引用本文： 張文娟, 王廣文, 楊建仲. 重組人促紅細胞生成素對戊四氮致癇大鼠海馬蛋白質組學的研究. 癲癇雜志, 2022, 8(6): 529-534. doi: 10.7507/2096-0247.202207006 復制
癲癇是最常見的嚴重腦部疾病之一，影響全球7 000多萬人。其發病率呈雙峰分布，嬰兒和老年人群的風險最高[1]。癲癇是一種表現為反復癇性發作的慢性腦疾病，神經細胞凋亡是癲癇發作造成神經系統損傷的重要機制。國內有研究發現癲癇發作后1周凋亡的神經細胞達高峰[2]，單次驚厥后亦能引起神經細胞凋亡[3], 并隨著驚厥次數的不斷增加神經細胞凋亡數目也逐漸增多。近來又有研究發現癲癇發作可使線粒體的結構和功能受損，呼吸鏈活性氧產生增加、DNA突變、鈣超載、脂質過氧化及細胞色素C釋放，進而導致神經細胞凋亡[4-5]。而神經細胞的凋亡又增加了癲癇再發的可能性和認知功能的損害[6]。
神經細胞凋亡通路主要包括線粒體通路、死亡受體通路、PARP/AIF通路[7]。神經細胞凋亡是一個可調控的過程，因此通過抑制凋亡的發生，可以減少神經細胞的死亡。隨著分子生物學的不斷進展，研究發現紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）除了其眾所周知的促進紅細胞生成的作用外，EPO還具有抗凋亡的作用[8-9]。
研究運用蛋白質組學技術，通過分析鑒定重組人促紅細胞生成素（Recombinant human erythropoietin，r-HuEPO）對戊四氮（Pentetrazol，PTZ）致癇大鼠海馬組織中差異表達的蛋白質，為尋找新的治療靶點提供有力依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
所有實驗鼠均在標準實驗環境（每日光照黑暗12 h交替，室溫24±2℃，濕度40%～70%，自由飲食進水）恒溫恒濕中飼養。本實驗符合山西省人民醫院實驗動物管理條例的相關規定，實驗設計盡可能減少動物使用數量，在實驗研究過程中盡量減少大鼠所承受的痛苦。健康6～8周雄性SD大鼠12只，體重230～250 g，由山西省人民醫院實驗動物中心提供。分為PTZ組6只、PTZ+EPO組6只。該研究獲得山西省人民醫院醫學倫理委員會審核批準。
1.1.2 主要試劑
十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙酮購自國藥公司； Pierce? Protease Inhibitor Mini Tablets，EDTA-free、PageRuler? Prestained Protein Ladder，10 to 180 kDa、TMT6plex? Isobaric Label Reagent Set、Pierce? Quantitative Colorimetric Peptide Assay購自Thermo Fisher公司；尿素Urea、Ammonium bicarbonate 、PVPP聚乙烯吡咯烷酮、硼砂（四硼酸鈉 十水合物 ）、TritonX-100、Bond-Breaker? TCEP Solution（TCEP）、二硫蘇糖醇（DTT）、Trifluoroacetic acid（TFA）購自SIGMA公司；Trypsin酶、TMT10plexTM IsobaricLabel Reagent Set購自Promega公司。
1.1.3 儀器
掌式離心機購自IKA公司，分析天平購自Sartorius公司，酶標儀購自Bio Tek公司，電泳儀購自Bio-Rad，垂直電泳槽、UltiMate3000、臺式快速離心濃縮干燥器購自Thermofisher，手動單道移液器、恒溫混勻儀購自Eppendorf公司。
1.2 方法
1.2.1 致癇模型制備方法
