引用本文： 張仲斌, 高凱, 劉慶祝, 周家蓬, 李溪遠, 郎娜, 劉明, 王天爽, 張捷, 王惠, 董穎, 季濤云, 王爽, 劉曉燕, 姜玉武, 蔡立新, 吳曄. 局灶性皮質發育不良 II 型腦組織中新候選基因的體細胞變異. 癲癇雜志, 2020, 6(4): 385-386. doi: 復制
背景 局灶性皮質發育不良（Focal cortical dysplasia，FCD）是大腦發育過程中局部神經元增殖及分化異常而導致的皮質發育畸形，是兒童藥物難治性癲癇的常見病因，也是兒童癲癇外科癲癇病灶切除術的主要病理類型。其中 FCD II 型占比最高，其病理主要表現為皮質分層異常，存在異形神經元，伴或不伴氣球樣細胞，進一步分為 FCD IIa 和 FCD IIb。近十余年來，利用手術切除 FCD II 型腦組織樣本進行深度二代測序，并與患者自身外周血或唾液細胞對照，在 10%～63% 的 FCD II 型患者的病灶腦組織中檢測到體細胞突變，突變基因所編碼的蛋白都位于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of rapamycin，mTOR）通路及其調控通路上，包括 MTOR、PIK3CA、TSC1、TSC2、AKT3、RHEB 和 DEPDC5 等，在病灶組織中突變等位基因頻率為 0.93%～33.5%，突變均導致 PI3K-AKT-mTOR 通路上調。然而，既往研究中仍有約半數 FCD II 型腦組織樣本中基因檢測陰性。本研究旨在發現 FCD II 型腦組織中新的候選基因。
方法 收集 17 例藥物難治性癲癇患兒手術切除的 FCDII 型病灶區腦組織、灶旁區腦組織及外周血樣本，其中包括 FCD IIa 4 例、FCD IIb 13 例。分別對上述 3 類樣本提取的 DNA 進行全外顯子組測序（Whole exome sequencing，WES）（測序深度≥200×）。為了得到病灶組織中的可能有害變異（Potentially deleterious somatic variants，PDSVs），WES 數據進一步根據如下策略逐層進行篩選：① 篩選出 FCD II 型病灶中獨有的體細胞變異（灶旁腦組織及外周血均未檢測到變異）：病灶組織 DNA 中≥4 個獨立變異 reads，灶旁及外周血 DNA 變異 read 為 0；
② 篩選出腦內表達基因：根據 GTEx V7 數據庫，設定腦內平均表達量>1 作為 cut-off 值；
③ 篩選出可疑有害變異：首先將非剪切位點內含子變異及同義變異剔除，然后保留符合下述任何一條的變異：a. 錯義變異（PolyPhen2、SIFT、MutationTaster，≥2 個致病性預測為有害）；b. 無義變異；c. 終止密碼子丟失變異；d. 插入缺失變異；e. 剪切位點變異；f. 收錄在 ClinVar、HGMD 和 Cosmic70 數據庫的變異，最后將保留下的變異中最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）>0.05 的變異剔除；
④ 為了將 WES 假陽性結果最小化：將變異等位基因頻率<1% 的變異剔除；
⑤ 進一步利用擴增子測序方法（讀取深度≥8000×）對 WES 數據篩選出的 PDSVs 進行驗證。最終保留 WES 和擴增子測序變異變異等位基因頻率均≥1% 的變異作為最終 PDSVs。并利用 KEGG 通路數據庫進一步進行通路富集分析。為了確定我們發現的胰島素受體底物 1（Insulin receptor substrate 1，IRS1）基因體細胞變異的致病意義，我們利用 HEK293T 細胞及 FCD II 型腦組織進行了體外功能研究。
結果 在 6 例 FCDII 患兒（6/17，35.3%）的病灶腦組織中發現了 7 個基因中的 7 個 PDSVs，包括 2 個移碼變異及 5 個錯義變異，變異等位基因頻率 1.29%～5.5%。7 個 PDSVs 分別為：MTOR（c.C5930A，p.Thr1977Lys，NM_004958.4）、TSC2（c.C5227T，p.Arg1743Trp，NM_000548.5）、IRS1 （c.1791dupG，p.His598Ala fs*13，NM_005544.2）、RAB6B （c.C383T，p.Thr128Met，NM_016577.4）、RALA （c.G482A，p.Arg161Gln，NM_005402.4）、HTR6 （c.G469A，p.Ala157Thr，NM_000871.3） 和 ZNF337 （c.692_693del；p.Thr231Arg fs*45，NM_001290261.1）。其中 IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA 和 HTR6 尚未報道與任何皮質發育畸形相關。IRS1 和 HTR6 的 PDSVs 已在 COSMIC 數據庫中報道，提示上述 2 個體細胞變異在其他腫瘤樣本中曾被發現。在發現 PDSVs 的 6 例 FCD 病灶中，5 例僅檢測到 1 個 PDSV，1 例（病例 1）病灶中同時檢測到 2 個基因（IRS1 和 ZNF337）的 2 個 PDSVs。
