引用本文： 石奕武, 張琦, 汪潔, 易詠紅, 廖衛平, 康靜瓊. GABRB3突變引發GABAA受體突觸聚集差異化導致輕重不一的癲癇綜合征. 癲癇雜志, 2019, 5(6): 492-492. doi: 復制
背景 γ-氨基丁酸 A（GABAA）受體是神經系統重要的抑制性受體，是大腦興奮的重要決定因素。GABRB3 在腦發育時期高度表達，其編碼的 β3 亞基對 GABAA 受體的組裝和轉運起關鍵作用，并且對胚胎腦的干細胞分化起關鍵作用。迄今為止，人們已經在癲癇及神經發育疾病中發現 400 多個 GABRB3 變異點。攜帶變異的癲癇患者包括嚴重的兒童癲癇類型，如 Lennox-Gastaut 綜合征（LGS）、Dravet 綜合征和伴有智力障礙的嬰兒痙攣；也包括輕型的癲癇類型，如兒童失神性癲癇。目前，GABRB3 突變如何導致癲癇表型不一的分子機制仍然不明。
方法 收集特發性癲癇患者及其父母的血液，抽提全基因組 DNA，采用全外顯子測序技術檢測三者 DNA 序列的變化，獲取患者基因變異位點、方式及來源；結合運用生物信息學及臨床表型分析，獲取患者潛在致病突變，并進行 Sanger 測序驗證；采用定點有點技術構建 GABRB3 突變表達載體，轉染 HEK293T 細胞，采用高通量流式細胞檢測技術檢測 β3 亞基和 GABAA 受體另一重要亞基 γ2 的表達。對新發現的 GABRB3 突變，進一步在 HEK293 細胞和大鼠神經細胞中，采用共聚焦顯微技術、蛋白免疫組化技術和膜片鉗技術進行 β3 突變體表達、定位及電生理功能檢測分析，同時檢測 γ2 亞基的表達與定位變化；采用 β3 亞基敲除小鼠驗證 γ2 亞基的表達與定位的變化。
結果 本研究在兩個表型輕重不一的癲癇患者中發現 GABRB3 兩個新的錯義突變，其中嚴重癲癇類型 LGS 患者攜帶新生的 N328D 突變；輕型癲癇類型青少年失神癲癇患者（Juvenile absence epilepsy，JAE）攜帶 E357K 突變，該突變來自無病的父親。結合患者的臨床表型、突變方式、突變頻率、突變點保守性分析及排除其它可能致病的基因突變，確定這兩個突變為潛在致病突變。9 個與癲癇及神經發育疾病相關的 GABRB3 突變（包括 N328D 和 E357K）引起 β3 亞基在 HEK293 細胞的表面表達降低，其中大多數同時引起 γ2 亞基表達降低。N328D 和 E357K 突變體均導致 GABAA 激活電流幅度降低，前者降低更為顯著；而對阻滯劑鋅離子的敏感性，突變體 E357K 高于 N328D。兩個突變降低 β3 亞基在 HEK293 細胞膜上的表達，同時降低 γ2 亞基的表達。在大鼠神經細胞中，兩個突變導致 β3 亞基在細胞膜和抑制性突觸的表達量均下降，同時導致 γ2 亞基上膜及在突觸后膜上表達減少，減少突觸后膜上 GABAA 受體數量。LGS 相關的突變 N328D 與 JAE 相關的突變 E357K 比較，前者引起 β3 亞基表達降低更為顯著，突變蛋白聚集在神經元胞體內，無法上膜；后者有少量的突變蛋白可以上膜，前者突觸后膜上 GABAA 受體數量減少更為顯著。在 β3 亞基敲除小鼠上同樣發現抑制性突觸后膜上 γ2 亞基及 GABAA 受體數量減少。
結論 GABRB3 突變可以降低 β3 亞基的表達及上膜，同時可以降低 γ2 亞基的表達及上膜，從而減少了抑制性突觸后膜 GABAA 受體的數量，損害受體抑制功能，這可能是 GABRB3 突變導致癲癇及神經發育疾病的共同機制。GABRB3 突變通過不同的細胞機制引起亞基在神經細胞內聚集程度不一，導致突觸后膜上 GABAA 受體數量存在差異，從而導致受體抑制功能損害程度出現差異，引發表型輕重不一的癲癇。本研究提出了 β3 亞基突變損害 GABAA 受體抑制功能的新機制，同時為理解 GABRB3 突變如何導致嚴重的癲癇綜合征及表型輕重不一的癲癇提供了關鍵性的實驗依據。
摘譯自：Shi YW，Zhang Q，Cai K，et al. Synaptic clustering differences due to different GABRB3 mutations cause variable epilepsy syndromes. Brain, 2019, 142（10）: 3028-3044.
