泌效應有關。雖然多數因素對光感受器存活的影響是通過小膠質細胞和Müller細胞間接發揮作用，但紅綠色視錐細胞所表達的腦源性神經營養因子（BDNF）受體trkB可直接對BDNF做出應答。在小鼠視網膜變性模型中移植視桿細胞，可減緩視錐細胞的變性，這種所謂的視桿細胞衍生視錐細胞存活因子，是由視桿細胞合成的可擴散因子，與其他已知的營養因子不同[13]。RPE細胞也可能單獨通過營養作用對光感受器的再生和存活產生顯著影響，這主要是由于色素上皮衍生因子（PEDF）的產生[14]。
2.4 光感受器、RPE細胞和虹膜色素上皮（IPE）細胞移植時存在的差異
對于光感受器，細胞發育階段和生長環境對于它們在移植后充分發育和在視網膜中存活的能力至關重要[15]。然而，與光感受器移植比較，移植的RPE細胞幾乎不分年齡或起源，很容易在宿主光感受器周圍延伸頂端絨毛狀突起和吞噬細胞流出外節盤。已有研究表明，體外擴增的RPE細胞具有一定的分化和表達光感受器標記物的能力[16]。但這種能力有限，移植后的細胞分化似乎取決于宿主條件，特別是接受移植部位細胞的成熟度，移植到未成熟視網膜較成熟視網膜更容易成功。
IPE細胞來源于與RPE相同的胚胎細胞系，許多方面與RPE細胞相似，具有頂端/基底極化、微絨毛和同樣類型的緊密連接。該細胞通過虹膜切除很容易收集，因此可以是自體的。然而，盡管IPE細胞移植到AMD患者的視網膜下腔時可能獲得RPE的特性，但也存在若干功能差異。視周期所必需的細胞內外視網膜結合蛋白的基因表達在IPE細胞中低于RPE細胞。體外培養的IPE細胞雖然能夠吞噬光感受器外節，但與RPE細胞相比，降解能力較低。VEGF在IPE細胞中的表達水平也低于RPE細胞，這可能對移植后的脈絡膜恢復/健康有影響，但其對滲出型AMD也可能有益[17]。
2.5 PSC是視網膜病變首選的移植細胞來源
PSC目前被認為是細胞療法的最佳細胞來源，胎兒來源的視網膜前體細胞的潛力也受到關注，PSC還可以為RPE細胞提供現成的來源。人體胚胎干細胞（hESC）因倫理問題在許多國家被禁止使用。它們的分化后代可表達人白細胞抗原（HLA），可能導致移植后的排斥反應，但可以通過建立HLA型hESC庫，為每個移植受體選擇最佳匹配來克服[18]。
誘導PSC（iPSC）譜系在分化成光感受器和RPE能力上有很大差異，這些差異可以歸因于多種因素，控制分化的內源性基因表達的變化已被證明是其中的一個因素。其他已被證明有助于提高分化效率的因素包括DNA甲基化、表觀遺傳記憶、iPSC的遺傳背景和X染色體失活等，但可能導致癌基因的表達增加。外源性生長因子如SB431542、Noggin、DKK1、LEFTY-A、重組人激活素-A和胰島素樣生長因子-1等，也顯示了向神經視網膜和RPE分化的增強作用[19]。
2.6 基因重編程為移植所需的細胞供體提供了新的途徑
基因重編程iPSC與ESC具有共同特性，包括自我更新和分化成3個胚層的能力。不僅可以提供自體干細胞來源，還不需要hESC的倫理關切。在將PSC衍生細胞系輸送到視網膜下腔的移植過程中，進行基因治療的最佳方式是在PSC階段編輯基因組，可以精確地校正突變，從而校正其后的所有衍生分化細胞[20]。由于轉錄因子插入和表達過程可引起基因組突變和功能障礙，用于移植的未分化hESC和iPSC存在于已分化的細胞群中，植入供體后有形成腫瘤（特別是畸胎瘤）的可能，一定程度上限制了基因重編程的應用[21]。