經過通路分析發現，IRS1、RAB6B、RALA 和 HTR6 均與 mTOR 通路存在相互作用。由于 IRS1 恰位于 PI3K-AKT-mTOR 通路上游，本研究選擇 IRS1 進行了進一步的功能研究。通過檢測轉染野生型或突變型 IRS1（c.1791dupG）HEK293T 細胞的 IRS1 蛋白表達，發現 IRS1 c.1791dupG 導致蛋白截短，蛋白表達量無顯著變化。利用免疫印跡法及免疫熒光染色檢測病例 1（檢測到 IRS1 變異的患者）的病灶及灶旁腦組織 S6 磷酸化水平，證實該患兒病灶腦組織較灶旁組織的 mTOR 通路激活水平明顯升高，且主要分布在病灶組織的神經元（包括異形神經元）和氣球樣細胞中。進一步通過檢測轉染野生型或突變型 IRS1 的 HEK293T 細胞 S6 磷酸化水平，證實 IRS1 變異可導致 mTOR 通路異常激活。
結論 17 例 FCD II 型患兒中，6 例病灶腦組織檢測到 7 個基因的 7 個 PDSVs，其中 5 個基因（IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA、HTR6）尚未報道與皮質發育畸形相關。體外功能研究證實 IRS 基因變異可導致 mTOR 通路的過度激活。盡管需要進一步功能學實驗來證實上述 PDSVs 在 FCD II 型中的作用，但本研究結果為 FCD II 型發生機制提供了新的候選基因。
摘譯自：Zhang Z，Gao K，Liu Q， et al. Somatic variants in new candidate genes identified in focal cortical dysplasia type II. Epilepsia，2020，https://doi.org/10.1111/epi.16481.
背景 局灶性皮質發育不良（Focal cortical dysplasia，FCD）是大腦發育過程中局部神經元增殖及分化異常而導致的皮質發育畸形，是兒童藥物難治性癲癇的常見病因，也是兒童癲癇外科癲癇病灶切除術的主要病理類型。其中 FCD II 型占比最高，其病理主要表現為皮質分層異常，存在異形神經元，伴或不伴氣球樣細胞，進一步分為 FCD IIa 和 FCD IIb。近十余年來，利用手術切除 FCD II 型腦組織樣本進行深度二代測序，并與患者自身外周血或唾液細胞對照，在 10%～63% 的 FCD II 型患者的病灶腦組織中檢測到體細胞突變，突變基因所編碼的蛋白都位于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of rapamycin，mTOR）通路及其調控通路上，包括 MTOR、PIK3CA、TSC1、TSC2、AKT3、RHEB 和 DEPDC5 等，在病灶組織中突變等位基因頻率為 0.93%～33.5%，突變均導致 PI3K-AKT-mTOR 通路上調。然而，既往研究中仍有約半數 FCD II 型腦組織樣本中基因檢測陰性。本研究旨在發現 FCD II 型腦組織中新的候選基因。
方法 收集 17 例藥物難治性癲癇患兒手術切除的 FCDII 型病灶區腦組織、灶旁區腦組織及外周血樣本，其中包括 FCD IIa 4 例、FCD IIb 13 例。分別對上述 3 類樣本提取的 DNA 進行全外顯子組測序（Whole exome sequencing，WES）（測序深度≥200×）。為了得到病灶組織中的可能有害變異（Potentially deleterious somatic variants，PDSVs），WES 數據進一步根據如下策略逐層進行篩選：① 篩選出 FCD II 型病灶中獨有的體細胞變異（灶旁腦組織及外周血均未檢測到變異）：病灶組織 DNA 中≥4 個獨立變異 reads，灶旁及外周血 DNA 變異 read 為 0；② 篩選出腦內表達基因：根據 GTEx V7 數據庫，設定腦內平均表達量>1 作為 cut-off 值；③ 篩選出可疑有害變異：首先將非剪切位點內含子變異及同義變異剔除，然后保留符合下述任何一條的變異：a. 