目的對單純皰疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素進行基因擴增，克隆構建真核表達質粒pcDNA3/HSVⅡ TK/As。方法從單純皰疹病毒Ⅱ型（HSVⅡ）Sav株感染的Hep2細胞上清液中提取HSV2基因組DNA，以此為模板，用PCR方法擴增胸苷激酶（TK）基因，將擴增的片段克隆入載體pcDNA3中，挑取陽性克隆測序。限制性核酸內切酶酶切pcDNA3/HSVⅡTK,得到目的基因TK，將其克隆于已構建的真核表達載體pcDNA3/As上。結果HSVⅡTK基因全部編碼區為1 128 bp，基因序列與genebank中報道相符。新質粒pcDNA3/HSVⅡTK/As經限制性核酸內切酶(BamH Ⅰ,Hind Ⅲ)酶切后得到700 bp(As)及1000 bp(HSVⅡTK)相應基因片段。結論本研究成功構建pcDNA3/HSVⅡTK/As真核表達質粒。
【摘要】 目的 觀察已構建的含胸苷激酶（TK）自殺基因的重組腺病毒（ADV-TK）對肝癌細胞的體外殺傷作用和對肝癌裸鼠移植瘤的治療效果。 方法 將ADV-TK體外感染人肝癌細胞株SMMC-7721，噻唑藍（MTT）法檢測受感染的SMMC-7721細胞被不同濃度更昔洛韋（GCV）作用后的細胞存活率情況。構建肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤模型，觀察腫瘤注射重組腺病毒ADV-TK結合GCV治療移植瘤的變化。 結果 相同滴度的重組腺病毒與不同濃度的GCV作用于肝癌細胞株SMMC-7721后，MTT法檢測到細胞的存活率隨著GCV濃度的增加而不斷降低。動物實驗中ADV-TK治療組腫瘤體積明顯小于對照組（ADV-null及NS）（Plt;0.01）。 結論 重組腺病毒ADV-TK對肝癌SMMC-7721細胞的體外增殖和裸鼠體內的移植瘤生長均有明顯的抑制作用。【Abstract】 Objective To explore the inhibitory effect of recombinant adenovirus containing TK gene (ADV-TK) on transfected human liver cancer cells SMMC-7721 in vitro and murine transplanted hepatocarcinoma in vivo. Methods SMMC-7721 cells transfected with ADV-TK were exposed to medium with GCV. The cell viability was measured by MTT assays. In the established model of SMMC-7721 human liver cancer, nude mice underwent intratumoral injection with 1 109 pfu ADV-TK, the control vector (ADV-null) or normal saline (NS) and again 7 days later, twice for all. GCV was given at a dose of l00 mg/(kg?d) on the following day of injection for 10 days. The tumor inhibitory effect was observed by measuring the tumor sizes. Results After transfected by ADV-TK in vitro, and combined with GCV, the cell growth of SMMC-7721 cell were significantly suppressed. The result of in vivo assay showed that tumor volumes in treatment group were apparently smaller than that in the control group (Plt;0.01). Conclusion Recombinant adenovirus combined with GCV shows a significant inhibitory effect on SMMC-7721 cells in vitro and murine transplanted hepatocarcinoma in vivo.
目的 應用基因重組技術，構建含胸苷激酶（tk）自殺基因的復制缺陷型腺病毒（ADV-tk），為進一步研究tk自殺基因對腫瘤的抑制作用奠定基礎。方法 采用細胞內同源重組法構建攜帶tk基因的ADV-tk，經PCR鑒定正確后進行擴增、純化和滴度測定。重組腺病毒ADV-tk體外轉染人肝癌SMMC-7721細胞，RT-PCR檢測tk基因的整合和表達。建立裸鼠人肝癌動物模型，腹腔注射ADV-tk，熒光顯微技術觀察ADV-tk基因在肝臟的轉染情況和對腫瘤細胞的抑制作用。結果 構建的重組腺病毒中帶有tk基因，經擴增、純化后測得重組腺病毒滴度為1.4×1010 pfu/ml。ADV-tk體外轉染SMMC-7721細胞后，RT-PCR檢測顯示tk基因在細胞中整合并且有效表達。體內檢測結果發現ADV-tk在肝臟有明顯轉染，腫瘤組織中凋亡細胞明顯增多。結論 本研究構建的攜帶tk基因的復制缺陷型腺病毒獲得成功，可用于下一步研究。
目的探討以腺病毒為載體介導胸苷激酶（tk）基因對靜脈平滑肌細胞增殖及內膜增生的抑制作用。方法腺病毒載體攜tk及β半乳糖苷酶（lacZ）基因轉染人的大隱靜脈平滑肌細胞及大隱靜脈片,以不同濃度的更昔洛韋（GCV）培養。通過Xgal染色觀察標記基因lacZ的表達效率。將轉染tk基因陽性與tk基因陰性的平滑肌細胞以不同的比例混合培養觀察旁觀者效應。將轉染tk基因的靜脈片在含有GCV的培養液中培養14 d，取標本進行HE、VG染色，輔以計算機圖像分析，觀察內膜增生情況。結果腺病毒載體能有效地轉染培養的平滑肌細胞和靜脈片中的平滑肌細胞，外源基因表達持續14 d。平滑肌細胞增殖受抑制程度與GCV的濃度和tk表達的水平呈正相關。轉染lacZ的平滑肌細胞則不被GCV抑制。混合細胞培養（tk陽性及tk陰性細胞混合），當10%的細胞表達tk基因時，細胞生存率下降了55%。在靜脈片培養實驗中，tk/GCV組與對照組（lacZ/GCV和tk/GCV-）比較，前者內膜增生60%受到抑制。 結論tk基因合并GCV治療具有抑制平滑肌細胞增殖和移植靜脈內膜增生的作用, tk基因治療具有旁觀者效應。