① 給藥：參照文獻方法建立動物模型[10]：SE模型制備采用首劑1%PTZ（40 mg/kg）腹腔注射，注射后觀察大鼠行為學變化，若10 min后無SE典型表現，以原始劑量的半量（20 mg/kg）注射，評估注射后觀察大鼠行為學變化，之后每隔10 min補加小劑量PTZ（10 mg/kg），直至誘導SE模型成功即停止給藥。根據 Racine 癲癇發作標準做行為學評估，模型成功標志為在30 min內≥３次Ⅳ～Ⅴ級發作。大鼠驚厥的行為表現采用Racine六級評價標準：0級：無任何反應；Ⅰ級：面肌抽動，節律性咀嚼動作；Ⅱ級：節律性點頭或濕狗樣抖動(Wet dog shakes，WDS)；Ⅲ級：一側前肢陣攣；Ⅳ級：雙側前肢陣攣伴站立；Ⅴ級：跌倒、全身強直陣攣性發作。Ⅳ、Ⅴ級發作即為全身性驚厥大發作。制模過程中因長時間持續的強直陣攣發作而死亡或不符合模型要求的大鼠，不予納入并隨機補充。
② 動物分組及給藥：將12只體重為230～250 g的6～8周齡SD大鼠隨機分為PTZ組、PTZ+ EPO組兩組，每組6只。PTZ組：腹腔注射PTZ點燃SE發作后5 min腹腔注射生理鹽水[8-9]；PTZ+EPO組：將 r-HuEPO溶于無菌生理鹽水中，采用5000 U/kg體重的劑量，在PTZ致癇大鼠建模成功后5 min腹腔注射于大鼠體內。
1.2.2 取海馬組織
于24 h后將兩組大鼠處死,斷頭取腦,分離海馬組織。在正中線處用剪刀將大鼠頭皮剪開，露出顱骨；用大尖鑷子夾住兩側眼眶，用眼科剪稍剪除顱骨中線；再用眼科鑷夾住顱骨從內向外夾，從下向上逐步去除顱骨；當全腦露岀時，再用眼科鑷從嗅球處向下迅速取出大鼠全腦組織（取腦組織時盡量動作迅速，防止蛋白質降解），立即在 4℃或冰上等低溫條件下進行分離，分離好的海馬組織快速用 PBS清洗組織表面，去除血漬，立即置于高壓消毒過的并已經標記好的凍存管中，將螺口蓋子旋緊，立即入液氮速凍5 min以上，之后可轉移至?80℃冰箱凍存直至蛋白組學實驗，避免反復凍融。以上操作均在冰塊上執行。
1.2.3 蛋白組學
① 海馬蛋白提取：取出樣本，按一定比例加入裂解液（8M尿素+1%SDS）和蛋白酶抑制劑；用vortex渦旋振蕩混勻；高通量組織研磨儀震蕩研磨三次；冰上裂解30 min，期間每10 min震蕩混勻一次；4℃，12 000 g離心20 min，收集上清；測定蛋白濃度。
② 于待裂解樣品中加入裂解液［1% SDS，8 M urea，1x Protease Inhibitor Cocktail（Roche Ltd. Basel，Switzerland）］，震蕩研磨3×400 s，冰上裂解30 min。高速離心15 min（15000 rpm，4℃）后取上清。
③ 蛋白酶解：使用BCA蛋白試劑盒測定上清中的蛋白濃度。隨后從各個樣本中分別取100 μg蛋白轉移至新的EP管中，用8 M urea調至100 μL定容。加入2 μL 0.5 M TCEP于37℃下反應1 h，隨后加入4 μL 1 M碘乙酰胺，室溫下避光反應40 min。然后，按樣品：丙酮（體積比）為1∶5加入?20℃預冷丙酮，并于?20℃下過夜沉淀。隨后高速離心（12000 g，20 min，4℃）棄去上清。加入1 mL ?20℃預冷的90%丙酮溶液，渦旋混勻清洗樣品后，再次高速離心（12 000 g，20 min，4℃）棄上清。清洗步驟重復兩次。室溫干燥至沉淀表面的丙酮完全揮干后，將其重溶于100 μL 100 mM TEAB，按酶：蛋白（質量比）為1∶50加入trypsin（Promega，Madison，WI），37℃過夜酶解。采用C18除鹽柱除鹽后，使用肽段定量試劑盒（Pierce? 23275）測定肽段最終濃度并凍干。
④ TMT標記：肽段混合物采用TMT-6Plex（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）標記定量試劑盒，遵照說明書進行標記。標記肽段樣品混合后凍干。
