許多神經系統疾病都會影響晝夜節律。盡管已知癲癇常伴睡眠障礙，但與癲癇晝夜節律紊亂相關的數據卻很少。文章檢驗了 Kcna1 缺失小鼠的晝夜休息活動以及睡眠-覺醒模式。該小鼠模型表現出反復自發癲癇發作，也是研究癲癇猝死的模型。此外，研究試圖確定癲癇發作以及核心時鐘基因和調節因子 Sirtuin 1（Sirt1）的異常變化是否與晝夜節律紊亂有關。研究使用被動紅外活動記錄儀評估休息活動模式，使用腦電圖（EEG）進行癲癇發作和睡眠分析，并且使用逆轉錄聚合酶鏈反應和蛋白質印跡法評估時鐘基因和 Sirt1 在 Kcna1 缺失和野生型小鼠中的表達情況。癲癇 Kcna1 缺失動物模型存在晝夜休息活動模式紊亂，趨于表現出延長的晝夜節律。EEG 分析證實了睡眠結構的破壞，清醒時間更多并且睡眠不足。盡管所有癲癇小鼠都表現出晝夜休息活動模式的紊亂，但該研究發現實際癲癇發作負擔與睡眠紊亂程度之間沒有相關性。發現前下丘腦中幾個時鐘基因（即 Clock，Bmal1，Per1 和 Per2）和晝間 Sirt1 mRNA 的衰減振蕩。幾個核心時鐘基因的振蕩衰減與 Kcna1 缺失小鼠中觀察到的異常晝夜休息活動以及睡眠-覺醒模式改變相關，可能是其基礎原因，并可能導致癲癇晚期并發癥，例如癲癇猝死。Sirt1 可能是恢復生物鐘基因節律和癲癇睡眠模式的潛在治療靶點之一。
引用本文： EliWallace, SamanthaWright, BarrySchoenike, 高慧 譯, 童馨 慕潔 審. 在癲癇猝死模型中晝夜節律改變和時鐘基因及 Sirtuin 1 的振蕩. 癲癇雜志, 2019, 5(3): 209-219. doi: 10.7507/2096-0247.20190038 復制
要點
? 癲癇 Kcna1 缺失小鼠（癲癇猝死小鼠模型）存在晝夜休息活動節律以及睡眠破壞
? Kcna1 缺失小鼠的睡眠結構破壞與癲癇發作頻率無關
? 下丘腦中時鐘基因和 Sirt1 的阻尼振蕩可能是癲癇 Kcna1 缺失小鼠晝夜節律和睡眠紊亂的基礎
? 恢復時鐘基因或 Sirt1 振蕩可能對 Kcna1 缺失小鼠模型具有治療獲益
癲癇是一種影響世界內大約 5 000 萬人口的疾病，并且有約 35% 的患者在有治療的情況下，依然沒有良好的治療效果。難治性癲癇逐漸改變腦功能，導致并發癥，甚至包括死亡。癲癇猝死（Sudden unexpected deeth in epilepsy, SUDEP）是癲癇相關死亡的首要原因，但其機制仍不清楚。
我們和其他研究者均已證明，癲癇 Kcna1 缺失小鼠，一種 SUDEP 模型，具有癲癇發作的晝夜節律模式和異常的休息-活動節律，并且存在逐漸增加的癲癇發作負擔和死亡前休息缺陷。盡管癲癇患者的睡眠相關問題顯著，但癲癇發作對睡眠的影響尚未在人群中得到充分定義。癲癇發作與睡眠調節之間的相互作用可能構成一種機制，該機制可促使癲癇并發癥的發生并可能導致 SUDEP。了解晝夜節律和睡眠破壞的機制可能有助于為未來的治療提供信息。
睡眠是具有晝夜節律的許多生理過程之一，由視交叉上核（Supra chiasmatic nucleus, SCN）中的核心起搏器調節。SCN 的活性受光的強烈影響，但也受情緒和代謝狀態的影響。SCN 的核心功能是“時鐘”蛋白的轉錄-翻譯自動調節反饋環，即 BMAL1、CLOCK、PER1-3 和 CRY1/2。CLOCK: BMAL1 異二聚體與 Per 和 Cry 的 E-box 啟動子位點結合，促進轉錄。一旦蛋白翻譯，PER 和 CRY 磷酸化，隨后 CLOCK: BMAL 復合物得到抑制。許多基因在 SCN 中顯示出晝夜節律振蕩; 這種時鐘控制的基因影響許多細胞功能，包括通過幾種膜結合離子通道差異表達控制的興奮性。在癲癇的情況下，癲癇發作可能會驅動 SCN 的信號輸入，可能導致異常同化和神經元過度興奮。
從機制上看，CLOCK 介導的時間控制基因的翻譯活化是通過組蛋白及其結合配體 BMAL1 的乙酰化實現轉錄和確保 CLOCK: BMAL1 異二聚體在其啟動子位點上的穩定性。BMAL1 的乙酰化可以通過 Sirtuin 1（Sirt1）反向調節，它是一種以晝夜節律表達的煙酰胺依賴性脫乙酰酶，目前已知其缺失與行為節律異常有關。BMAL1 的乙酰化狀態已被證明在 CRY 介導的 CLOCK: BMAL1 轉錄因子抑制中和晝夜節律行為的正常同化中具有重要作用。一些研究表明，這些核心基因的突變或缺失會影響晝夜節律，暗示它們在晝夜節律產生中的關鍵作用。
與先前的文獻一致，我們證明了癲癇 Kcna1 缺失小鼠的晝夜休息活動和睡眠模式都發生了改變。我們提出的新證據表明單一的癲癇發作負擔因素與睡眠破壞的程度無關; 然而，在白日和恒定的黑暗條件下，幾個核心時鐘基因轉錄水平的振蕩衰減。我們假設時鐘控制基因轉錄的調節干擾可能導致 Kcna1 缺失小鼠的節律破壞。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
所有流程均通過威斯康星大學醫學與公共衛生學院的機構動物護理和使用委員會批準。該頭動物在威斯康星大學的動物房飼養。缺少一個編碼電壓門控鉀通道 1.1 亞型（Kv1.1）等位基因的雜合小鼠（C3HeB.129S7-Kcna1tm1 Tem/J; Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA）被用于產生本研究用到的所有小鼠基因型。純合子敲除（KO）小鼠（Kcna1 缺失動物）在出生后第二周出現自發性癲癇發作。
1.2 照明條件
動物飼養于晝夜［12 h-12 h，光照-黑暗（LD）］或恒定黑暗（DD）條件下。在熄燈期間，使用低強度紅色照明進行所有必要的處理程序和飼養。
1.3 活動記錄儀
在通風良好的圓柱形樹脂玻璃籠（直徑 6 英寸，高 12 英寸）中將小鼠單獨飼養在 LD 或 DD 的光照條件下。懸浮在小鼠上方的紅外運動傳感器記錄了其大體運動。我們將個體的運動以 1 min 為單位，在時間上連續進行分析。作為夜行性動物，LD 條件下的小鼠在黑暗期間最活躍。當移除外部光線提示時，運動活動恢復為由內部起搏器驅動的自由運行表型。由于小鼠的晝夜節律短于 24 h，DD 條件下的活躍期在后續 1 d 提前發生，表現為時相超前。
1.4 腦電圖電極植入，癲癇發作記錄和睡眠-覺醒周期分析
如前所述，對于所有研究動物，在出生后第（P）34～36 d 進行腦電圖（EEG）電極植入。簡言之，用異氟烷麻醉小鼠（使用 5% 誘導，1%～2% 維持）。確認麻醉程度后，做一切口暴露顱骨并植入 2 枚不銹鋼螺釘電極進行 EEG 記錄（前囟+1.5 mm 和右 1 mm，前囟-3 mm 和左 1 mm，中線人字縫尖-1 mm）并且在頸部肌肉中植入 2 個不銹鋼編織線用于肌電圖（EMG）記錄。在 72 h 恢復后，將小鼠轉移到單獨的 EEG 采集室中并允許> 12 h 的適應期。在 D 或 DD 下使用兩個 5 d 的時間段獲得 EEG 和 EMG 信號；分析時，將 1 d 排除在分析之外，當日用于在光照條件之間轉換動物，確保動物能夠獲取食物和水。研究中使用 Xltek 放大器（Natus Medical Incorporated，Pleasanton，CA，USA）以 1 024Hz 采樣將記錄數字化。
