引用本文： 相隗文殊, 徐煜宸, 吳曄, 包新華, 張月華, 袁宏杰, 姜玉武. GRIN2D 相關發育性癲癇腦病的臨床表型及突變功能異質性. 癲癇雜志, 2020, 6(1): 78-79. doi: 復制
背景 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體是一類重要的離子型谷氨酸受體，主要表達于神經元的突觸后膜，介導中樞神經系統興奮性突觸傳遞中的慢鈣電流成分，與學習記憶、突觸可塑性等生理功能及癲癇、發育遲緩、精神分裂癥等多種神經系統發育性疾病有關。GRIN2D 主要表達于胎兒時期及生后早期，其編碼的 GluN2D 亞基既往曾報道與早發癲癇性腦病（Early infantile epileptic encephalopathy，EIEE）高度相關，但目前 GRIN2D 變異的相關功能研究較少、致病機制尚不明確。
方法 收集特發性癲癇伴智力障礙/發育遲緩患者及其父母的血液，采用二代測序靶向捕獲或全外顯子測序技術檢測 DNA 序列的變化，獲取患者可疑的致病性基因變異，利用 Sanger 測序進行家系驗證；采用定點突變技術構建 GRIN2D 突變載體，體外合成 cRNA，顯微注射表達于非洲爪哇蟾蜍卵母細胞，同時使用 cDNA 轉染 HEK293 細胞系，利用膜片鉗技術檢測突變受體的功能變化；采用 β-內酰胺酶報告基因，檢測受體蛋白表達量變化；利用帶有 GFP 標簽的載體，轉染大鼠原代神經元并使用 NMDA 受體抑制劑 Memantine 進行處理，利用免疫熒光觀察 GRIN2D 突變對神經元的興奮性毒性。對新發現的導致功能增強的變異，檢測其對美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市的 NMDA 受體抑制劑的敏感性。
結果 研究共收集了來自中國、美國、歐洲及中東等地區的 8 例攜帶 GRIN2D 基因變異的患者，年齡為 9 個月～34 歲，男性、女性患者各 4 例，均無明確神經系統疾病家族史及圍產期病史。87.5% 的患者癲癇起病年齡在 1 歲以內，均為藥物難治性癲癇，發作形式以痙攣發作為主，部分患者隨著病情發展逐漸出現其他發作形式，如局灶發作伴泛化、失張力發作、肌陣攣發作等。所有患者均有不同程度的智力障礙/發育遲滯，部分患者出現肌張力異常、運動障礙、喂養困難、睡眠障礙及早亡。8 例患者共攜帶 7 種不同的 GRIN2D 變異位點，包括 S573F、L670F、V667I、A675T、A678D、S1271L 及 R1313W。除 V667I 為既往已報道的功能獲得型變異外，其余均為既往未見報道的新變異。對基因的保守性及變異頻率進行分析，71%（5/7）的突變位于突變高度不耐受區域，S573F 位于 GluN2D 蛋白的 pre-M1 功能域，L670F、V667I、A675T 及 A678D 位于 M3 功能域，均直接參與 NMDA 受體通道孔的形成；S1271L 和 R1313W 位于 GluN2D 蛋白的胞內段，與信號轉導及受體上膜直接相關。膜片鉗的結果顯示，L670F、A675T 及 A678D 對 NMDA 受體激動劑谷氨酸、甘氨酸及 D-絲氨酸的 EC50 下降 2.8～19 倍，NMDA 受體抑制劑氫離子的敏感性降低至野生型的 1/3～1/2，提高通道開放率 29～52 倍，導致受體功能增強。而 S573F、S1271L 及 R1313W 的谷氨酸、甘氨酸和 D-絲氨酸的效能降低 1.5～3 倍，氫離子敏感性與野生型相比并無顯著改變，通道開放率降低 2.2～4.3 倍，導致受體功能下降。6 種新變異均會導致 HEK293 細胞中 GluN2D 亞基的表達量下降。為進一步指導臨床個體化治療，本研究還在爪哇蟾蜍卵上針對導致受體電生理功能增強的 3 個突變 L670F、A675T 和 A678D 進行了 FDA 批準上市的受體阻滯劑（Memantine、Dextromethorphan、Dextrorphan 和 Ketamine）的效能評估。全部 4 種 NMDA 受體通道阻滯劑均能在不同程度上抑制野生型及突變型的 GluN2D 受體。但 4 種藥物對 L670F 和 A675T 突變受體的敏感性與野生型相比差異有統計學意義，提示 4 種藥物如用于突變患者，所需劑量將遠高于未突變患者；A678D 突變受體除 Memantine 外的 3 種藥物的敏感性及最大劑量下的電流抑制率與野生型受體相比差異無統計學意義，提示如常規抗癲癇藥物無法控制 A678D 突變患者的癲癇發作，則 Dextromethorphan 及 Ketamine 可作為其臨床個體化治療的備選藥物。
結論 GRIN2D 基因變異可直接影響 GluN2D 亞基的電生理特性及通道表達，導致受體功能增強或功能降低，影響腦網絡的興奮和抑制平衡，進而導致發育性癲癇腦病表型的產生。針對突變進行 FDA 已經批準上市的 NMDA 受體激動劑或阻滯劑的篩選將為突變相關患者臨床個體化治療提供依據。
摘譯自 XiangWei WX，Kannan V，Xu YC，et al. Heterogeneous clinical and functional features of GRIN2D-related developmental and epileptic encephalopathy. Brain，2019，142（10）：3009-3027.