⑤ 高pH反相分離：肽段混合物重溶于buffer A（buffer A: 20 mM甲酸銨水溶液, 氨水調節至pH 10.0）后用Ultimate 3000系統（Thermo Fisher scientific，MA，USA）連接反向柱（XBridge C18 column，4.6 mm×250 mm，5 μm，（Waters Corporation，MA，USA））進行高pH分離，分離使用線性梯度，40 min 內5% B 至45% B（B: 80% ACN 中加入20 mM 甲酸銨, 氨水調節至pH 10.0）。柱子在初始條件下平衡15 min，柱流速維持在1 mL/min，柱溫維持在30℃。收集到10個餾分。各個餾分在真空濃縮儀中干燥待用。
⑥ nano-HPLC-MS/MS分析：將除鹽凍干后的肽段重溶于solvent A（A：0.1% 甲酸水溶液）后經由配備在線納噴離子源的LC-MS/MS分析。整套系統為串聯EASY-nanoLC 1200的 Q Exactive? HF質譜儀（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）。共上樣1 μL樣品（分析柱：Acclaim PepMap C18，75 μm×25 cm），以60 min的梯度分離樣品，柱流量控制在300 nL/min，柱溫為40°C，電噴霧電壓2 kV，色譜梯度如表1（流動相A相：0.1% 甲酸水溶液；B相：含0.1% 甲酸的ACN溶液）。
表1
色譜梯度
Table1.
Chromatographic gradient
⑦ 數據分析：串聯質譜圖經過PEAKS Studio version X+（Bioinformatics Solutions Inc.，Waterloo，Canada）分析。PEAKS DB對swissprot_mus_musculus蛋白質數據庫（ver 201907，22497 entries）進行搜索，設置trypsin酶解。搜庫參數碎片離子質量容許誤差：0.02 Da，母離子質量容許誤差：7 ppm，最大漏切數：2，固定修飾：Carbamidomethylation 57.02，TMT 6plex（K, N-term）229.16，可變修飾：Acetylation（Protein N-term）42.01，Oxidation（M）15.99。肽段經過1% FDR 和 1 unique peptide質控過濾。篩選差異倍數1倍以上，含有至少條1unique肽段，根據ANOVA算法取P值<0.05的蛋白作為差異蛋白。
2 結 果
經比較分析發現海馬組織中139個差異蛋白質點均出現>1.0 倍的表達差異，上調蛋白55，下調蛋白84，合計139（圖1）。取P<0.05，Unique Peptides≥1，差異倍數為1以上的差異蛋白數量統計。見圖1、2、3、4。經 PEAKS質譜分析鑒定出這 139種蛋白質，取部分蛋白列入表中，詳見表2。
圖1
火山圖 癲癇組和 EPO+PTZ組的圖譜
EPO：EPO+PTZ組；CON：PTZ組；紅點為上調、藍點為下調、灰點為沒有變化
Figure1. Volcano FigureEPO：EPO+PTZ group; CON: PTZ group; In PTZ group, the red dots were up-regulated, the blue dots were down-regulated, and the gray dots were unchanged
圖2
HCA 圖 癲癇組和 EPO+PTZ組的圖譜
EPO：EPO+PTZ組（紅色）；CON：PTZ組（藍色）
Figure2. HCA figureEPO: EPO+PTZ group (red); CON: PTZ group (blue)
表2
重組人促紅細胞生成素對戊四氮致癇大鼠海馬組織差異蛋白質譜結果
Table2.