癲癇發作由兩名獨立評估者根據視頻腦電記錄進行鑒定。對于睡眠分期，我們處理了帶通（EEG 為 1～70 Hz，EMG 為 3～500 Hz）和陷波（60 Hz）濾波器的記錄，并將其導入 Sirenia Sleep Pro 分析軟件（Pinnacle Technology，Lawrence，KS，美國）。在 4 s 內手動評分警覺狀態。將清醒狀態識別為具有高 EMG 振幅的時期（參見原文鏈接圖 S1A），將具有相對靜止的 EMG 作為睡眠時期。為了進一步區分睡眠時期，使用主要的 EEG 頻率來評估非快速眼動睡眠（NREM）和快速眼動睡眠（REM），如高 delta（1～4 Hz，參見原文鏈接圖 S1B）和高 θ（5～7 Hz，參見原文鏈接圖 S1C）活動。
1.5 實時聚合酶鏈式反應和蛋白質印跡法
在光照停止的任何時間均使用昏暗紅光，在 Zeitgeber 時間（ZT）0、6、12 和 18（n=4～6）獲取野生型（WT）和 Kcna1 缺失小鼠（P30±1 或 P45±3）的組織。收獲的小鼠包括在組織采集之前處于恒定黑暗中并保持 8d 的 DD 群組。將緊鄰 SCN 周圍的前下丘腦區域（～2 mm3）快速分離，沿中線一分為二，并在液氮中快速冷凍。將所有樣品儲存在?80℃ 直至它們同時能進行處理。
使用 TRI 試劑（Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA）分離出總 mRNA，并對樣品進行標準化濃度分析。使用 Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）的隨機六聚體引物將線性 RNA 合成 cDNA。然后用 SYBR Green 試劑進行實時聚合酶鏈反應，并按照熱觸發溫度循環方式進行靶基因 cDNA 擴增子的擴增，開始于 95℃ 2 min，然后進行 40 個擴增循環（95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，76℃ 6 s 成像）。通過熔解曲線分析（60～95°C，0.5°C 逐步）確認了引物的特異性。引物序列如下：Bmal1，正向，5'-CCCTAGGCCTTCATTGCACC-3'；反向，5'-CATAT TCTAACTGGTAGTCAGTGG-3'；Clock，正向，5'-AA GATTCTGGGTCTGACAAT-3'；反向，5'-TTGCAGCTT GAGACATCGCT-3'；mPer1，正向，5'-GAAAGAAAC CTCTGGCTGTTCCT-3'；反向，5'-GCTGACGACGGAT CTTTCTTG-3'；mPer2，正向，5'-GCATATTCTAAC TGGTAGTCAGTGG-3'；反向，5'-GTCTGAAGGCATC-ATCAGG-3'；Sirt1，正向，5'-TCTGTCTCCTGTGGGA-TTCCT-3'；反向，5'-GATGCTGTTCGAAAGGAA-3'，和 Gapdh，正向，5'-GACCTCAACTACATGGTCT ACA-3'；反向，5'-ACTCCACGACATACTCAGCAC-3'。
用 2ΔCT方法分析了轉錄水平，并對管家基因 Gapdh 進行了標準化。
使用含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀測定緩沖液分離了所有蛋白。分離后，進行蛋白印跡，在 4%～15% 梯度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中分離蛋白質樣品，并將它們轉移到聚偏二氟乙烯膜上。使用 5% 脫脂乳-Tris 緩沖鹽與 Tween 溶液在室溫下封閉膜 1 h。然后在 4℃ 下將膜結合蛋白與在上述脫脂乳-Tris 緩沖鹽與 Tween 中稀釋的一級抗體雜交過夜: SIRT1（1∶1 000；Milli-pore，Billerica，MA，USA），PER1 和 CLOCK（分別為 1∶1 000 和 1∶100；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），BMAL1（1∶1 000；Abcam，Cambridge，MA，USA），PER2（1∶1 000；Millipore）和 β-肌動蛋白（1∶10 000；MP Biomedicals，Irvine，CA，USA）。然后用化學發光成像（UVP ChemiDoc-it）和 SuperSignal West Femto ECL 試劑（Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA）將膜與含有過氧化氫酶（1∶10 000，Santa Cruz Biotechnology）的適當二級抗體孵育 1 h。在所有印跡實驗中添加兩份對照。通過相對于 β-肌動蛋白的信號對目標樣品的信號強度進行標化，然后將所有印跡中相對于對照的中值蛋白質：β-肌動蛋白比率進行量化靶蛋白質表達。
1.6 數據分析
利用個性化 MATLAB（Prism；GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）和 VisionWorks LS 成像軟件（UVP，Upland，CA，USA）分析數據。使用 χ2 周期圖分析計算晝夜周期長度。為了測試在每個警醒狀態下花費的周期長度和時間差異，使用多次 t 檢驗和 Holm-Sidak 校正來進行多種比較。使用雙樣本 Kolmogorov-Smirnov（2K-S）檢驗統計量來評估癲癇和野生型（WT）動物之間根據不同警醒狀態（清醒，NREM 和 REM）和照明條件的區段長度的累積分布函數的因子差異。在晝夜節律振蕩和獨立時間點使用 Sidak 校正的雙向方差分析（ANOVA）進行多重比較，以分析 Kcna1 缺失和 WT 小鼠之間蛋白質和 mRNA 水平表達的差異統計學顯著性。對于所有統計分析，將顯著性閾值設置為 P=0.05。
2 結果
2.1 晝夜休息活動模式破壞
在 LD 中的 WT 小鼠對照中，運動活動模式在黑暗時期升高，在光照期間降低，與先前報道致。當 WT 小鼠放置在 DD 中時，運動活動的時機轉變為自身晝夜節律控制，表現為每日活躍期的開始時間提前，如前所述（圖 1a，左）。然而，在 Kcna1 缺失小鼠中，LD 和 DD 的休息活動模式基本上是失常的（圖 1a，右）。在我們的隊列中，使用 χ2 周期圖，我們發現癲癇小鼠的晝夜節律期更長，不僅在 LD（KO，29.38±1.74，n=9 vs. WT，23.71±0.13，n=6，P< 0.05，Sidak t 檢驗），在 DD 條件下也展現出同樣特點（KO，27.260 0±1.162 7，n=9 vs. WT，23.680 0±0.150 0，n=20，P<0.01，Sidak t 檢驗）；（圖 1b），證明行為的同化和晝夜控制是在 Kcna1 缺失小鼠中被顯著破壞。
圖1
雙曲線活動圖
a. 在晝夜（12-12，明暗）和恒定的黑暗照明條件下
2.2 在 Kcna1 缺失小鼠中改變警戒模式和睡眠結構