新的基因編輯技術使用專門設計的位點特異性限制性內切酶，如鋅指核酸酶、轉錄激活物樣效應核酸酶，并聚集規律成簇的間隔短回文重復序列/Cas9 RNA引導的核酸酶（CRISPR/Cas）以切除基因的突變部分并同時傳遞校正的副本，然后通過同源重組整合到基因切割點。雖然在尋找最佳策略以確保完全重編程（影響分化能力）、最大化效率以及在編程過程期間和之后最小化遺傳變化方面仍然存在挑戰，但相關研究進展迅速，技術進步顯著[22]。
2.7 3D培養或3D打印可能是一種有前途的再生策略
通過3D培養條件下產生的視網膜“有機體”，可復制體內可見的有組織結構的視網膜層疊，可識別出所有關鍵視網膜細胞類型并觀察到成熟特征，包括2D培養中未見的光感受器外節。該技術具有優化移植前光感受器成熟的巨大潛力，提供了視網膜片移植的可能性以及改善疾病模型、毒理學和藥物測試的巨大機會。此外，包括光感受器在內的視網膜結構，還可以被打印為3D結構，但目前尚無關于這些方法的研究報告[23]。
在AMD的再生策略中，對脈絡膜替換的研究相對較少。有研究證據表明，脈絡膜內皮細胞在AMD發病機制中早期丟失，并且自體RPE移植后，脈絡膜的再灌注對于移植物存活必不可少，然而近期關于這方面的研究進展尚少[24]。
2.8 體外培養的供體細胞的識別和鑒定
RPE細胞在培養的早期，通過特征性的著色和多邊形外觀，很容易識別，隨后被分離出來純化和成熟；成熟度可以通過各種形態、分子和功能特征進行評估。RPE特異性標志物包括MeltK和基礎標記Best1，頂端膜相關標志物包括Na+/K+三磷酸腺苷酶，視覺周期標記包括RPE65、LMAT和視黃醛結合蛋白。吞噬功能、跨上皮阻力和生長因子分泌的頂端（PEDF）/基底（VEGF）極性均可作為功能指標進行檢測[16]。
由于光感受器細胞不著色，適于移植者不易識別。在體外用于識別CRX和神經視網膜亮氨酸拉鏈等光感受器細胞內標記物，不能使用熒光或磁激活細胞分選法來對移植的細胞進行分類。動物模型研究利用由光感受器基因啟動子驅動的轉基因熒光蛋白表達將光感受器細胞進行分類，然而這種方法可能不適合人體研究。Gagliardi等[25]通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術，證實細胞表面抗原CD73僅在人iPSC衍生的光感受器細胞中表達，將CD73+光感受器前體大量分離后，植入光感受器退化模型的視網膜內，能夠長期存活并分化成熟。
2.9 供體細胞植入視網膜下腔后的顯微鏡下改變
形成具有頂端-基底極性的單層并附著于表面，對RPE移植細胞的功能和存活至關重要。移植后檢眼鏡觀察可見注射區視網膜下色素團逐漸擴大，可代表RPE細胞增生，但未顯示陽性自體熒光，或許不具有活力和功能[26]。在部分患者中，RPE細胞簇顯示出分布于萎縮病灶區的傾向，提示這些區域有優先生長，但在萎縮的區域中央沒有產生色素沉著。
視網膜變性動物模型研究表明，視網膜下微環境可影響移植細胞的存活、形態和功能，也可以影響視錐細胞或視桿細胞成功“整合”的傾向[27]。通常視錐細胞的整合數量較視桿細胞更少，對AMD可能的黃斑光感受器替代提出新的挑戰。相反，引起視網膜色素變性的大多數突變主要影響視桿細胞，而視錐細胞在隨后階段中繼發死亡。因此，視桿細胞移植可以挽救動物瀕死的視錐細胞，并已在相關動物模型中得到證實[28]。此外，細胞懸液移植除了RPE黏附問題之外，在遞送過程中存在細胞死亡、注射過程中細胞回流以及注射后細胞分布不完美的問題，所有這些都可能由組織工程方法輔助解決。同時，細胞遞送后的存活和整合，也需要通過加入到移植細胞中的促存活劑來提高，包括潛在地使用聯合基因治療[29]。