錯義變異（PolyPhen2、SIFT、MutationTaster，≥2 個致病性預測為有害）；b. 無義變異；c. 終止密碼子丟失變異；d. 插入缺失變異；e. 剪切位點變異；f. 收錄在 ClinVar、HGMD 和 Cosmic70 數據庫的變異，最后將保留下的變異中最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）>0.05 的變異剔除；④ 為了將 WES 假陽性結果最小化：將變異等位基因頻率<1% 的變異剔除；⑤ 進一步利用擴增子測序方法（讀取深度≥8000×）對 WES 數據篩選出的 PDSVs 進行驗證。最終保留 WES 和擴增子測序變異變異等位基因頻率均≥1% 的變異作為最終 PDSVs。并利用 KEGG 通路數據庫進一步進行通路富集分析。為了確定我們發現的胰島素受體底物 1（Insulin receptor substrate 1，IRS1）基因體細胞變異的致病意義，我們利用 HEK293T 細胞及 FCD II 型腦組織進行了體外功能研究。
結果 在 6 例 FCDII 患兒（6/17，35.3%）的病灶腦組織中發現了 7 個基因中的 7 個 PDSVs，包括 2 個移碼變異及 5 個錯義變異，變異等位基因頻率 1.29%～5.5%。7 個 PDSVs 分別為：MTOR（c.C5930A，p.Thr1977Lys，NM_004958.4）、TSC2（c.C5227T，p.Arg1743Trp，NM_000548.5）、IRS1 （c.1791dupG，p.His598Ala fs*13，NM_005544.2）、RAB6B （c.C383T，p.Thr128Met，NM_016577.4）、RALA （c.G482A，p.Arg161Gln，NM_005402.4）、HTR6 （c.G469A，p.Ala157Thr，NM_000871.3） 和 ZNF337 （c.692_693del；p.Thr231Arg fs*45，NM_001290261.1）。其中 IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA 和 HTR6 尚未報道與任何皮質發育畸形相關。IRS1 和 HTR6 的 PDSVs 已在 COSMIC 數據庫中報道，提示上述 2 個體細胞變異在其他腫瘤樣本中曾被發現。在發現 PDSVs 的 6 例 FCD 病灶中，5 例僅檢測到 1 個 PDSV，1 例（病例 1）病灶中同時檢測到 2 個基因（IRS1 和 ZNF337）的 2 個 PDSVs。
經過通路分析發現，IRS1、RAB6B、RALA 和 HTR6 均與 mTOR 通路存在相互作用。由于 IRS1 恰位于 PI3K-AKT-mTOR 通路上游，本研究選擇 IRS1 進行了進一步的功能研究。通過檢測轉染野生型或突變型 IRS1（c.1791dupG）HEK293T 細胞的 IRS1 蛋白表達，發現 IRS1 c.1791dupG 導致蛋白截短，蛋白表達量無顯著變化。利用免疫印跡法及免疫熒光染色檢測病例 1（檢測到 IRS1 變異的患者）的病灶及灶旁腦組織 S6 磷酸化水平，證實該患兒病灶腦組織較灶旁組織的 mTOR 通路激活水平明顯升高，且主要分布在病灶組織的神經元（包括異形神經元）和氣球樣細胞中。進一步通過檢測轉染野生型或突變型 IRS1 的 HEK293T 細胞 S6 磷酸化水平，證實 IRS1 變異可導致 mTOR 通路異常激活。
結論 17 例 FCD II 型患兒中，6 例病灶腦組織檢測到 7 個基因的 7 個 PDSVs，其中 5 個基因（IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA、HTR6）尚未報道與皮質發育畸形相關。體外功能研究證實 IRS 基因變異可導致 mTOR 通路的過度激活。盡管需要進一步功能學實驗來證實上述 PDSVs 在 FCD II 型中的作用，但本研究結果為 FCD II 型發生機制提供了新的候選基因。
摘譯自：Zhang Z，Gao K，Liu Q， et al. Somatic variants in new candidate genes identified in focal cortical dysplasia type II. Epilepsia，2020，https://doi.org/10.1111/epi.16481.