因為活動記錄儀僅能提供對睡眠模式的間接測量，因此我們采用了視頻腦電圖（VEEG）分析 Kcna1 缺失小鼠和 WT 小鼠對照的睡眠情況。與活動記錄儀結果一致，我們發現 Kcna1 缺失小鼠在 LD 和 DD 中比 WT 同窩小鼠清醒的時間明顯更多［圖 2a，WT，（53.24±0.73）%，n=28 d，5 只小鼠 vs. KO，（66.53±1.54）%，n=50 d，7 只小鼠，P<0.000 1，Sidak t 檢驗；圖 2b，WT，（50.47±0.97）%，n=29 d，6 只小鼠 vs. KO，（70.000±1.258）%，n=35 d，7 只小鼠，P<0.000 1，Sidak t 檢驗］。如代表性動物的每日值所示（圖 2c、d），清醒時間增加在記錄的幾天內是一致的。這種睡眠不平衡主要是由于 NREM 睡眠期時間減少，與光照條件無關［圖 2a，LD：WT，（40.57±0.69）% vs. KO，（29.68±1.51）%，P<0.000 1，Sidak；圖 2b，DD：WT，（43.64±0.92）% vs. KO，（26.84±1.18）%，P<0.000 1，Sidak］。LD 中癲癇動物的 REM 時間也顯著減少［圖 2a，WT，（6.18±0.26）% vs. KO，（3.794 0±0.198 3）%，P<0.000 1，Sidak）和 DD圖 2b，WT，（5.89±0.27）% vs. KO，（3.153 0±0.149 6）%，P<0.05，Sidak］。通過根據基因型，警醒狀態和光照條件編譯區段長度評估睡眠結構時，發現除了晝夜 REM 之外的所有其他類別都具有顯著改變。值得注意的是，最大區段長度（在圖 2e-j 中的累積分布函數圖上方的三角形表示）在不同條件之內是可比較的，這表明差異主要在具有小于最大持續時間的區段中。如圖 2e 和 2f 所示，在兩種條件下突變動物的清醒區段長度是右移的，表明更長區段的可能性更大（P <0.000 1，2K-S 測試）。LD 和 DD 的 NREM 區段長度的分布分別如圖 2g 和 2h 所示。盡管在 DD 中，Kcna1 缺失小鼠的區段長度分布相比 WT 對照呈現左側移位（P<0.000 1， 2K-S 檢驗），但它們在 LD 條件下右移，這表明盡管 NREM 的總體時間減少，仍通常有較長的區段長度（P<0.000 1，2K-S 測試）。然而，考慮到總百分比（圖 2a），在 LD 條件下，NREM 很可能在 Kcna1 缺失小鼠中出現于較少但較長的區段。最后，與 LD 條件下的 WT 同窩小鼠相比，Kcna1 缺失小鼠的 REM 區段分布沒有改變（圖 2i，P=0.91，2K-S 測試），但在 DD 中該分布受影響（圖 2j，P<0.000 1，2K- S 測試）。
圖2
基于腦電圖的睡眠評分
a. 癲癇
2.3 癲癇發作頻率與睡眠-覺醒模式的相關性
我們之前曾報道，Kcna1 缺失小鼠在 10 d 內可有多達 78 次癲癇發作，發作表現為 4 種不同的電生理和行為差異的癲癇發作類型之一。鑒于異常的晝夜休息活動模式和睡眠結構，我們首先嘗試將每日癲癇發作計數與若干睡眠指標相關聯來確定癲癇發作負擔影響睡眠結構的程度，包括每個警醒狀態下的區段平均長度和數目。如圖 3 所示，我們發現癲癇小鼠的清醒區段數目隨著每天癲癇發作總數略有增加，但相關性無統計學意義（R2=0.045，P=0.14）。同樣，我們發現癲癇發作與其他警醒狀態之間也沒有關系（數據未顯示）。雖然我們一直觀察到延長的發作后清醒時期，但這一分析表明僅癲癇發作頻率不足以解釋 Kcna1 缺失小鼠嚴重受損的運動和警醒模式。
圖3
每日癲癇發作計數與清醒區段次數的線性回歸分析
回歸分析未顯示顯著相關性（
2.4 時鐘基因的異常振蕩
隨后，我們研究了睡眠調節的其他機制，特別是時鐘基因的表達是否存在改變。為此，我們研究了 Kcna1 敲除和 WT 小鼠中的 Clock、Bmal1、Per1 和 Per2 的 mRNA 水平（n= 3-4 /時間點/基因型/光照條件）。在 LD 中，我們發現除了 Bmal1 之外的所有基因都具有顯著的振蕩，表現為時間的主要效應（圖 4c，Clock，F3，17=4.863，P<0.05；圖 4e，Per1，F3， 16=66.28，P<0.000 1；圖 4g，Per2，F3， 17=9.592，P<0.001，雙向 ANOVA）。此外，我們發現基因型對 Clock 在 LD 下表達的主要影響（圖 4c，F1，17 = 24.25，P =0.0001，雙向 ANOVA），Per1（圖 4 e，F1，16= 20.90，P<0.001，雙向 ANOVA）和 Per2（圖 4g，F1， 17=7.957，P <0.05，雙向 ANOVA），與 WT 對照小鼠相比，在 Kcna1 缺失小鼠中轉錄減少。對各個時間點的評估顯示，在 LD 條件下，突變小鼠相比 WT，Clock 的表達水平在 ZT 0 和 6 降低（圖 4c，P<0.001，Sidak 多重比較，Per1 在 ZT 6 降低（圖 4e，P<0.001，Sidak 多重比較）。有趣的是，這些時間點通常與日常表達的峰值相對應，突出表明癲癇小鼠的轉錄驅動減少。在 DD 中，轉錄振蕩持續存在于 Per1（圖 4f，F3，21=35.42，P<0.000 1，雙向 ANOVA）和 Per2（圖 4h，F3，21=9.014，P<0.001，雙向 ANOVA）。我們還發現，在 DD 中 Kcna1 缺失小鼠僅 Per1（圖 4f，F1，21=5.159，P<0.05，雙向 ANOVA）是因基因型主要影響而導致轉錄減少。
圖4
在癲癇 Kcna1 缺失（紅色方塊）和野生型（WT;藍色圓圈）小鼠的視交叉上核中測量 4 個時鐘基因（Bmal1，Clock，Per1 和 Per2）和 Sirt1 相對于 Gapdh 的轉錄水平
分別在晝夜（a，c，e，g，i）和恒定條件（b，d，f，h，j）的 4 個時間點（ZT 0, 6, 12 和 18）。圖表包括每個圖右側的 ZT 0 重復值。使用 Sidak 校正的多重比較雙向方差分析顯示時間對晝夜條件下
鑒于我們的 Kcna1 缺失小鼠模型中存在幾個時鐘基因的轉錄譜的變化，我們隨后檢查了相關蛋白質水平是否也被破壞（n=5-8/基因型/時間點/光照條件）。我們發現在 LD（圖 5 g，F3，40=3.79，P<0.05，雙向 ANOVA）和 DD（圖 5h，F3，32=3.856，P<0.05，雙向 ANOVA）中均存在 PER2 的顯著振蕩。發現基因型僅對 DD 中飼養小鼠的 PER2 表達中具有主要作用（圖 5h，F1，32 =4.761，P<0.05，雙因素方差分析）。代表性的蛋白印跡結果顯示在圖 5k 中。
圖5
晝夜（a，c，e，g，i）和恒定（b，d，f，h，j）條件下，在 4 個時間點（ZT 0, 6, 12 和 18），測量 Kcna1 缺失（紅色方塊）和野生型（WT;藍色圓圈）小鼠的視交叉上核中 4 個時鐘基因（BMAL1，CLOCK，PER1 和 PER2）和 SIRT1 的蛋白質表達模式 K，每種時鐘基因蛋白，β-肌動蛋白的代表性蛋白印跡，每個泳道上方標記 ZT 和基因型（+，WT；?，Kcna1-缺失）。用 Sidak 校正的多重比較進行雙向方差分析，顯示時間對晝夜狀態下的 PER1 和 PER2 和恒定條件下的 PER2 的主要效應，用 T 表示。其中，我們看到基因型在 PER2 中的主要影響（h 在恒定條件下，用 G 表示。照明條件用水平條表示（填充=關燈，未填充=開燈，n=5-8/基因型/時間點/照明條件）。N.S. 不顯著
總之，我們發現大多數基因型效應作用于轉錄水平，PER2 是癲癇小鼠中唯一測試存在改變的蛋白質。總體而言，與年齡匹配的 WT 同窩小鼠相比，癲癇 Kcna1 缺失小鼠顯示出振蕩幅度降低，并且 LD 情況下的 Clock、Per1 和 Per2 以及 DD 情況下的 Per1 和 PER2 平均表達降低。
2.5 Kcna1 缺失小鼠中的 Sirt1 表達模式