Effect of recombinant human erythropoietin on differential protein profile in hippocampus of pentatetrazol induced eclampsia rats
圖3
GO 功能分析圖
GO level distribution of the top 20 items with minimum
3 討 論
眾所周知，癲癇發作時，大腦消耗大量的氧氣，容易產生氧化應激。高耗氧量導致活性氧的過度產生，會更加促進神經元的壞死和凋亡[11]。從本研究KEGG通路分析（圖4）中可以看出癲癇發作后早期代謝通路變化最為顯著。
圖4
KEGG 通路分析圖
橫坐標表示該通路中的蛋白占總差異蛋白數量的百分比， 圓圈越大表示該通路上差異蛋白數目越多
Figure4. K EGG Pathway analysis diagramThe horizontal axis represents the percentage of proteins in this pathway to the total number of differential proteins, and the larger the circle is, the more differential proteins in this pathway.
線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，線粒體負責的最終氧化的共同途徑是三羧酸循環與氧化磷酸化。還原型輔酶Ⅱ（Reduced nicotinamide purine dinucleotide phosphate，NADPH）和還原型黃素二核苷酸（Flavine adenine dinucleotide-reduced，FADH2）參與三羧酸循環 [12-14]。
NADP廣泛存在于真核生物各個細胞器中，催化異檸檬酸氧化脫羧成α-酮戊二酸并生成NADH，參與細胞有氧代謝過程中的三羧酸循環 [15]。NADH是線粒體中能量產生鏈中的控制標志物，NADH是細胞線粒體膜呼吸鏈的組成部分。
已有研究報道，癲癇組NADH泛醌氧化還原酶（NADH還原酶）下調，提示癲癇發作時神經元確實存在嚴重的能量代謝紊亂和氧化應激損傷[12-13]。而在本研究EPO+癲癇組的海馬組織中NADP表達上調，NADPH表達上調。推測r-HuEPO在癲癇發作過后通過三羧酸循環和磷酸戊糖途徑可以使NADP、NADPH表達增高，繼之NADH可能也會隨之升高，從而維持神經細胞能量代謝，促進神經元有氧功能恢復，阻止神經元凋亡。
硫氧還蛋白系統（Thioredoxin，Trx）由NADPH、硫氧還蛋白還原酶（Thioredoxin reductase，TrxR）和硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）組成，通過其二硫還原酶活性調節蛋白質二硫醇/二硫平衡，在維持細胞內氧化還原狀態方面起著至關重要的作用，這對每個細胞的正常功能至關重要，是防御氧化應激的關鍵抗氧化系統[16-17]。
Trx系統為依賴硫醇的過氧化物酶提供電子，以快速的反應速率去除活性氧和活性氮。此外，通過與硫氧還蛋白相互作用，Trx系統形成氧化還原依賴的信號通路，對基本的細胞過程，包括代謝、增殖、分化、遷移和凋亡至關重要[18]。
硫氧還蛋白系統與許多不同的蛋白質和不同的代謝和信號通路的相互作用，以及顯著的物種差異，使其成為許多醫學領域有吸引力的治療干預靶點，在生物體內發揮著廣泛的重要的生理功能[19]。如缺血再灌注損傷，Trx的這種延長壽命的特性（相對于細胞而言）可能保護細胞免受損傷[20]。
研究發現在癲癇發作中存在著細胞氧化還原水平的紊亂，產生的氧自由基加速神經元的凋亡，癲癇發作后TrxR活動增強，提示TrxR參與了抑制神經元凋亡的過程[21]。而本研究顯示EPO+PTZ組海馬組織中的TrxR表達上調，推測r-HuEPO在癲癇發作后亦可能通過TrxR/Trx途徑抑制神經元凋亡。