3 細胞療法治療AMD的前景展望
由于AMD發病機制涉及到細胞衰老、免疫失調、氧化應激、慢性炎癥以及遺傳和環境等諸多因素，傳統方法治療AMD效果不佳，尤其是萎縮型AMD尚無有效治療方法。通過干細胞移植能有效改善光感受器的退變，并在一定程度上恢復受損的視力，為AMD的治療帶來新的希望[30]。
目前細胞療法治療AMD的基礎研究還存在一些難以克服的局限性，如移植細胞擴增后的分離純化、細胞植入后的存活效率、誘導移植細胞的定向分化、移植細胞的遷徙和定植、移植后的免疫排斥反應、移植物的致瘤性以及可能需要面對的倫理學問題等，都給細胞療法的臨床應用帶來了極大的挑戰。目前研究結果顯示，PSC的基因編輯可能是未來AMD細胞療法的發展方向之一[31]。通過基因編輯不僅可以減少移植細胞的致瘤性，還可以提高移植細胞轉化為目標細胞的效率，并且通過基因技術手段，可以將視網膜的主要膠質細胞Müller細胞重新編程為iPSC，衍生的iPSC能夠向視網膜方向分化，同時產生RPE和含有視網膜前體細胞的自體視網膜類器官結構。PSC與目標細胞共培養，可能是AMD細胞療法的另一發展方向。現有研究結果表明，將PSC與目標細胞（光感受器外節）共培養后，可提高移植細胞的存活率，促進移植細胞的軸突生長，并誘導移植細胞表達RPE細胞的標志物，使移植細胞產生更多的色素顆粒[32]。此外，一些新的治療策略正在研究中，如通過神經營養機制，利用支持細胞來幫助光感受器的部分視覺功能得以保存。阻斷成纖維細胞生長因子/絲裂原活化蛋白激酶信號通路，可誘導人iPSC分化并產生RPE細胞，抑制蛋白激酶C或骨形態發生蛋白信號通路，可顯著提高RPE的分化效率[33-34]。
通過光感受器或RPE移植的細胞療法在臨床前動物模型中的研究已經超過30年，但成效并不顯著。AMD細胞療法的目標是阻止或延緩疾病進程，改善或保留殘存的視覺功能，盡管細胞療法的發展前景令人振奮，但面臨的各種挑戰也很嚴峻，距離常規使用有效安全的細胞治療目標尚遙遠。視網膜微環境中的微妙平衡需要不同細胞類型之間復雜的溝通和相互作用，以應對環境挑戰并保持體內平衡。因此，了解AMD發展不同階段的各種細胞表型特征，闡明引起光感受器死亡的機制以及與疾病發生和進展相關的生物學途徑，是推動AMD細胞療法研究不斷深入的必由之路[35]。
老年性黃斑變性（AMD）發病過程復雜，同時存在環境和遺傳風險關聯以及各種細胞異常的相互影響，包括受損的自噬（一種參與維持細胞內穩態和控制細胞廢物管理的機制）和慢性先天免疫激活。目前尚無有效治療方法以預防和干預其進程。基礎研究發現，動物模型視網膜下腔植入骨髓間充質干細胞（MSC）、多能干細胞（PSC）、RPE細胞等細胞治療方法（細胞療法）可減緩或逆轉AMD視力喪失，并提出多種作用模式，包括細胞替換、挽救以及免疫調節等，以延緩視網膜神經細胞和其他相關細胞的退行性變過程[1]。然而，真正實現挽救AMD患者視力的目標，仍然存在許多挑戰。現就近年AMD細胞療法基礎研究進展作一綜述。
1 AMD的病理生理機制