考慮到 Kcna1 缺失小鼠中幾個時鐘基因的轉錄受到抑制，并且由于 Sirt1 與衰老中的時鐘成分調節有關，我們試圖使用來自上述實驗的樣本確定癲癇 Kcna1 缺失小鼠中 Sirt1 表達是否發生改變。在 LD 動物中，我們發現基因型和時間在轉錄水平上存在主要影響（圖 4i，F1，16=21.19 和 F3，16=14.19，P<0.001，雙向 ANOVA）。并且，Kcna1 缺失小鼠中 Sirt1 mRNA 的表達水平低于 WT 小鼠，特別是在 LD 中的 ZT 6（P<0.05，Sidak）。但是，我們比較 LD 或 DD 條件下的差異，但未發現 SIRT1 蛋白表達水平存在任何顯著差異（圖 5i 和 5j）。
2.6 在年輕的 Kcna1 缺失小鼠中，Clock 基因和 Sirt1 表達不受影響
作為確保僅 Kv1.1 通道缺失對時鐘基因表達改變不起作用的重要對照，我們評估了 P30 的基因轉錄模式，P30 是不常見癲癇發作的年齡。我們發現基因型在這個較年輕的時候對任何時鐘基因或 Sirt1 的表達沒有顯著影響（圖 6a 和 6b，雙向 ANOVA，P>0.05，n=3-4 /時間點/基因型），雖然單時間點分析確實顯示癲癇動物的 Per2 水平比 WT 同窩小鼠增加（P<0.05，Sidak）。這些發現表明單獨的基因型不會影響晝夜節律維持，這與之前的研究結果一致，即此時 Kcna1 缺失小鼠的休息活動模式與 WT 對照小鼠相比沒有差異。
圖6
基因型對 4 個時鐘基因（Bmal1，Clock，Per1 和 Per2）和 Sirt1 相對于 Gapdh 的轉錄水平的影響是在晝夜條件下的 4 個時間點（ZT 0, 6, 12 和 18），年輕（P 30 d）Kcna1 缺失（紅色方塊）和野生型（WT；藍色圓圈）的視交叉上核中測量的
圖形包括每個圖右側的 ZT 0 的重復值。Sidak 校正的重復比較雙向方差分析顯示時間對
3 討論
本研究中有幾個關鍵的觀察結果。首先，我們發現癲癇 Kcna1 缺失小鼠與 WT 對照小鼠相比，無論光照條件如何，均具有改變的運動休息活動模式和延長的晝夜周期。EEG 睡眠-覺醒分析還表明，癲癇小鼠睡眠消耗的時間明顯減少，還有睡眠結構改變，如區段長度分布的差異所示。我們發現幾種時鐘基因（Clock、Per1 和 Per2）以及調節因子 Sirt1 的轉錄物表達振蕩在癲癇小鼠中減弱，特別是在晝夜條件下。每日癲癇發作負擔與睡眠參數之間缺乏任何直接關聯，這表明其他機制，如時鐘控制基因的振蕩抑制，可能是這種模型中晝夜節律和睡眠破壞的機制。
已知睡眠模式和晝夜節律在諸如帕金森病和阿爾茨海默病等許多神經系統疾病中均受到干擾。在患有癲癇的患者中，已報道晝夜節律與癲癇發作之間存在關聯。例如，額葉癲癇發作傾向于更多地出現于睡眠中，而顳葉癲癇在慢波睡眠期間海馬出現癇樣棘波的概率最高。在動物模型中，癲癇發作點燃的易感性在每日晚些時候達到峰值，而點燃后癲癇發作主要見于夜晚，海人酸處理后模型則在非活動期。我們以前發現 Kcna1 缺失小鼠模型的癲癇發作在 ZT 7 附近有周期性峰值，這種模式在光照和自由運行條件下均存在。臨床上，據報道，癲癇發作通常具有與晝夜節律相關的發生模式，并且因癲癇發作和癲癇類型而存在區別。此外，癲癇患者表現出晝夜節律破壞和睡眠持續時間縮短。在癲癇動物模型中，已經證明幾種晝夜節律性的生物學過程被破壞。我們的觀察結果與之前的報道一致。晝夜休息-活動節律的破壞程度接近行為完全失常，并且，與 WT 對照小鼠相比，癲癇小鼠的平均晝夜節律期延長，且與光照條件無關。此外，睡眠結構分析顯示癲癇小鼠近似睡眠時間減少和區段長度分布改變。晝夜休息活動模式和睡眠破壞的潛在原因之一是癲癇發作本身。然而，我們的研究發現癲癇發作負擔與睡眠破壞程度之間沒有顯著相關性，另一個潛在機制是時鐘基因表達的晝夜節律性改變。
在正常情況下，BMAL1，Per1/2 表達在 SCN 中振蕩，而 CLOCK 通常在亮/暗周期中表達一致。晝夜休息活動節律異常，和 SCN 中時鐘基因振蕩衰減包括 Clock、Per1 和 Per2，已在衰老和神經退行性疾病中報道。時鐘基因調節也在急性睡眠剝奪時改變，以 BMAL1 E-box 占據率改變和幾種時鐘基因 mRNA 的相對豐度變化為證據，雖然持續睡眠擾動（如癲癇發作）對時鐘基因表達的影響仍不清楚。鑒于我們發現 Kcna1 缺失小鼠中多個時鐘基因的振蕩抑制，特別是在 LD 之下，以及先前證據表明的時鐘基因表達幅度與晝夜節律的強度正相關，我們認為模型中的晝夜節律的改變是擾動翻譯調節的結果。有趣的是，癲癇發作對時鐘基因的影響主要限于 mRNA。盡管在該模型中蛋白質水平似乎基本上不受影響，但翻譯后修飾或細胞定位模式可能是轉錄水平變化的原因。與 Sirt1 的情況一樣，我們可能會看到對轉錄影響在核心時鐘基因基礎上延伸到許多其他“時鐘控制基因”，這將對其他細胞過程產生影響。晝夜 CLOCK: BMAL1 介導的轉錄穩定可能是使行為節律和睡眠模式正常化的關鍵。
生物鐘的調節劑從飲食習慣的輕度暴露到細胞代謝不等。雖然后者通過多種途徑（即 ROR/REVERB，AMPK 和 mTORC1）影響時鐘基因調控，但已顯示 SIRT1 通過與 CLOCK: BMAL1 轉錄因子和 PER2 的相互作用影響生物鐘基因機制。基于飲食療法減輕代謝壓力已經存在了數千年。用于頑固性癲癇治療的生酮飲食（KD）和熱量限制均已顯示出大腦中 Sirt1 表達的上調。增強 SIRT1 功能進一步證明其在 SIRT1 降低條件下恢復晝夜節律的作用，比如衰老。先前的研究表明 KD 可以挽救 Kcna1 缺失小鼠晝夜休息活動模式的抑制，盡管尚未直接研究 SIRT1 的作用。SIRT1 活性增強可能構成 KD 治療效果的一部分，通過幫助恢復正常的晝夜節律來輔助其抗癲癇作用。此外，由于 Kcna1 缺失小鼠在死亡之前的休息-活動模式表現出進行性破壞，我們觀察到的睡眠和晝夜節律破壞可能構成睡眠受損的早期表型，其可能伴隨癲癇發作負擔而惡化，潛在導致疾病進展和死亡。盡管晝夜 Sirt1 mRNA 中的顯著變化并未延伸到蛋白質水平，但我們在 mRNA 水平上看到的變化可能是生物鐘減少轉錄激活的更廣泛結果，正如在衰老中看到的那樣。考慮到增強 SIRT1 活性恢復衰老中晝夜節律的治療功效，其中時鐘基因表達和晝夜節律弱，SIRT1 調節可能是緩解 Kcna1 缺失小鼠模型中進行性睡眠破壞的有效工具。在癲癇患者中，睡眠破壞觸發癲癇發作的效力加上癲癇發作破壞睡眠模式的證據支持了這些相互作用促成疾病進展的觀點。通過調節時鐘控制的基因振蕩來恢復休息-活動節律和睡眠可以預防 Kcna1 缺失小鼠模型中的疾病進展和癲癇相關死亡率（如 SUDEP）。未來的設計需研究直接解決這個問題。
該研究存在一些局限性。首先是全面刪除 Kcna1，它對整流電流外機制（即 SCN 電生理功能）的影響仍不清楚，也尚未經過測試。這種限制并沒有否定這種模型的作用，特別是考慮到基因突變或自身免疫消除這些通道表達的一些綜合征往往會導致抽搐。需要進一步研究使用不受基因突變混淆的模型來澄清這種局限性，雖然我們對 mRNA 表達水平的評估加上我們的合作者在幼年（<P30）Kv1.1 KO 動物的休息活動水平上報告的證據表明 Kcna1 缺失小鼠的睡眠擾動表型僅出現于自發性癲癇發作后。技術性并發癥使我們無法同時進行活動記錄-腦電數據采集，這阻止我們將活動計數與基于 EEG 的癲癇發作頻率或睡眠指標聯系起來。我們有多個人在睡眠階段進行評分，這增加了區段分析的差異。然而，我們認為多個評分者的影響微乎其微，考慮到為評估標準的實施做出了巨大努力，得分者在兩種基因類型和條件記錄上可達>90%的相似性。最后，我們還沒有證明時鐘基因的異常振蕩與行為模式破壞之間存在因果關系。有針對性的睡眠（如使用助眠劑）可能會恢復時鐘基因振蕩，我們還未研究。未來的實驗將進一步評估癲癇發作與 SCN 功能之間關系的相互關系，以及確定調節 SIRT1 活性的治療效果。這些實驗將密切評估其他已知時鐘控制基因的變化，解析蛋白質修飾和運輸，并通過 SIRT1 研究 CLOCK：BMAL 驅動的調節效率。