綜上，r-HuEPO在癲癇發作后的早期能通過上調NADP、NADPH，推測r-HuEPO在疾病早期可能通過神經元呼吸鏈減緩神經元凋亡；r-HuEPO在癲癇發作后的早期能上調TrxR，推測重組紅細胞生成素在癲癇發作后可通過某種途徑激活TrxR/Trx系統抑制神經元凋亡，其更深層次機制有待于進一步研究。
利益沖突聲明 所有作者無利益沖突。
癲癇是最常見的嚴重腦部疾病之一，影響全球7 000多萬人。其發病率呈雙峰分布，嬰兒和老年人群的風險最高[1]。癲癇是一種表現為反復癇性發作的慢性腦疾病，神經細胞凋亡是癲癇發作造成神經系統損傷的重要機制。國內有研究發現癲癇發作后1周凋亡的神經細胞達高峰[2]，單次驚厥后亦能引起神經細胞凋亡[3], 并隨著驚厥次數的不斷增加神經細胞凋亡數目也逐漸增多。近來又有研究發現癲癇發作可使線粒體的結構和功能受損，呼吸鏈活性氧產生增加、DNA突變、鈣超載、脂質過氧化及細胞色素C釋放，進而導致神經細胞凋亡[4-5]。而神經細胞的凋亡又增加了癲癇再發的可能性和認知功能的損害[6]。
神經細胞凋亡通路主要包括線粒體通路、死亡受體通路、PARP/AIF通路[7]。神經細胞凋亡是一個可調控的過程，因此通過抑制凋亡的發生，可以減少神經細胞的死亡。隨著分子生物學的不斷進展，研究發現紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）除了其眾所周知的促進紅細胞生成的作用外，EPO還具有抗凋亡的作用[8-9]。
研究運用蛋白質組學技術，通過分析鑒定重組人促紅細胞生成素（Recombinant human erythropoietin，r-HuEPO）對戊四氮（Pentetrazol，PTZ）致癇大鼠海馬組織中差異表達的蛋白質，為尋找新的治療靶點提供有力依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
所有實驗鼠均在標準實驗環境（每日光照黑暗12 h交替，室溫24±2℃，濕度40%～70%，自由飲食進水）恒溫恒濕中飼養。本實驗符合山西省人民醫院實驗動物管理條例的相關規定，實驗設計盡可能減少動物使用數量，在實驗研究過程中盡量減少大鼠所承受的痛苦。健康6～8周雄性SD大鼠12只，體重230～250 g，由山西省人民醫院實驗動物中心提供。分為PTZ組6只、PTZ+EPO組6只。該研究獲得山西省人民醫院醫學倫理委員會審核批準。
1.1.2 主要試劑
十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙酮購自國藥公司； Pierce? Protease Inhibitor Mini Tablets，EDTA-free、PageRuler? Prestained Protein Ladder，10 to 180 kDa、TMT6plex? Isobaric Label Reagent Set、Pierce? Quantitative Colorimetric Peptide Assay購自Thermo Fisher公司；尿素Urea、Ammonium bicarbonate 、PVPP聚乙烯吡咯烷酮、硼砂（四硼酸鈉 十水合物 ）、TritonX-100、Bond-Breaker? TCEP Solution（TCEP）、二硫蘇糖醇（DTT）、Trifluoroacetic acid（TFA）購自SIGMA公司；Trypsin酶、TMT10plexTM IsobaricLabel Reagent Set購自Promega公司。
1.1.3 儀器
掌式離心機購自IKA公司，分析天平購自Sartorius公司，酶標儀購自Bio Tek公司，電泳儀購自Bio-Rad，垂直電泳槽、UltiMate3000、臺式快速離心濃縮干燥器購自Thermofisher，手動單道移液器、恒溫混勻儀購自Eppendorf公司。