AMD早期關鍵表現是形成黃斑視網膜細胞外沉積物（玻璃疣），檢眼鏡下表現為黃斑視網膜下微黃色沉積物，其來源于細胞、脂質和炎性廢物。在整個成年期，富含脂質的細胞外沉積物在RPE下的Bruch膜中積累，并隨年齡增長而增加。此外，RPE細胞的自噬能力降低也在AMD發病機制中起重要作用，并與晚期AMD的中心事件Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體的激活密切相關[2-3]。Ban等[4]研究表明，單核細胞的膽固醇清除功能受損，是啟動人類早期AMD發生的關鍵因素。此結果證實了系統免疫和衰老促進AMD發展的重要性，同時也表明與膽固醇轉運和體內平衡相關的基因多態性與發生AMD的高風險相關。
視網膜玻璃疣的形成不僅是AMD發展的一個臨床特征，而且也是其他疾病如阿爾茨海默病和腎臟疾病的標志。迄今為止，對玻璃疣的形成過程了解甚少。部分學者認為玻璃疣蛋白主要來源于光感受器外節和RPE的細胞碎片；而另外一部分學者則認為是脈絡膜細胞或血液來源。最新研究表明，在目前鑒定的玻璃疣蛋白中，只有少數玻璃疣蛋白唯一來源于光感受器或脈絡膜，而多數玻璃疣蛋白唯一來源于血液[5]。此結果間接證實既往部分研究者提出的關于AMD的玻璃疣形成和動脈粥樣硬化斑塊形成之間為同源性假說。
新近研究發現，由光感受器退化引起的晚期視網膜變性動物模型中，雙極細胞和無長突細胞之間的突觸連接丟失[6]。脈絡膜毛細血管內皮細胞丟失是AMD最早可檢測到的事件之一，并且因為RPE依賴于脈絡膜毛細血管作為代謝支持，所以這種丟失可能是AMD進展到更晚期階段的觸發器[7]。此外，RPE在體內的再生能力非常有限，RPE細胞的變性會導致光感受器死亡和不可逆性失明，與AMD的發生和進展有著因果關系，表明RPE對于光感受器的存活和功能至關重要[8]。
AMD以RPE變性為特征，伴有異常細胞內沉淀物（脂褐素）積聚和光感受器死亡。此外，脈絡膜微循環老化、氧化應激、線粒體功能障礙、毛細血管對分子應激源的抵抗力受損、蛋白質和細胞器清除障礙以及膠質細胞功能障礙等，在AMD的發病機制中都起著至關重要的作用。Golestaneh等[9]研究發現，RPE的吞噬功能對維持視網膜和光感受器的完整性尤其重要，其吞噬功能與吞噬廢棄的光感受器外節形成脂褐素密切相關，RPE的自噬功能失調是AMD的一個促發因素。在AMD患者RPE培養中可觀察到脂滴和糖原顆粒的積聚、線粒體的解體和自噬體的增加。與正常人RPE比較，AMD患者的RPE對氧化應激的敏感性增加，在應激條件下產生更高水平的ROS，并表現出線粒體活性的降低。
2 AMD細胞療法的基礎研究進展
2.1 人類視網膜缺乏再生能力是細胞療法出現的根本原因
兩棲動物和魚類等物種具有受損視網膜的再生能力，其細胞來源主要是睫狀緣區的前部視網膜、Müller細胞和RPE細胞這3種依賴于物種和年齡的駐留干細胞，但人類視網膜并不具備這種再生能力。然而，晚期AMD盡管視網膜外層廣泛變性，但內層視網膜具有復雜的神經連接性，并且經由神經節細胞輸出到大腦，其解剖學表現是完整的，使得外層視網膜中的細胞替換促進視力恢復的可能性得以實現。因此，應用新的年輕細胞替換或挽救舊的、死亡的或瀕臨死亡的視網膜細胞成為近年研究熱點[10]。
2.2 細胞療法是治療AMD最有希望的策略之一
