目的 構建同時表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報告基因和人類Nel1 型蛋白[homo sapiens NEL-like 1，NELL1）] 基因的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-NELL1，并轉染大鼠BMSCs，觀察其表達情況，為進一步研究NELL1 蛋白的成骨作用提供理論基礎。 方法 設計特異性引物從NELL1 質粒中擴增NELL1，將測序正確的片段用XhoI/BglII 酶切處理，定向插入至pShuttle-GFP-CMV（-）TEMP 重組穿梭載體，然后將驗證正確的重組穿梭質粒中的插入片段轉移至pAdxsi 載體構建重組腺病毒載體質粒，用PacI 限制性內切酶線性化后轉染HEK293 細胞，擴增純化重組腺病毒，半數組織培養感染量法測定重組腺病毒滴度。培養大鼠BMSCs，采用流式細胞儀鑒定表面標志物，并行成骨、成脂誘導鑒定。用構建的pAdxsi-GFP-NELL1 及空病毒pAdxsi-GFP（作為對照）轉染鑒定正確的BMSCs，RT-PCR 檢測NELL1 的表達，免疫熒光檢測GFP 基因及NELL1 的表達情況，細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測對細胞增殖的影響。 結果 成功構建同時表達NELL1 和GFP 基因的重組腺病毒載體（pAdxsi-GFP-NELL1），純化后獲得滴度達1 × 1011 pfu/mL 的重組腺病毒。成功分離獲得大鼠BMSCs 并傳代、純化，經流式細胞儀鑒定表面標志物及成骨、成脂誘導鑒定為BMSCs。pAdxsi-GFP-NELL1 轉染BMSCs 后，RT-PCR 檢測示NELL1 mRNA 陽性表達，熒光顯微鏡觀察示細胞爬片GFP 陽性表達，NELL1 抗體免疫熒光觀察示NELL1 蛋白陽性表達。CCK-8 法鑒定顯示轉染后對BMSCs生長無明顯影響。 結論 構建并純化后的重組腺病毒載體（pAdxsi-GFP-NELL1）可高效轉染大鼠BMSCs，并穩定表達NELL1 和GFP 兩種基因，為進一步研究新的成骨基因NELL1 的作用，追蹤其在體內、體外表達情況提供了新工具。
引用本文： 薛靜,彭江,張莉,劉舒云,陳繼鳳,汪愛媛,袁玫,許文靜,盧世璧. 綠色熒光蛋白和Nel1 型蛋白基因共表達腺病毒載體的構建及體外轉染大鼠BMSCs 的初步實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2010, 24(5): 606-612. doi: 復制