1.2 方法
1.2.1 致癇模型制備方法
① 給藥：參照文獻方法建立動物模型[10]：SE模型制備采用首劑1%PTZ（40 mg/kg）腹腔注射，注射后觀察大鼠行為學變化，若10 min后無SE典型表現，以原始劑量的半量（20 mg/kg）注射，評估注射后觀察大鼠行為學變化，之后每隔10 min補加小劑量PTZ（10 mg/kg），直至誘導SE模型成功即停止給藥。根據 Racine 癲癇發作標準做行為學評估，模型成功標志為在30 min內≥３次Ⅳ～Ⅴ級發作。大鼠驚厥的行為表現采用Racine六級評價標準：0級：無任何反應；Ⅰ級：面肌抽動，節律性咀嚼動作；Ⅱ級：節律性點頭或濕狗樣抖動(Wet dog shakes，WDS)；Ⅲ級：一側前肢陣攣；Ⅳ級：雙側前肢陣攣伴站立；Ⅴ級：跌倒、全身強直陣攣性發作。Ⅳ、Ⅴ級發作即為全身性驚厥大發作。制模過程中因長時間持續的強直陣攣發作而死亡或不符合模型要求的大鼠，不予納入并隨機補充。
② 動物分組及給藥：將12只體重為230～250 g的6～8周齡SD大鼠隨機分為PTZ組、PTZ+ EPO組兩組，每組6只。PTZ組：腹腔注射PTZ點燃SE發作后5 min腹腔注射生理鹽水[8-9]；PTZ+EPO組：將 r-HuEPO溶于無菌生理鹽水中，采用5000 U/kg體重的劑量，在PTZ致癇大鼠建模成功后5 min腹腔注射于大鼠體內。
1.2.2 取海馬組織
于24 h后將兩組大鼠處死,斷頭取腦,分離海馬組織。在正中線處用剪刀將大鼠頭皮剪開，露出顱骨；用大尖鑷子夾住兩側眼眶，用眼科剪稍剪除顱骨中線；再用眼科鑷夾住顱骨從內向外夾，從下向上逐步去除顱骨；當全腦露岀時，再用眼科鑷從嗅球處向下迅速取出大鼠全腦組織（取腦組織時盡量動作迅速，防止蛋白質降解），立即在 4℃或冰上等低溫條件下進行分離，分離好的海馬組織快速用 PBS清洗組織表面，去除血漬，立即置于高壓消毒過的并已經標記好的凍存管中，將螺口蓋子旋緊，立即入液氮速凍5 min以上，之后可轉移至?80℃冰箱凍存直至蛋白組學實驗，避免反復凍融。以上操作均在冰塊上執行。
1.2.3 蛋白組學
① 海馬蛋白提取：取出樣本，按一定比例加入裂解液（8M尿素+1%SDS）和蛋白酶抑制劑；用vortex渦旋振蕩混勻；高通量組織研磨儀震蕩研磨三次；冰上裂解30 min，期間每10 min震蕩混勻一次；4℃，12 000 g離心20 min，收集上清；測定蛋白濃度。
② 于待裂解樣品中加入裂解液［1% SDS，8 M urea，1x Protease Inhibitor Cocktail（Roche Ltd. Basel，Switzerland）］，震蕩研磨3×400 s，冰上裂解30 min。高速離心15 min（15000 rpm，4℃）后取上清。
③ 蛋白酶解：使用BCA蛋白試劑盒測定上清中的蛋白濃度。隨后從各個樣本中分別取100 μg蛋白轉移至新的EP管中，用8 M urea調至100 μL定容。加入2 μL 0.5 M TCEP于37℃下反應1 h，隨后加入4 μL 1 M碘乙酰胺，室溫下避光反應40 min。然后，按樣品：丙酮（體積比）為1∶5加入?20℃預冷丙酮，并于?20℃下過夜沉淀。隨后高速離心（12000 g，20 min，4℃）棄去上清。加入1 mL ?20℃預冷的90%丙酮溶液，渦旋混勻清洗樣品后，再次高速離心（12 000 g，20 min，4℃）棄上清。清洗步驟重復兩次。室溫干燥至沉淀表面的丙酮完全揮干后，將其重溶于100 μL 100 mM TEAB，按酶：蛋白（質量比）為1∶50加入trypsin（Promega，Madison，WI），37℃過夜酶解。采用C18除鹽柱除鹽后，使用肽段定量試劑盒（Pierce? 23275）測定肽段最終濃度并凍干。
④ TMT標記：肽段混合物采用TMT-6Plex（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）標記定量試劑盒，遵照說明書進行標記。標記肽段樣品混合后凍干。