背景 γ-氨基丁酸 A（GABAA）受體是神經系統重要的抑制性受體，是大腦興奮的重要決定因素。GABRB3 在腦發育時期高度表達，其編碼的 β3 亞基對 GABAA 受體的組裝和轉運起關鍵作用，并且對胚胎腦的干細胞分化起關鍵作用。迄今為止，人們已經在癲癇及神經發育疾病中發現 400 多個 GABRB3 變異點。攜帶變異的癲癇患者包括嚴重的兒童癲癇類型，如 Lennox-Gastaut 綜合征（LGS）、Dravet 綜合征和伴有智力障礙的嬰兒痙攣；也包括輕型的癲癇類型，如兒童失神性癲癇。目前，GABRB3 突變如何導致癲癇表型不一的分子機制仍然不明。
方法 收集特發性癲癇患者及其父母的血液，抽提全基因組 DNA，采用全外顯子測序技術檢測三者 DNA 序列的變化，獲取患者基因變異位點、方式及來源；結合運用生物信息學及臨床表型分析，獲取患者潛在致病突變，并進行 Sanger 測序驗證；采用定點有點技術構建 GABRB3 突變表達載體，轉染 HEK293T 細胞，采用高通量流式細胞檢測技術檢測 β3 亞基和 GABAA 受體另一重要亞基 γ2 的表達。對新發現的 GABRB3 突變，進一步在 HEK293 細胞和大鼠神經細胞中，采用共聚焦顯微技術、蛋白免疫組化技術和膜片鉗技術進行 β3 突變體表達、定位及電生理功能檢測分析，同時檢測 γ2 亞基的表達與定位變化；采用 β3 亞基敲除小鼠驗證 γ2 亞基的表達與定位的變化。
結果 本研究在兩個表型輕重不一的癲癇患者中發現 GABRB3 兩個新的錯義突變，其中嚴重癲癇類型 LGS 患者攜帶新生的 N328D 突變；輕型癲癇類型青少年失神癲癇患者（Juvenile absence epilepsy，JAE）攜帶 E357K 突變，該突變來自無病的父親。結合患者的臨床表型、突變方式、突變頻率、突變點保守性分析及排除其它可能致病的基因突變，確定這兩個突變為潛在致病突變。9 個與癲癇及神經發育疾病相關的 GABRB3 突變（包括 N328D 和 E357K）引起 β3 亞基在 HEK293 細胞的表面表達降低，其中大多數同時引起 γ2 亞基表達降低。N328D 和 E357K 突變體均導致 GABAA 激活電流幅度降低，前者降低更為顯著；而對阻滯劑鋅離子的敏感性，突變體 E357K 高于 N328D。兩個突變降低 β3 亞基在 HEK293 細胞膜上的表達，同時降低 γ2 亞基的表達。在大鼠神經細胞中，兩個突變導致 β3 亞基在細胞膜和抑制性突觸的表達量均下降，同時導致 γ2 亞基上膜及在突觸后膜上表達減少，減少突觸后膜上 GABAA 受體數量。LGS 相關的突變 N328D 與 JAE 相關的突變 E357K 比較，前者引起 β3 亞基表達降低更為顯著，突變蛋白聚集在神經元胞體內，無法上膜；后者有少量的突變蛋白可以上膜，前者突觸后膜上 GABAA 受體數量減少更為顯著。在 β3 亞基敲除小鼠上同樣發現抑制性突觸后膜上 γ2 亞基及 GABAA 受體數量減少。
結論 GABRB3 突變可以降低 β3 亞基的表達及上膜，同時可以降低 γ2 亞基的表達及上膜，從而減少了抑制性突觸后膜 GABAA 受體的數量，損害受體抑制功能，這可能是 GABRB3 突變導致癲癇及神經發育疾病的共同機制。GABRB3 突變通過不同的細胞機制引起亞基在神經細胞內聚集程度不一，導致突觸后膜上 GABAA 受體數量存在差異，從而導致受體抑制功能損害程度出現差異，引發表型輕重不一的癲癇。本研究提出了 β3 亞基突變損害 GABAA 受體抑制功能的新機制，同時為理解 GABRB3 突變如何導致嚴重的癲癇綜合征及表型輕重不一的癲癇提供了關鍵性的實驗依據。
摘譯自：Shi YW，Zhang Q，Cai K，et al. Synaptic clustering differences due to different GABRB3 mutations cause variable epilepsy syndromes. Brain, 2019, 142（10）: 3028-3044.