細胞療法不僅在于潛在的多重作用機制，還包括在AMD等疾病中具有的各種非疾病特異性效應，如通過產生細胞因子和神經營養因子挽救宿主細胞，并通過免疫調節作用改變視網膜神經退行性過程。研究發現，將MSC植入動物模型的視網膜下腔，可刺激視網膜原位干細胞的內源性激活[11]。最近研究證據也表明，移植的光感受器前體細胞，可以通過細胞質轉移到宿主細胞，而不是依靠單純的細胞整合以恢復細胞活力和視覺功能，細胞療法的潛在神經保護作用可能是其最重要的功能之一，包括刺激視網膜固有的修復過程[12]。
2.3 多種細胞可作為細胞療法的供體來源
多種細胞類型已被證明可在視網膜變性疾病的臨床前模型中挽救光感受器，包括骨髓來源的MSC、脂肪細胞來源的細胞、臍帶組織細胞和神經祖細胞等。盡管骨髓MSC在被注射到視網膜下腔時可以分化為表達感光蛋白的細胞，但它們分化為功能有用的視網膜細胞的能力仍存在爭議，這種現象被認為主要與神經營養因子產生的旁分泌效應有關。雖然多數因素對光感受器存活的影響是通過小膠質細胞和Müller細胞間接發揮作用，但紅綠色視錐細胞所表達的腦源性神經營養因子（BDNF）受體trkB可直接對BDNF做出應答。在小鼠視網膜變性模型中移植視桿細胞，可減緩視錐細胞的變性，這種所謂的視桿細胞衍生視錐細胞存活因子，是由視桿細胞合成的可擴散因子，與其他已知的營養因子不同[13]。RPE細胞也可能單獨通過營養作用對光感受器的再生和存活產生顯著影響，這主要是由于色素上皮衍生因子（PEDF）的產生[14]。
2.4 光感受器、RPE細胞和虹膜色素上皮（IPE）細胞移植時存在的差異
對于光感受器，細胞發育階段和生長環境對于它們在移植后充分發育和在視網膜中存活的能力至關重要[15]。然而，與光感受器移植比較，移植的RPE細胞幾乎不分年齡或起源，很容易在宿主光感受器周圍延伸頂端絨毛狀突起和吞噬細胞流出外節盤。已有研究表明，體外擴增的RPE細胞具有一定的分化和表達光感受器標記物的能力[16]。但這種能力有限，移植后的細胞分化似乎取決于宿主條件，特別是接受移植部位細胞的成熟度，移植到未成熟視網膜較成熟視網膜更容易成功。
IPE細胞來源于與RPE相同的胚胎細胞系，許多方面與RPE細胞相似，具有頂端/基底極化、微絨毛和同樣類型的緊密連接。該細胞通過虹膜切除很容易收集，因此可以是自體的。然而，盡管IPE細胞移植到AMD患者的視網膜下腔時可能獲得RPE的特性，但也存在若干功能差異。視周期所必需的細胞內外視網膜結合蛋白的基因表達在IPE細胞中低于RPE細胞。體外培養的IPE細胞雖然能夠吞噬光感受器外節，但與RPE細胞相比，降解能力較低。VEGF在IPE細胞中的表達水平也低于RPE細胞，這可能對移植后的脈絡膜恢復/健康有影響，但其對滲出型AMD也可能有益[17]。
2.5 PSC是視網膜病變首選的移植細胞來源
PSC目前被認為是細胞療法的最佳細胞來源，胎兒來源的視網膜前體細胞的潛力也受到關注，PSC還可以為RPE細胞提供現成的來源。人體胚胎干細胞（hESC）因倫理問題在許多國家被禁止使用。它們的分化后代可表達人白細胞抗原（HLA），可能導致移植后的排斥反應，但可以通過建立HLA型hESC庫，為每個移植受體選擇最佳匹配來克服[18]。
誘導PSC（iPSC）譜系在分化成光感受器和RPE能力上有很大差異，這些差異可以歸因于多種因素，控制分化的內源性基因表達的變化已被證明是其中的一個因素。其他已被證明有助于提高分化效率的因素包括DNA甲基化、表觀遺傳記憶、iPSC的遺傳背景和X染色體失活等，但可能導致癌基因的表達增加。外源性生長因子如SB431542、Noggin、DKK1、LEFTY-A、重組人激活素-A和胰島素樣生長因子-1等，也顯示了向神經視網膜和RPE分化的增強作用[19]。