致謝 該研究部分得到了亞利桑那生物醫學研究委員會（R.K.M.和 J.M.R.）的資助。感謝 Creighton 大學的 Fenoglio-Simeone 實驗室提供多種 Kcna1 缺失小鼠雜合子育種配對。
利益沖突 J.M.R.曾擔任過 Xenon Pharmaceuticals，Ajinomoto USA，Accera Pharma 和 Danone Nutriia 的顧問。R.K.M.曾擔任格林威治生物科學的顧問。我們確認已閱讀本雜志關于出版道德問題的立場，并確認本文符合這些要求。
要點
? 癲癇 Kcna1 缺失小鼠（癲癇猝死小鼠模型）存在晝夜休息活動節律以及睡眠破壞
? Kcna1 缺失小鼠的睡眠結構破壞與癲癇發作頻率無關
? 下丘腦中時鐘基因和 Sirt1 的阻尼振蕩可能是癲癇 Kcna1 缺失小鼠晝夜節律和睡眠紊亂的基礎
? 恢復時鐘基因或 Sirt1 振蕩可能對 Kcna1 缺失小鼠模型具有治療獲益
癲癇是一種影響世界內大約 5 000 萬人口的疾病，并且有約 35% 的患者在有治療的情況下，依然沒有良好的治療效果。難治性癲癇逐漸改變腦功能，導致并發癥，甚至包括死亡。癲癇猝死（Sudden unexpected deeth in epilepsy, SUDEP）是癲癇相關死亡的首要原因，但其機制仍不清楚。
我們和其他研究者均已證明，癲癇 Kcna1 缺失小鼠，一種 SUDEP 模型，具有癲癇發作的晝夜節律模式和異常的休息-活動節律，并且存在逐漸增加的癲癇發作負擔和死亡前休息缺陷。盡管癲癇患者的睡眠相關問題顯著，但癲癇發作對睡眠的影響尚未在人群中得到充分定義。癲癇發作與睡眠調節之間的相互作用可能構成一種機制，該機制可促使癲癇并發癥的發生并可能導致 SUDEP。了解晝夜節律和睡眠破壞的機制可能有助于為未來的治療提供信息。
睡眠是具有晝夜節律的許多生理過程之一，由視交叉上核（Supra chiasmatic nucleus, SCN）中的核心起搏器調節。SCN 的活性受光的強烈影響，但也受情緒和代謝狀態的影響。SCN 的核心功能是“時鐘”蛋白的轉錄-翻譯自動調節反饋環，即 BMAL1、CLOCK、PER1-3 和 CRY1/2。CLOCK: BMAL1 異二聚體與 Per 和 Cry 的 E-box 啟動子位點結合，促進轉錄。一旦蛋白翻譯，PER 和 CRY 磷酸化，隨后 CLOCK: BMAL 復合物得到抑制。許多基因在 SCN 中顯示出晝夜節律振蕩; 這種時鐘控制的基因影響許多細胞功能，包括通過幾種膜結合離子通道差異表達控制的興奮性。在癲癇的情況下，癲癇發作可能會驅動 SCN 的信號輸入，可能導致異常同化和神經元過度興奮。
從機制上看，CLOCK 介導的時間控制基因的翻譯活化是通過組蛋白及其結合配體 BMAL1 的乙酰化實現轉錄和確保 CLOCK: BMAL1 異二聚體在其啟動子位點上的穩定性。BMAL1 的乙酰化可以通過 Sirtuin 1（Sirt1）反向調節，它是一種以晝夜節律表達的煙酰胺依賴性脫乙酰酶，目前已知其缺失與行為節律異常有關。BMAL1 的乙酰化狀態已被證明在 CRY 介導的 CLOCK: BMAL1 轉錄因子抑制中和晝夜節律行為的正常同化中具有重要作用。一些研究表明，這些核心基因的突變或缺失會影響晝夜節律，暗示它們在晝夜節律產生中的關鍵作用。
與先前的文獻一致，我們證明了癲癇 Kcna1 缺失小鼠的晝夜休息活動和睡眠模式都發生了改變。我們提出的新證據表明單一的癲癇發作負擔因素與睡眠破壞的程度無關; 然而，在白日和恒定的黑暗條件下，幾個核心時鐘基因轉錄水平的振蕩衰減。我們假設時鐘控制基因轉錄的調節干擾可能導致 Kcna1 缺失小鼠的節律破壞。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
所有流程均通過威斯康星大學醫學與公共衛生學院的機構動物護理和使用委員會批準。該頭動物在威斯康星大學的動物房飼養。缺少一個編碼電壓門控鉀通道 1.1 亞型（Kv1.1）等位基因的雜合小鼠（C3HeB.129S7-Kcna1tm1 Tem/J; Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA）被用于產生本研究用到的所有小鼠基因型。純合子敲除（KO）小鼠（Kcna1 缺失動物）在出生后第二周出現自發性癲癇發作。
1.2 照明條件
動物飼養于晝夜［12 h-12 h，光照-黑暗（LD）］或恒定黑暗（DD）條件下。在熄燈期間，使用低強度紅色照明進行所有必要的處理程序和飼養。
1.3 活動記錄儀
在通風良好的圓柱形樹脂玻璃籠（直徑 6 英寸，高 12 英寸）中將小鼠單獨飼養在 LD 或 DD 的光照條件下。懸浮在小鼠上方的紅外運動傳感器記錄了其大體運動。我們將個體的運動以 1 min 為單位，在時間上連續進行分析。作為夜行性動物，LD 條件下的小鼠在黑暗期間最活躍。當移除外部光線提示時，運動活動恢復為由內部起搏器驅動的自由運行表型。由于小鼠的晝夜節律短于 24 h，DD 條件下的活躍期在后續 1 d 提前發生，表現為時相超前。
1.4 腦電圖電極植入，癲癇發作記錄和睡眠-覺醒周期分析
如前所述，對于所有研究動物，在出生后第（P）34～36 d 進行腦電圖（EEG）電極植入。簡言之，用異氟烷麻醉小鼠（使用 5% 誘導，1%～2% 維持）。確認麻醉程度后，做一切口暴露顱骨并植入 2 枚不銹鋼螺釘電極進行 EEG 記錄（前囟+1.5 mm 和右 1 mm，前囟-3 mm 和左 1 mm，中線人字縫尖-1 mm）并且在頸部肌肉中植入 2 個不銹鋼編織線用于肌電圖（EMG）記錄。在 72 h 恢復后，將小鼠轉移到單獨的 EEG 采集室中并允許> 12 h 的適應期。在 D 或 DD 下使用兩個 5 d 的時間段獲得 EEG 和 EMG 信號；分析時，將 1 d 排除在分析之外，當日用于在光照條件之間轉換動物，確保動物能夠獲取食物和水。研究中使用 Xltek 放大器（Natus Medical Incorporated，Pleasanton，CA，USA）以 1 024Hz 采樣將記錄數字化。
癲癇發作由兩名獨立評估者根據視頻腦電記錄進行鑒定。對于睡眠分期，我們處理了帶通（EEG 為 1～70 Hz，EMG 為 3～500 Hz）和陷波（60 Hz）濾波器的記錄，并將其導入 Sirenia Sleep Pro 分析軟件（Pinnacle Technology，Lawrence，KS，美國）。在 4 s 內手動評分警覺狀態。將清醒狀態識別為具有高 EMG 振幅的時期（參見原文鏈接圖 S1A），將具有相對靜止的 EMG 作為睡眠時期。為了進一步區分睡眠時期，使用主要的 EEG 頻率來評估非快速眼動睡眠（NREM）和快速眼動睡眠（REM），如高 delta（1～4 Hz，參見原文鏈接圖 S1B）和高 θ（5～7 Hz，參見原文鏈接圖 S1C）活動。
1.5 實時聚合酶鏈式反應和蛋白質印跡法
在光照停止的任何時間均使用昏暗紅光，在 Zeitgeber 時間（ZT）0、6、12 和 18（n=4～6）獲取野生型（WT）和 Kcna1 缺失小鼠（P30±1 或 P45±3）的組織。收獲的小鼠包括在組織采集之前處于恒定黑暗中并保持 8d 的 DD 群組。將緊鄰 SCN 周圍的前下丘腦區域（～2 mm3）快速分離，沿中線一分為二，并在液氮中快速冷凍。將所有樣品儲存在?80℃ 直至它們同時能進行處理。