⑤ 高pH反相分離：肽段混合物重溶于buffer A（buffer A: 20 mM甲酸銨水溶液, 氨水調節至pH 10.0）后用Ultimate 3000系統（Thermo Fisher scientific，MA，USA）連接反向柱（XBridge C18 column，4.6 mm×250 mm，5 μm，（Waters Corporation，MA，USA））進行高pH分離，分離使用線性梯度，40 min 內5% B 至45% B（B: 80% ACN 中加入20 mM 甲酸銨, 氨水調節至pH 10.0）。柱子在初始條件下平衡15 min，柱流速維持在1 mL/min，柱溫維持在30℃。收集到10個餾分。各個餾分在真空濃縮儀中干燥待用。
⑥ nano-HPLC-MS/MS分析：將除鹽凍干后的肽段重溶于solvent A（A：0.1% 甲酸水溶液）后經由配備在線納噴離子源的LC-MS/MS分析。整套系統為串聯EASY-nanoLC 1200的 Q Exactive? HF質譜儀（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）。共上樣1 μL樣品（分析柱：Acclaim PepMap C18，75 μm×25 cm），以60 min的梯度分離樣品，柱流量控制在300 nL/min，柱溫為40°C，電噴霧電壓2 kV，色譜梯度如表1（流動相A相：0.1% 甲酸水溶液；B相：含0.1% 甲酸的ACN溶液）。
表1
色譜梯度
Table1.
Chromatographic gradient
⑦ 數據分析：串聯質譜圖經過PEAKS Studio version X+（Bioinformatics Solutions Inc.，Waterloo，Canada）分析。PEAKS DB對swissprot_mus_musculus蛋白質數據庫（ver 201907，22497 entries）進行搜索，設置trypsin酶解。搜庫參數碎片離子質量容許誤差：0.02 Da，母離子質量容許誤差：7 ppm，最大漏切數：2，固定修飾：Carbamidomethylation 57.02，TMT 6plex（K, N-term）229.16，可變修飾：Acetylation（Protein N-term）42.01，Oxidation（M）15.99。肽段經過1% FDR 和 1 unique peptide質控過濾。篩選差異倍數1倍以上，含有至少條1unique肽段，根據ANOVA算法取P值<0.05的蛋白作為差異蛋白。
2 結 果
經比較分析發現海馬組織中139個差異蛋白質點均出現>1.0 倍的表達差異，上調蛋白55，下調蛋白84，合計139（圖1）。取P<0.05，Unique Peptides≥1，差異倍數為1以上的差異蛋白數量統計。見圖1、2、3、4。經 PEAKS質譜分析鑒定出這 139種蛋白質，取部分蛋白列入表中，詳見表2。
圖1
火山圖 癲癇組和 EPO+PTZ組的圖譜
EPO：EPO+PTZ組；CON：PTZ組；紅點為上調、藍點為下調、灰點為沒有變化
Figure1. Volcano FigureEPO：EPO+PTZ group; CON: PTZ group; In PTZ group, the red dots were up-regulated, the blue dots were down-regulated, and the gray dots were unchanged
圖2
HCA 圖 癲癇組和 EPO+PTZ組的圖譜
EPO：EPO+PTZ組（紅色）；CON：PTZ組（藍色）
Figure2. HCA figureEPO: EPO+PTZ group (red); CON: PTZ group (blue)
表2
重組人促紅細胞生成素對戊四氮致癇大鼠海馬組織差異蛋白質譜結果
Table2.
