Nesprin蛋白對骨髓間充質干細胞的影響_《中國胸心血管外科臨床雜志》

作者：

楊文鋼 , 薛松 , 連鋒 , 汪永義 , 胡振雷 , 朱洪生

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院　心血管外科，　上海　200127;

關鍵詞：

Nesprin蛋白　骨髓間充質干細胞　細胞增殖　慢病毒載體

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目的　構建nesprin蛋白siRNA慢病毒載體（LV-siNesprin），感染骨髓間充質干細胞（MSCs），觀察nesprin蛋白對MSCs的影響。　方法　針對nesprin靶基因序列設計并合成4對miRNA oligo，并將4對oligo退火成雙鏈DNA，測序鑒定。將4種miRNA干擾質粒（SR-1、SR-2、SR-3、SR-4）轉入大鼠血管平滑肌細胞，用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和蛋白印跡法（Western blotting）檢測干擾效應，篩選最佳干擾序列；將最佳干擾序列和pDONR221載體進行重組反應，獲得含干擾序列的入門載體，再將入門載體和慢病毒表達的目的載體pLenti6/V5-DEST進行重組反應獲得含干擾序列的LV-siNesprin＋綠色熒光蛋白（GFP），包裝慢病毒，測定病毒滴度。LV-siNesprin＋GFP轉染MSCs，Western blotting鑒定比較nesprin蛋白表達情況（分為LV-siNesprin＋GFP組、GFP對照組和正常細胞組），用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察細胞核形態改變和四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測MSCs感染LV-siNesprin后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情況（分為LV-siNesprin＋GFP組、GFP對照組和正常細胞組）。　結果　測序證實合成的4對miRNA oligo正確，RT-PCR和Western blotting篩選出最佳干擾miRNA質粒SR-3，成功構建LV-siNesprin，包裝慢病毒，病毒懸液的活性滴度為1×106 ifu/ml。LV-siNesprin轉染MSCs后，nesprin蛋白表達明顯下降，出現細胞核融合、核碎裂等形態學改變；MTT法檢測顯示，LV-siNesprin＋GFP組MSCs增殖速度較GFP對照組和正常細胞組減慢。　結論　Nesprin蛋白對MSCs核膜穩定維持核膜空間結構起作用，并利于細胞增殖更新。

引用本文： 楊文鋼,薛松,連鋒,汪永義,胡振雷,朱洪生. Nesprin蛋白對骨髓間充質干細胞的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2012, 19(4): 408-413. doi: 復制

1.	Chen X， Katakowski M， Li Y， et al. Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts：growth factor production. J Neurosci Res， 2002， 69 （5）：687-691.
2.	朱洪生，連鋒，朱偉，等. 骨髓間質干細胞體外轉化為心肌細胞的實驗研究. 上海第二醫科大學學報， 2002， 22 （5）：391-395．.
3.	Makino S， Fukuda K， Miyoshi S， et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J Clin Invest， 1999， 103 （5）：697-705.
4.	Rando OJ， Zhao K， Crabtree GR. Searching for a function for nuclear actin. Trends Cell Biol， 2000， 10 （3）：92-97.
5.	Zhang Q， Skepper JN， Yang F， et al. Nesprins：a novel family of spectrin-repeat-containing proteins that localize to the nuclear membrane in multiple tissues. J Cell Sci， 2001， 114 （Pt 24）：4485-4498.
6.	Zhang Q， Ragnauth CD， Skepper JN， et al. Nesprin-2 is a multi-isomeric protein that binds lamin and emerin at the nuclear envelope and forms a subcellular network in skeletal muscle. J Cell Sci， 2005， 118 （Pt 4）：673-687.
7.	Lei K， Zhang X， Ding X， et al. SUN1 and SUN2 play critical but partially redundant roles in anchoring nuclei in skeletal muscle cells in mice. Proc Natl Acad Sci U S A， 2009， 106 （25）：10207-10212.
8.	Olins AL， Hoang TV， Zwerger M， et al. The LINC-less granulocyte nucleus. Eur J Cell Biol， 2009， 88 （4）：203-214.
9.	Kobayashi Y， Katanosaka Y， Iwata Y， et al. Identification and characterization of GSRP-56， a novel Golgi-localized spectrin repeat-containing protein. Exp Cell Res， 2006， 312 （16）：3152-3164.
10.	Gough LL， Beck KA. The spectrin family member Syne-1 functions in retrograde transport from Golgi to ER. Biochim Biophys Acta， 2004， 1693 （1）：29-36.
11.	Apel ED， Lewis RM， Grady RM， et al. Syne-1， a dystrophin- and klarsicht-related protein associated with synaptic nuclei at the neuromuscular junction. J Biol Chem， 2000， 275 （41）：31986-31995.
12.	Gruenbaum， Y GY， Meyuhas R， et al. The nuclear lamina and its functions in the nucleus. Int Rev Cytol， 2003， 226：1-62.
13.	Zhang Q， Bethmann C， Worth NF， et al. Nesprin-1 and -2 are involved in the pathogenesis of Emery Dreifuss muscular dystrophy and are critical for nuclear envelope integrity. Hum Mol Genet， 2007， 16 （23）：2816-2833.
14.	Puckelwartz MJ， Kessler EJ， Kim G， et al. Nesprin-1 mutations in human and murine cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol， 2010， 48（4）：600-608.
15.	Farhana H， Mazzeo D， Patel JT， et al. Mammalian SUN protein interaction networks at the inner nuclear membrane and their role in laminopathy disease processes. J Biol Chem， 2010， 285 （5）：3487-3498.
16.	Zhang X， Lei K， Yuan X， et al. SUN1/2 and Syne/nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron， 2009， 64 （2）：173-187.