使用 TRI 試劑（Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA）分離出總 mRNA，并對樣品進行標準化濃度分析。使用 Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）的隨機六聚體引物將線性 RNA 合成 cDNA。然后用 SYBR Green 試劑進行實時聚合酶鏈反應，并按照熱觸發溫度循環方式進行靶基因 cDNA 擴增子的擴增，開始于 95℃ 2 min，然后進行 40 個擴增循環（95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，76℃ 6 s 成像）。通過熔解曲線分析（60～95°C，0.5°C 逐步）確認了引物的特異性。引物序列如下：Bmal1，正向，5'-CCCTAGGCCTTCATTGCACC-3'；反向，5'-CATAT TCTAACTGGTAGTCAGTGG-3'；Clock，正向，5'-AA GATTCTGGGTCTGACAAT-3'；反向，5'-TTGCAGCTT GAGACATCGCT-3'；mPer1，正向，5'-GAAAGAAAC CTCTGGCTGTTCCT-3'；反向，5'-GCTGACGACGGAT CTTTCTTG-3'；mPer2，正向，5'-GCATATTCTAAC TGGTAGTCAGTGG-3'；反向，5'-GTCTGAAGGCATC-ATCAGG-3'；Sirt1，正向，5'-TCTGTCTCCTGTGGGA-TTCCT-3'；反向，5'-GATGCTGTTCGAAAGGAA-3'，和 Gapdh，正向，5'-GACCTCAACTACATGGTCT ACA-3'；反向，5'-ACTCCACGACATACTCAGCAC-3'。
用 2ΔCT方法分析了轉錄水平，并對管家基因 Gapdh 進行了標準化。
使用含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀測定緩沖液分離了所有蛋白。分離后，進行蛋白印跡，在 4%～15% 梯度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中分離蛋白質樣品，并將它們轉移到聚偏二氟乙烯膜上。使用 5% 脫脂乳-Tris 緩沖鹽與 Tween 溶液在室溫下封閉膜 1 h。然后在 4℃ 下將膜結合蛋白與在上述脫脂乳-Tris 緩沖鹽與 Tween 中稀釋的一級抗體雜交過夜: SIRT1（1∶1 000；Milli-pore，Billerica，MA，USA），PER1 和 CLOCK（分別為 1∶1 000 和 1∶100；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），BMAL1（1∶1 000；Abcam，Cambridge，MA，USA），PER2（1∶1 000；Millipore）和 β-肌動蛋白（1∶10 000；MP Biomedicals，Irvine，CA，USA）。然后用化學發光成像（UVP ChemiDoc-it）和 SuperSignal West Femto ECL 試劑（Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA）將膜與含有過氧化氫酶（1∶10 000，Santa Cruz Biotechnology）的適當二級抗體孵育 1 h。在所有印跡實驗中添加兩份對照。通過相對于 β-肌動蛋白的信號對目標樣品的信號強度進行標化，然后將所有印跡中相對于對照的中值蛋白質：β-肌動蛋白比率進行量化靶蛋白質表達。
1.6 數據分析
利用個性化 MATLAB（Prism；GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）和 VisionWorks LS 成像軟件（UVP，Upland，CA，USA）分析數據。使用 χ2 周期圖分析計算晝夜周期長度。為了測試在每個警醒狀態下花費的周期長度和時間差異，使用多次 t 檢驗和 Holm-Sidak 校正來進行多種比較。使用雙樣本 Kolmogorov-Smirnov（2K-S）檢驗統計量來評估癲癇和野生型（WT）動物之間根據不同警醒狀態（清醒，NREM 和 REM）和照明條件的區段長度的累積分布函數的因子差異。在晝夜節律振蕩和獨立時間點使用 Sidak 校正的雙向方差分析（ANOVA）進行多重比較，以分析 Kcna1 缺失和 WT 小鼠之間蛋白質和 mRNA 水平表達的差異統計學顯著性。對于所有統計分析，將顯著性閾值設置為 P=0.05。
2 結果
2.1 晝夜休息活動模式破壞
在 LD 中的 WT 小鼠對照中，運動活動模式在黑暗時期升高，在光照期間降低，與先前報道致。當 WT 小鼠放置在 DD 中時，運動活動的時機轉變為自身晝夜節律控制，表現為每日活躍期的開始時間提前，如前所述（圖 1a，左）。然而，在 Kcna1 缺失小鼠中，LD 和 DD 的休息活動模式基本上是失常的（圖 1a，右）。在我們的隊列中，使用 χ2 周期圖，我們發現癲癇小鼠的晝夜節律期更長，不僅在 LD（KO，29.38±1.74，n=9 vs. WT，23.71±0.13，n=6，P< 0.05，Sidak t 檢驗），在 DD 條件下也展現出同樣特點（KO，27.260 0±1.162 7，n=9 vs. WT，23.680 0±0.150 0，n=20，P<0.01，Sidak t 檢驗）；（圖 1b），證明行為的同化和晝夜控制是在 Kcna1 缺失小鼠中被顯著破壞。
圖1
雙曲線活動圖
a. 在晝夜（12-12，明暗）和恒定的黑暗照明條件下
2.2 在 Kcna1 缺失小鼠中改變警戒模式和睡眠結構
因為活動記錄儀僅能提供對睡眠模式的間接測量，因此我們采用了視頻腦電圖（VEEG）分析 Kcna1 缺失小鼠和 WT 小鼠對照的睡眠情況。與活動記錄儀結果一致，我們發現 Kcna1 缺失小鼠在 LD 和 DD 中比 WT 同窩小鼠清醒的時間明顯更多［圖 2a，WT，（53.24±0.73）%，n=28 d，5 只小鼠 vs. KO，（66.53±1.54）%，n=50 d，7 只小鼠，P<0.000 1，Sidak t 檢驗；圖 2b，WT，（50.47±0.97）%，n=29 d，6 只小鼠 vs. KO，（70.000±1.258）%，n=35 d，7 只小鼠，P<0.000 1，Sidak t 檢驗］。如代表性動物的每日值所示（圖 2c、d），清醒時間增加在記錄的幾天內是一致的。這種睡眠不平衡主要是由于 NREM 睡眠期時間減少，與光照條件無關［圖 2a，LD：WT，（40.57±0.69）% vs. KO，（29.68±1.51）%，P<0.000 1，Sidak；圖 2b，DD：WT，（43.64±0.92）% vs. KO，（26.84±1.18）%，P<0.000 1，Sidak］。LD 中癲癇動物的 REM 時間也顯著減少［圖 2a，WT，（6.18±0.26）% vs. KO，（3.794 0±0.198 3）%，P<0.000 1，Sidak）和 DD圖 2b，WT，（5.89±0.27）% vs. KO，（3.153 0±0.149 6）%，P<0.05，Sidak］。