2.6 基因重編程為移植所需的細胞供體提供了新的途徑
基因重編程iPSC與ESC具有共同特性，包括自我更新和分化成3個胚層的能力。不僅可以提供自體干細胞來源，還不需要hESC的倫理關切。在將PSC衍生細胞系輸送到視網膜下腔的移植過程中，進行基因治療的最佳方式是在PSC階段編輯基因組，可以精確地校正突變，從而校正其后的所有衍生分化細胞[20]。由于轉錄因子插入和表達過程可引起基因組突變和功能障礙，用于移植的未分化hESC和iPSC存在于已分化的細胞群中，植入供體后有形成腫瘤（特別是畸胎瘤）的可能，一定程度上限制了基因重編程的應用[21]。
新的基因編輯技術使用專門設計的位點特異性限制性內切酶，如鋅指核酸酶、轉錄激活物樣效應核酸酶，并聚集規律成簇的間隔短回文重復序列/Cas9 RNA引導的核酸酶（CRISPR/Cas）以切除基因的突變部分并同時傳遞校正的副本，然后通過同源重組整合到基因切割點。雖然在尋找最佳策略以確保完全重編程（影響分化能力）、最大化效率以及在編程過程期間和之后最小化遺傳變化方面仍然存在挑戰，但相關研究進展迅速，技術進步顯著[22]。
2.7 3D培養或3D打印可能是一種有前途的再生策略
通過3D培養條件下產生的視網膜“有機體”，可復制體內可見的有組織結構的視網膜層疊，可識別出所有關鍵視網膜細胞類型并觀察到成熟特征，包括2D培養中未見的光感受器外節。該技術具有優化移植前光感受器成熟的巨大潛力，提供了視網膜片移植的可能性以及改善疾病模型、毒理學和藥物測試的巨大機會。此外，包括光感受器在內的視網膜結構，還可以被打印為3D結構，但目前尚無關于這些方法的研究報告[23]。
在AMD的再生策略中，對脈絡膜替換的研究相對較少。有研究證據表明，脈絡膜內皮細胞在AMD發病機制中早期丟失，并且自體RPE移植后，脈絡膜的再灌注對于移植物存活必不可少，然而近期關于這方面的研究進展尚少[24]。
2.8 體外培養的供體細胞的識別和鑒定
RPE細胞在培養的早期，通過特征性的著色和多邊形外觀，很容易識別，隨后被分離出來純化和成熟；成熟度可以通過各種形態、分子和功能特征進行評估。RPE特異性標志物包括MeltK和基礎標記Best1，頂端膜相關標志物包括Na+/K+三磷酸腺苷酶，視覺周期標記包括RPE65、LMAT和視黃醛結合蛋白。吞噬功能、跨上皮阻力和生長因子分泌的頂端（PEDF）/基底（VEGF）極性均可作為功能指標進行檢測[16]。
由于光感受器細胞不著色，適于移植者不易識別。在體外用于識別CRX和神經視網膜亮氨酸拉鏈等光感受器細胞內標記物，不能使用熒光或磁激活細胞分選法來對移植的細胞進行分類。動物模型研究利用由光感受器基因啟動子驅動的轉基因熒光蛋白表達將光感受器細胞進行分類，然而這種方法可能不適合人體研究。Gagliardi等[25]通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術，證實細胞表面抗原CD73僅在人iPSC衍生的光感受器細胞中表達，將CD73+光感受器前體大量分離后，植入光感受器退化模型的視網膜內，能夠長期存活并分化成熟。
2.9 供體細胞植入視網膜下腔后的顯微鏡下改變