1. 　Chen X， Katakowski M， Li Y， et al. Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts：growth factor production. J Neurosci Res， 2002， 69 （5）：687-691.
2. 　朱洪生，連鋒，朱偉，等. 骨髓間質干細胞體外轉化為心肌細胞的實驗研究. 上海第二醫科大學學報， 2002， 22 （5）：391-395．.
3. 　Makino S， Fukuda K， Miyoshi S， et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J Clin Invest， 1999， 103 （5）：697-705.
4. 　Rando OJ， Zhao K， Crabtree GR. Searching for a function for nuclear actin. Trends Cell Biol， 2000， 10 （3）：92-97.
5. 　Zhang Q， Skepper JN， Yang F， et al. Nesprins：a novel family of spectrin-repeat-containing proteins that localize to the nuclear membrane in multiple tissues. J Cell Sci， 2001， 114 （Pt 24）：4485-4498.
6. 　Zhang Q， Ragnauth CD， Skepper JN， et al. Nesprin-2 is a multi-isomeric protein that binds lamin and emerin at the nuclear envelope and forms a subcellular network in skeletal muscle. J Cell Sci， 2005， 118 （Pt 4）：673-687.
7. 　Lei K， Zhang X， Ding X， et al. SUN1 and SUN2 play critical but partially redundant roles in anchoring nuclei in skeletal muscle cells in mice. Proc Natl Acad Sci U S A， 2009， 106 （25）：10207-10212.
8. 　Olins AL， Hoang TV， Zwerger M， et al. The LINC-less granulocyte nucleus. Eur J Cell Biol， 2009， 88 （4）：203-214.
9. 　Kobayashi Y， Katanosaka Y， Iwata Y， et al. Identification and characterization of GSRP-56， a novel Golgi-localized spectrin repeat-containing protein. Exp Cell Res， 2006， 312 （16）：3152-3164.
10. 　Gough LL， Beck KA. The spectrin family member Syne-1 functions in retrograde transport from Golgi to ER. Biochim Biophys Acta， 2004， 1693 （1）：29-36.
11. 　Apel ED， Lewis RM， Grady RM， et al. Syne-1， a dystrophin- and klarsicht-related protein associated with synaptic nuclei at the neuromuscular junction. J Biol Chem， 2000， 275 （41）：31986-31995.
12. 　Gruenbaum， Y GY， Meyuhas R， et al. The nuclear lamina and its functions in the nucleus. Int Rev Cytol， 2003， 226：1-62.
13. 　Zhang Q， Bethmann C， Worth NF， et al. Nesprin-1 and -2 are involved in the pathogenesis of Emery Dreifuss muscular dystrophy and are critical for nuclear envelope integrity. Hum Mol Genet， 2007， 16 （23）：2816-2833.
14. 　Puckelwartz MJ， Kessler EJ， Kim G， et al. Nesprin-1 mutations in human and murine cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol， 2010， 48（4）：600-608.
15. 　Farhana H， Mazzeo D， Patel JT， et al. Mammalian SUN protein interaction networks at the inner nuclear membrane and their role in laminopathy disease processes. J Biol Chem， 2010， 285 （5）：3487-3498.
16. 　Zhang X， Lei K， Yuan X， et al. SUN1/2 and Syne/nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron， 2009， 64 （2）：173-187.

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Nesprin蛋白對骨髓間充質干細胞的影響

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