通過根據基因型，警醒狀態和光照條件編譯區段長度評估睡眠結構時，發現除了晝夜 REM 之外的所有其他類別都具有顯著改變。值得注意的是，最大區段長度（在圖 2e-j 中的累積分布函數圖上方的三角形表示）在不同條件之內是可比較的，這表明差異主要在具有小于最大持續時間的區段中。如圖 2e 和 2f 所示，在兩種條件下突變動物的清醒區段長度是右移的，表明更長區段的可能性更大（P <0.000 1，2K-S 測試）。LD 和 DD 的 NREM 區段長度的分布分別如圖 2g 和 2h 所示。盡管在 DD 中，Kcna1 缺失小鼠的區段長度分布相比 WT 對照呈現左側移位（P<0.000 1， 2K-S 檢驗），但它們在 LD 條件下右移，這表明盡管 NREM 的總體時間減少，仍通常有較長的區段長度（P<0.000 1，2K-S 測試）。然而，考慮到總百分比（圖 2a），在 LD 條件下，NREM 很可能在 Kcna1 缺失小鼠中出現于較少但較長的區段。最后，與 LD 條件下的 WT 同窩小鼠相比，Kcna1 缺失小鼠的 REM 區段分布沒有改變（圖 2i，P=0.91，2K-S 測試），但在 DD 中該分布受影響（圖 2j，P<0.000 1，2K- S 測試）。
圖2
基于腦電圖的睡眠評分
a. 癲癇
2.3 癲癇發作頻率與睡眠-覺醒模式的相關性
我們之前曾報道，Kcna1 缺失小鼠在 10 d 內可有多達 78 次癲癇發作，發作表現為 4 種不同的電生理和行為差異的癲癇發作類型之一。鑒于異常的晝夜休息活動模式和睡眠結構，我們首先嘗試將每日癲癇發作計數與若干睡眠指標相關聯來確定癲癇發作負擔影響睡眠結構的程度，包括每個警醒狀態下的區段平均長度和數目。如圖 3 所示，我們發現癲癇小鼠的清醒區段數目隨著每天癲癇發作總數略有增加，但相關性無統計學意義（R2=0.045，P=0.14）。同樣，我們發現癲癇發作與其他警醒狀態之間也沒有關系（數據未顯示）。雖然我們一直觀察到延長的發作后清醒時期，但這一分析表明僅癲癇發作頻率不足以解釋 Kcna1 缺失小鼠嚴重受損的運動和警醒模式。
圖3
每日癲癇發作計數與清醒區段次數的線性回歸分析
回歸分析未顯示顯著相關性（
2.4 時鐘基因的異常振蕩
隨后，我們研究了睡眠調節的其他機制，特別是時鐘基因的表達是否存在改變。為此，我們研究了 Kcna1 敲除和 WT 小鼠中的 Clock、Bmal1、Per1 和 Per2 的 mRNA 水平（n= 3-4 /時間點/基因型/光照條件）。在 LD 中，我們發現除了 Bmal1 之外的所有基因都具有顯著的振蕩，表現為時間的主要效應（圖 4c，Clock，F3，17=4.863，P<0.05；圖 4e，Per1，F3， 16=66.28，P<0.000 1；圖 4g，Per2，F3， 17=9.592，P<0.001，雙向 ANOVA）。此外，我們發現基因型對 Clock 在 LD 下表達的主要影響（圖 4c，F1，17 = 24.25，P =0.0001，雙向 ANOVA），Per1（圖 4 e，F1，16= 20.90，P<0.001，雙向 ANOVA）和 Per2（圖 4g，F1， 17=7.957，P <0.05，雙向 ANOVA），與 WT 對照小鼠相比，在 Kcna1 缺失小鼠中轉錄減少。對各個時間點的評估顯示，在 LD 條件下，突變小鼠相比 WT，Clock 的表達水平在 ZT 0 和 6 降低（圖 4c，P<0.001，Sidak 多重比較，Per1 在 ZT 6 降低（圖 4e，P<0.001，Sidak 多重比較）。有趣的是，這些時間點通常與日常表達的峰值相對應，突出表明癲癇小鼠的轉錄驅動減少。在 DD 中，轉錄振蕩持續存在于 Per1（圖 4f，F3，21=35.42，P<0.000 1，雙向 ANOVA）和 Per2（圖 4h，F3，21=9.014，P<0.001，雙向 ANOVA）。我們還發現，在 DD 中 Kcna1 缺失小鼠僅 Per1（圖 4f，F1，21=5.159，P<0.05，雙向 ANOVA）是因基因型主要影響而導致轉錄減少。
圖4
在癲癇 Kcna1 缺失（紅色方塊）和野生型（WT;藍色圓圈）小鼠的視交叉上核中測量 4 個時鐘基因（Bmal1，Clock，Per1 和 Per2）和 Sirt1 相對于 Gapdh 的轉錄水平
分別在晝夜（a，c，e，g，i）和恒定條件（b，d，f，h，j）的 4 個時間點（ZT 0, 6, 12 和 18）。圖表包括每個圖右側的 ZT 0 重復值。使用 Sidak 校正的多重比較雙向方差分析顯示時間對晝夜條件下
鑒于我們的 Kcna1 缺失小鼠模型中存在幾個時鐘基因的轉錄譜的變化，我們隨后檢查了相關蛋白質水平是否也被破壞（n=5-8/基因型/時間點/光照條件）。我們發現在 LD（圖 5 g，F3，40=3.79，P<0.05，雙向 ANOVA）和 DD（圖 5h，F3，32=3.856，P<0.05，雙向 ANOVA）中均存在 PER2 的顯著振蕩。發現基因型僅對 DD 中飼養小鼠的 PER2 表達中具有主要作用（圖 5h，F1，32 =4.761，P<0.05，雙因素方差分析）。代表性的蛋白印跡結果顯示在圖 5k 中。
圖5
晝夜（a，c，e，g，i）和恒定（b，d，f，h，j）條件下，在 4 個時間點（ZT 0, 6, 12 和 18），測量 Kcna1 缺失（紅色方塊）和野生型（WT;藍色圓圈）小鼠的視交叉上核中 4 個時鐘基因（BMAL1，CLOCK，PER1 和 PER2）和 SIRT1 的蛋白質表達模式 K，每種時鐘基因蛋白，β-肌動蛋白的代表性蛋白印跡，每個泳道上方標記 ZT 和基因型（+，WT；?，Kcna1-缺失）。用 Sidak 校正的多重比較進行雙向方差分析，顯示時間對晝夜狀態下的 PER1 和 PER2 和恒定條件下的 PER2 的主要效應，用 T 表示。其中，我們看到基因型在 PER2 中的主要影響（h 在恒定條件下，用 G 表示。照明條件用水平條表示（填充=關燈，未填充=開燈，n=5-8/基因型/時間點/照明條件）。N.S. 不顯著
總之，我們發現大多數基因型效應作用于轉錄水平，PER2 是癲癇小鼠中唯一測試存在改變的蛋白質。總體而言，與年齡匹配的 WT 同窩小鼠相比，癲癇 Kcna1 缺失小鼠顯示出振蕩幅度降低，并且 LD 情況下的 Clock、Per1 和 Per2 以及 DD 情況下的 Per1 和 PER2 平均表達降低。
2.5 Kcna1 缺失小鼠中的 Sirt1 表達模式
考慮到 Kcna1 缺失小鼠中幾個時鐘基因的轉錄受到抑制，并且由于 Sirt1 與衰老中的時鐘成分調節有關，我們試圖使用來自上述實驗的樣本確定癲癇 Kcna1 缺失小鼠中 Sirt1 表達是否發生改變。在 LD 動物中，我們發現基因型和時間在轉錄水平上存在主要影響（圖 4i，F1，16=21.19 和 F3，16=14.19，P<0.001，雙向 ANOVA）。并且，Kcna1 缺失小鼠中 Sirt1 mRNA 的表達水平低于 WT 小鼠，特別是在 LD 中的 ZT 6（P<0.05，Sidak）。但是，我們比較 LD 或 DD 條件下的差異，但未發現 SIRT1 蛋白表達水平存在任何顯著差異（圖 5i 和 5j）。
2.6 在年輕的 Kcna1 缺失小鼠中，Clock 基因和 Sirt1 表達不受影響