背景 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體是一類重要的離子型谷氨酸受體，主要表達于神經元的突觸后膜，介導中樞神經系統興奮性突觸傳遞中的慢鈣電流成分，與學習記憶、突觸可塑性等生理功能及癲癇、發育遲緩、精神分裂癥等多種神經系統發育性疾病有關。GRIN2D 主要表達于胎兒時期及生后早期，其編碼的 GluN2D 亞基既往曾報道與早發癲癇性腦病（Early infantile epileptic encephalopathy，EIEE）高度相關，但目前 GRIN2D 變異的相關功能研究較少、致病機制尚不明確。
方法 收集特發性癲癇伴智力障礙/發育遲緩患者及其父母的血液，采用二代測序靶向捕獲或全外顯子測序技術檢測 DNA 序列的變化，獲取患者可疑的致病性基因變異，利用 Sanger 測序進行家系驗證；采用定點突變技術構建 GRIN2D 突變載體，體外合成 cRNA，顯微注射表達于非洲爪哇蟾蜍卵母細胞，同時使用 cDNA 轉染 HEK293 細胞系，利用膜片鉗技術檢測突變受體的功能變化；采用 β-內酰胺酶報告基因，檢測受體蛋白表達量變化；利用帶有 GFP 標簽的載體，轉染大鼠原代神經元并使用 NMDA 受體抑制劑 Memantine 進行處理，利用免疫熒光觀察 GRIN2D 突變對神經元的興奮性毒性。對新發現的導致功能增強的變異，檢測其對美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市的 NMDA 受體抑制劑的敏感性。
結果 研究共收集了來自中國、美國、歐洲及中東等地區的 8 例攜帶 GRIN2D 基因變異的患者，年齡為 9 個月～34 歲，男性、女性患者各 4 例，均無明確神經系統疾病家族史及圍產期病史。87.5% 的患者癲癇起病年齡在 1 歲以內，均為藥物難治性癲癇，發作形式以痙攣發作為主，部分患者隨著病情發展逐漸出現其他發作形式，如局灶發作伴泛化、失張力發作、肌陣攣發作等。所有患者均有不同程度的智力障礙/發育遲滯，部分患者出現肌張力異常、運動障礙、喂養困難、睡眠障礙及早亡。8 例患者共攜帶 7 種不同的 GRIN2D 變異位點，包括 S573F、L670F、V667I、A675T、A678D、S1271L 及 R1313W。除 V667I 為既往已報道的功能獲得型變異外，其余均為既往未見報道的新變異。對基因的保守性及變異頻率進行分析，71%（5/7）的突變位于突變高度不耐受區域，S573F 位于 GluN2D 蛋白的 pre-M1 功能域，L670F、V667I、A675T 及 A678D 位于 M3 功能域，均直接參與 NMDA 受體通道孔的形成；S1271L 和 R1313W 位于 GluN2D 蛋白的胞內段，與信號轉導及受體上膜直接相關。膜片鉗的結果顯示，L670F、A675T 及 A678D 對 NMDA 受體激動劑谷氨酸、甘氨酸及 D-絲氨酸的 EC50 下降 2.8～19 倍，NMDA 受體抑制劑氫離子的敏感性降低至野生型的 1/3～1/2，提高通道開放率 29～52 倍，導致受體功能增強。而 S573F、S1271L 及 R1313W 的谷氨酸、甘氨酸和 D-絲氨酸的效能降低 1.5～3 倍，氫離子敏感性與野生型相比并無顯著改變，通道開放率降低 2.2～4.3 倍，導致受體功能下降。6 種新變異均會導致 HEK293 細胞中 GluN2D 亞基的表達量下降。為進一步指導臨床個體化治療，本研究還在爪哇蟾蜍卵上針對導致受體電生理功能增強的 3 個突變 L670F、A675T 和 A678D 進行了 FDA 批準上市的受體阻滯劑（Memantine、Dextromethorphan、Dextrorphan 和 Ketamine）的效能評估。全部 4 種 NMDA 受體通道阻滯劑均能在不同程度上抑制野生型及突變型的 GluN2D 受體。但 4 種藥物對 L670F 和 A675T 突變受體的敏感性與野生型相比差異有統計學意義，提示 4 種藥物如用于突變患者，所需劑量將遠高于未突變患者；A678D 突變受體除 Memantine 外的 3 種藥物的敏感性及最大劑量下的電流抑制率與野生型受體相比差異無統計學意義，提示如常規抗癲癇藥物無法控制 A678D 突變患者的癲癇發作，則 Dextromethorphan 及 Ketamine 可作為其臨床個體化治療的備選藥物。
結論 GRIN2D 基因變異可直接影響 GluN2D 亞基的電生理特性及通道表達，導致受體功能增強或功能降低，影響腦網絡的興奮和抑制平衡，進而導致發育性癲癇腦病表型的產生。針對突變進行 FDA 已經批準上市的 NMDA 受體激動劑或阻滯劑的篩選將為突變相關患者臨床個體化治療提供依據。
摘譯自 XiangWei WX，Kannan V，Xu YC，et al. Heterogeneous clinical and functional features of GRIN2D-related developmental and epileptic encephalopathy. Brain，2019，142（10）：3009-3027.