Effect of recombinant human erythropoietin on differential protein profile in hippocampus of pentatetrazol induced eclampsia rats
圖3
GO 功能分析圖
GO level distribution of the top 20 items with minimum
3 討 論
眾所周知，癲癇發作時，大腦消耗大量的氧氣，容易產生氧化應激。高耗氧量導致活性氧的過度產生，會更加促進神經元的壞死和凋亡[11]。從本研究KEGG通路分析（圖4）中可以看出癲癇發作后早期代謝通路變化最為顯著。
圖4
KEGG 通路分析圖
橫坐標表示該通路中的蛋白占總差異蛋白數量的百分比， 圓圈越大表示該通路上差異蛋白數目越多
Figure4. K EGG Pathway analysis diagramThe horizontal axis represents the percentage of proteins in this pathway to the total number of differential proteins, and the larger the circle is, the more differential proteins in this pathway.
線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，線粒體負責的最終氧化的共同途徑是三羧酸循環與氧化磷酸化。還原型輔酶Ⅱ（Reduced nicotinamide purine dinucleotide phosphate，NADPH）和還原型黃素二核苷酸（Flavine adenine dinucleotide-reduced，FADH2）參與三羧酸循環 [12-14]。
NADP廣泛存在于真核生物各個細胞器中，催化異檸檬酸氧化脫羧成α-酮戊二酸并生成NADH，參與細胞有氧代謝過程中的三羧酸循環 [15]。NADH是線粒體中能量產生鏈中的控制標志物，NADH是細胞線粒體膜呼吸鏈的組成部分。
已有研究報道，癲癇組NADH泛醌氧化還原酶（NADH還原酶）下調，提示癲癇發作時神經元確實存在嚴重的能量代謝紊亂和氧化應激損傷[12-13]。而在本研究EPO+癲癇組的海馬組織中NADP表達上調，NADPH表達上調。推測r-HuEPO在癲癇發作過后通過三羧酸循環和磷酸戊糖途徑可以使NADP、NADPH表達增高，繼之NADH可能也會隨之升高，從而維持神經細胞能量代謝，促進神經元有氧功能恢復，阻止神經元凋亡。
硫氧還蛋白系統（Thioredoxin，Trx）由NADPH、硫氧還蛋白還原酶（Thioredoxin reductase，TrxR）和硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）組成，通過其二硫還原酶活性調節蛋白質二硫醇/二硫平衡，在維持細胞內氧化還原狀態方面起著至關重要的作用，這對每個細胞的正常功能至關重要，是防御氧化應激的關鍵抗氧化系統[16-17]。
Trx系統為依賴硫醇的過氧化物酶提供電子，以快速的反應速率去除活性氧和活性氮。此外，通過與硫氧還蛋白相互作用，Trx系統形成氧化還原依賴的信號通路，對基本的細胞過程，包括代謝、增殖、分化、遷移和凋亡至關重要[18]。
硫氧還蛋白系統與許多不同的蛋白質和不同的代謝和信號通路的相互作用，以及顯著的物種差異，使其成為許多醫學領域有吸引力的治療干預靶點，在生物體內發揮著廣泛的重要的生理功能[19]。如缺血再灌注損傷，Trx的這種延長壽命的特性（相對于細胞而言）可能保護細胞免受損傷[20]。
研究發現在癲癇發作中存在著細胞氧化還原水平的紊亂，產生的氧自由基加速神經元的凋亡，癲癇發作后TrxR活動增強，提示TrxR參與了抑制神經元凋亡的過程[21]。而本研究顯示EPO+PTZ組海馬組織中的TrxR表達上調，推測r-HuEPO在癲癇發作后亦可能通過TrxR/Trx途徑抑制神經元凋亡。
綜上，r-HuEPO在癲癇發作后的早期能通過上調NADP、NADPH，推測r-HuEPO在疾病早期可能通過神經元呼吸鏈減緩神經元凋亡；r-HuEPO在癲癇發作后的早期能上調TrxR，推測重組紅細胞生成素在癲癇發作后可通過某種途徑激活TrxR/Trx系統抑制神經元凋亡，其更深層次機制有待于進一步研究。
利益沖突聲明 所有作者無利益沖突。