作為確保僅 Kv1.1 通道缺失對時鐘基因表達改變不起作用的重要對照，我們評估了 P30 的基因轉錄模式，P30 是不常見癲癇發作的年齡。我們發現基因型在這個較年輕的時候對任何時鐘基因或 Sirt1 的表達沒有顯著影響（圖 6a 和 6b，雙向 ANOVA，P>0.05，n=3-4 /時間點/基因型），雖然單時間點分析確實顯示癲癇動物的 Per2 水平比 WT 同窩小鼠增加（P<0.05，Sidak）。這些發現表明單獨的基因型不會影響晝夜節律維持，這與之前的研究結果一致，即此時 Kcna1 缺失小鼠的休息活動模式與 WT 對照小鼠相比沒有差異。
圖6
基因型對 4 個時鐘基因（Bmal1，Clock，Per1 和 Per2）和 Sirt1 相對于 Gapdh 的轉錄水平的影響是在晝夜條件下的 4 個時間點（ZT 0, 6, 12 和 18），年輕（P 30 d）Kcna1 缺失（紅色方塊）和野生型（WT；藍色圓圈）的視交叉上核中測量的
圖形包括每個圖右側的 ZT 0 的重復值。Sidak 校正的重復比較雙向方差分析顯示時間對
3 討論
本研究中有幾個關鍵的觀察結果。首先，我們發現癲癇 Kcna1 缺失小鼠與 WT 對照小鼠相比，無論光照條件如何，均具有改變的運動休息活動模式和延長的晝夜周期。EEG 睡眠-覺醒分析還表明，癲癇小鼠睡眠消耗的時間明顯減少，還有睡眠結構改變，如區段長度分布的差異所示。我們發現幾種時鐘基因（Clock、Per1 和 Per2）以及調節因子 Sirt1 的轉錄物表達振蕩在癲癇小鼠中減弱，特別是在晝夜條件下。每日癲癇發作負擔與睡眠參數之間缺乏任何直接關聯，這表明其他機制，如時鐘控制基因的振蕩抑制，可能是這種模型中晝夜節律和睡眠破壞的機制。
已知睡眠模式和晝夜節律在諸如帕金森病和阿爾茨海默病等許多神經系統疾病中均受到干擾。在患有癲癇的患者中，已報道晝夜節律與癲癇發作之間存在關聯。例如，額葉癲癇發作傾向于更多地出現于睡眠中，而顳葉癲癇在慢波睡眠期間海馬出現癇樣棘波的概率最高。在動物模型中，癲癇發作點燃的易感性在每日晚些時候達到峰值，而點燃后癲癇發作主要見于夜晚，海人酸處理后模型則在非活動期。我們以前發現 Kcna1 缺失小鼠模型的癲癇發作在 ZT 7 附近有周期性峰值，這種模式在光照和自由運行條件下均存在。臨床上，據報道，癲癇發作通常具有與晝夜節律相關的發生模式，并且因癲癇發作和癲癇類型而存在區別。此外，癲癇患者表現出晝夜節律破壞和睡眠持續時間縮短。在癲癇動物模型中，已經證明幾種晝夜節律性的生物學過程被破壞。我們的觀察結果與之前的報道一致。晝夜休息-活動節律的破壞程度接近行為完全失常，并且，與 WT 對照小鼠相比，癲癇小鼠的平均晝夜節律期延長，且與光照條件無關。此外，睡眠結構分析顯示癲癇小鼠近似睡眠時間減少和區段長度分布改變。晝夜休息活動模式和睡眠破壞的潛在原因之一是癲癇發作本身。然而，我們的研究發現癲癇發作負擔與睡眠破壞程度之間沒有顯著相關性，另一個潛在機制是時鐘基因表達的晝夜節律性改變。
在正常情況下，BMAL1，Per1/2 表達在 SCN 中振蕩，而 CLOCK 通常在亮/暗周期中表達一致。晝夜休息活動節律異常，和 SCN 中時鐘基因振蕩衰減包括 Clock、Per1 和 Per2，已在衰老和神經退行性疾病中報道。時鐘基因調節也在急性睡眠剝奪時改變，以 BMAL1 E-box 占據率改變和幾種時鐘基因 mRNA 的相對豐度變化為證據，雖然持續睡眠擾動（如癲癇發作）對時鐘基因表達的影響仍不清楚。鑒于我們發現 Kcna1 缺失小鼠中多個時鐘基因的振蕩抑制，特別是在 LD 之下，以及先前證據表明的時鐘基因表達幅度與晝夜節律的強度正相關，我們認為模型中的晝夜節律的改變是擾動翻譯調節的結果。有趣的是，癲癇發作對時鐘基因的影響主要限于 mRNA。盡管在該模型中蛋白質水平似乎基本上不受影響，但翻譯后修飾或細胞定位模式可能是轉錄水平變化的原因。與 Sirt1 的情況一樣，我們可能會看到對轉錄影響在核心時鐘基因基礎上延伸到許多其他“時鐘控制基因”，這將對其他細胞過程產生影響。晝夜 CLOCK: BMAL1 介導的轉錄穩定可能是使行為節律和睡眠模式正常化的關鍵。
生物鐘的調節劑從飲食習慣的輕度暴露到細胞代謝不等。雖然后者通過多種途徑（即 ROR/REVERB，AMPK 和 mTORC1）影響時鐘基因調控，但已顯示 SIRT1 通過與 CLOCK: BMAL1 轉錄因子和 PER2 的相互作用影響生物鐘基因機制。基于飲食療法減輕代謝壓力已經存在了數千年。用于頑固性癲癇治療的生酮飲食（KD）和熱量限制均已顯示出大腦中 Sirt1 表達的上調。增強 SIRT1 功能進一步證明其在 SIRT1 降低條件下恢復晝夜節律的作用，比如衰老。先前的研究表明 KD 可以挽救 Kcna1 缺失小鼠晝夜休息活動模式的抑制，盡管尚未直接研究 SIRT1 的作用。SIRT1 活性增強可能構成 KD 治療效果的一部分，通過幫助恢復正常的晝夜節律來輔助其抗癲癇作用。此外，由于 Kcna1 缺失小鼠在死亡之前的休息-活動模式表現出進行性破壞，我們觀察到的睡眠和晝夜節律破壞可能構成睡眠受損的早期表型，其可能伴隨癲癇發作負擔而惡化，潛在導致疾病進展和死亡。盡管晝夜 Sirt1 mRNA 中的顯著變化并未延伸到蛋白質水平，但我們在 mRNA 水平上看到的變化可能是生物鐘減少轉錄激活的更廣泛結果，正如在衰老中看到的那樣。考慮到增強 SIRT1 活性恢復衰老中晝夜節律的治療功效，其中時鐘基因表達和晝夜節律弱，SIRT1 調節可能是緩解 Kcna1 缺失小鼠模型中進行性睡眠破壞的有效工具。在癲癇患者中，睡眠破壞觸發癲癇發作的效力加上癲癇發作破壞睡眠模式的證據支持了這些相互作用促成疾病進展的觀點。通過調節時鐘控制的基因振蕩來恢復休息-活動節律和睡眠可以預防 Kcna1 缺失小鼠模型中的疾病進展和癲癇相關死亡率（如 SUDEP）。未來的設計需研究直接解決這個問題。
該研究存在一些局限性。首先是全面刪除 Kcna1，它對整流電流外機制（即 SCN 電生理功能）的影響仍不清楚，也尚未經過測試。這種限制并沒有否定這種模型的作用，特別是考慮到基因突變或自身免疫消除這些通道表達的一些綜合征往往會導致抽搐。需要進一步研究使用不受基因突變混淆的模型來澄清這種局限性，雖然我們對 mRNA 表達水平的評估加上我們的合作者在幼年（<P30）Kv1.1 KO 動物的休息活動水平上報告的證據表明 Kcna1 缺失小鼠的睡眠擾動表型僅出現于自發性癲癇發作后。技術性并發癥使我們無法同時進行活動記錄-腦電數據采集，這阻止我們將活動計數與基于 EEG 的癲癇發作頻率或睡眠指標聯系起來。我們有多個人在睡眠階段進行評分，這增加了區段分析的差異。然而，我們認為多個評分者的影響微乎其微，考慮到為評估標準的實施做出了巨大努力，得分者在兩種基因類型和條件記錄上可達>90%的相似性。最后，我們還沒有證明時鐘基因的異常振蕩與行為模式破壞之間存在因果關系。有針對性的睡眠（如使用助眠劑）可能會恢復時鐘基因振蕩，我們還未研究。未來的實驗將進一步評估癲癇發作與 SCN 功能之間關系的相互關系，以及確定調節 SIRT1 活性的治療效果。這些實驗將密切評估其他已知時鐘控制基因的變化，解析蛋白質修飾和運輸，并通過 SIRT1 研究 CLOCK：BMAL 驅動的調節效率。
致謝 該研究部分得到了亞利桑那生物醫學研究委員會（R.K.M.和 J.M.R.）的資助。感謝 Creighton 大學的 Fenoglio-Simeone 實驗室提供多種 Kcna1 缺失小鼠雜合子育種配對。
利益沖突 J.M.R.曾擔任過 Xenon Pharmaceuticals，Ajinomoto USA，Accera Pharma 和 Danone Nutriia 的顧問。R.K.M.曾擔任格林威治生物科學的顧問。我們確認已閱讀本雜志關于出版道德問題的立場，并確認本文符合這些要求。