形成具有頂端-基底極性的單層并附著于表面，對RPE移植細胞的功能和存活至關重要。移植后檢眼鏡觀察可見注射區視網膜下色素團逐漸擴大，可代表RPE細胞增生，但未顯示陽性自體熒光，或許不具有活力和功能[26]。在部分患者中，RPE細胞簇顯示出分布于萎縮病灶區的傾向，提示這些區域有優先生長，但在萎縮的區域中央沒有產生色素沉著。
視網膜變性動物模型研究表明，視網膜下微環境可影響移植細胞的存活、形態和功能，也可以影響視錐細胞或視桿細胞成功“整合”的傾向[27]。通常視錐細胞的整合數量較視桿細胞更少，對AMD可能的黃斑光感受器替代提出新的挑戰。相反，引起視網膜色素變性的大多數突變主要影響視桿細胞，而視錐細胞在隨后階段中繼發死亡。因此，視桿細胞移植可以挽救動物瀕死的視錐細胞，并已在相關動物模型中得到證實[28]。此外，細胞懸液移植除了RPE黏附問題之外，在遞送過程中存在細胞死亡、注射過程中細胞回流以及注射后細胞分布不完美的問題，所有這些都可能由組織工程方法輔助解決。同時，細胞遞送后的存活和整合，也需要通過加入到移植細胞中的促存活劑來提高，包括潛在地使用聯合基因治療[29]。
3 細胞療法治療AMD的前景展望
由于AMD發病機制涉及到細胞衰老、免疫失調、氧化應激、慢性炎癥以及遺傳和環境等諸多因素，傳統方法治療AMD效果不佳，尤其是萎縮型AMD尚無有效治療方法。通過干細胞移植能有效改善光感受器的退變，并在一定程度上恢復受損的視力，為AMD的治療帶來新的希望[30]。
目前細胞療法治療AMD的基礎研究還存在一些難以克服的局限性，如移植細胞擴增后的分離純化、細胞植入后的存活效率、誘導移植細胞的定向分化、移植細胞的遷徙和定植、移植后的免疫排斥反應、移植物的致瘤性以及可能需要面對的倫理學問題等，都給細胞療法的臨床應用帶來了極大的挑戰。目前研究結果顯示，PSC的基因編輯可能是未來AMD細胞療法的發展方向之一[31]。通過基因編輯不僅可以減少移植細胞的致瘤性，還可以提高移植細胞轉化為目標細胞的效率，并且通過基因技術手段，可以將視網膜的主要膠質細胞Müller細胞重新編程為iPSC，衍生的iPSC能夠向視網膜方向分化，同時產生RPE和含有視網膜前體細胞的自體視網膜類器官結構。PSC與目標細胞共培養，可能是AMD細胞療法的另一發展方向。現有研究結果表明，將PSC與目標細胞（光感受器外節）共培養后，可提高移植細胞的存活率，促進移植細胞的軸突生長，并誘導移植細胞表達RPE細胞的標志物，使移植細胞產生更多的色素顆粒[32]。此外，一些新的治療策略正在研究中，如通過神經營養機制，利用支持細胞來幫助光感受器的部分視覺功能得以保存。阻斷成纖維細胞生長因子/絲裂原活化蛋白激酶信號通路，可誘導人iPSC分化并產生RPE細胞，抑制蛋白激酶C或骨形態發生蛋白信號通路，可顯著提高RPE的分化效率[33-34]。
通過光感受器或RPE移植的細胞療法在臨床前動物模型中的研究已經超過30年，但成效并不顯著。AMD細胞療法的目標是阻止或延緩疾病進程，改善或保留殘存的視覺功能，盡管細胞療法的發展前景令人振奮，但面臨的各種挑戰也很嚴峻，距離常規使用有效安全的細胞治療目標尚遙遠。視網膜微環境中的微妙平衡需要不同細胞類型之間復雜的溝通和相互作用，以應對環境挑戰并保持體內平衡。因此，了解AMD發展不同階段的各種細胞表型特征，闡明引起光感受器死亡的機制以及與疾病發生和進展相關的生物學途徑，是推動AMD細胞療法研究不斷深入的必由之路[35]。