引用本文： 詹瓊, 馮莉, 岳宗偉, 解媛媛, 龍莉莉, 肖波. 癲癇泛化對呼吸障礙嚴重程度的影響. 癲癇雜志, 2016, 2(5): 383-386. doi: 10.7507/2096-0247.20160067 復制
癲癇猝死(Sudden unexpected death in epilepsy, SUDEP)是指癲癇患者突然發生的無法解釋的死亡，通常認為其與癲癇發作有關[1, 2]，是癲癇患者最常見的死亡原因，占癲癇患者全因死亡的17%，而在難治性癲癇患者中，這一比例可能高達50%[3]。SUDEP的發病機制仍不明確，越來越多的證據表明呼吸障礙、意識喪失和發作后狀態均在其中起重要作用[2-5]。有學者認為SUDEP可能與嬰兒猝死綜合癥(Sudden infant death syndrome, SIDS)發生的機制類似，后者被發現與腦干5-羥色胺(5-Hydroxy tryptaimine, 5-HT)系統功能障礙所致窒息和缺氧相關[4, 6, 7]。
近年來由于視頻腦電圖(VEEG)技術的興起與發展，研究者們發現呼吸功能抑制不僅存在于部分性發作的患者，在部分繼發全面發作的患者中更常見，且低氧血癥在部分繼發全面發作時程度更嚴重[5]。同時，復雜部分性發作和部分繼發全面發作也存在意識水平的下降，這種意識障礙可以減少患者從俯臥位轉成仰臥位恢復氣道通暢的能力，從而大大增加了死亡率，尤其是當患者頭部朝下埋于枕頭中時[3, 8]。最近有學者發現腦干上行網狀激活系統功能受損與顳葉癲癇發作過程中及發作后的意識障礙相關[9-11]。然而癲癇發作過程中及發作后呼吸功能障礙發生的機制及其與SUDEP的關系尚未完全闡明。若存在一種動物模型既可控制癲癇發作又可對呼吸功能進行監測，無疑可以促進我們對這一研究方向的探索。
本研究正是致力于這一目標，通過電刺激顳葉獲得局灶性邊緣葉發作及部分繼發全面發作動物模型，同時實時監測呼吸模式改變，探索癲癇對呼吸模式及癲癇泛化對呼吸障礙嚴重程度的影響，為充分研究癲癇發作及發作后致呼吸功能障礙的網絡機制提供基礎。
材料與方法
1 實驗動物
實驗選取由中南大學試驗動物部購得的6只不同性別的健康成年Long-Evans大鼠，體重190~400 g。本研究通過了中南大學湘雅醫院倫理委員會的審批。
2 實時電生理實驗
以90/15 mg/kg體重的氯胺酮/甲苯噻嗪肌肉注射麻醉大鼠，每隔15 min檢查足趾對鑷子的疼痛反應[9]。立體定位儀上固定大鼠后，將電子探針測溫儀(BAT-12，Physitemp)的熱敏傳感器(RET-3，Physitemp)放在大鼠一側的鼻腔中用以監測呼吸頻率的變化[12]。將一雙極聚四氟乙烯涂層的不銹鋼電極(50～100 KΩ，Plastics One，E363/2-2TW/ SPC)立體定向植入大鼠一側海馬DH區(AP-3.8；ML+2.5；SI -2.6)，通過信號放大器(1800，A-M Systems)采集海馬DH區0.1～100 Hz局部場電位(LFP)的腦電信號并將其放大100倍；另將一高阻抗微電極(2～4 MΩ，FHC，UEWMGGSEDNNM)放置在同側額葉LOFC區(AP +4.2；ML +2.2；SI -2.4)，通過信號放大器采集0.1～10 KHz范圍內的腦電信號，放大100倍后連接到信號過濾器，將信號過濾為0.1～100 Hz的LFP及400 Hz～10 KHz的多神經元電位(MUA)。所有的電生理和鼻熱敏傳感器信號均通過模擬-數字信號轉換器(CED 1401)進行數字化處理，并通過Spike2記錄軟件獲得相應實時波形圖。所有的坐標均為相對于前囟的毫米數。另外，海馬的電刺激信號由脈沖刺激器通過海馬DH區的雙極電極完成，電刺激參數為180～800 uA、2 s、60 Hz、雙相方波、每相時長1ms。具體部分性發作及部分繼發全面發作的具體造模方法參看前述已發表文獻[9]。
實驗結束時，深度麻醉并處死動物后使用150 mL 1×PBS緩沖液及500 mL新鮮4%多聚甲醛進行心臟灌注，收集大腦行組織學檢查確定電極位置。
3 統計學方法
由于每次誘發的癲癇發作時長不一致，所有數據統計均以海馬刺激的時間點作為參照點。基線期選取電刺激前40 s至刺激前10 s，癲癇發作期選取DH區癲癇波消失前的15 s至消失前5 s，因此階段呼吸功能受抑制最明顯，此時段命名為癲癇晚期。呼吸頻率從鼻熱敏傳感器信號獲得[12]，具體在Spike2軟件上先將鼻熱敏傳感器信號以0.2 s為單位進行平滑處理，去除漂移后根據記錄波形選取一合適的基線，計數癲癇晚期內波形曲線與基線相交的次數，由此得到呼吸晚期的呼吸次數。皮爾森相關分析被用來研究癲癇晚期呼吸次數與癲癇泛化持續時間的關系。P值<0.05為差異具有統計學意義。
結果
本實驗6只大鼠共收集到30次顳葉癲癇發作，其中單純部分性發作9次，部分繼發全面發作21次。當DH區LFP顯示高尖棘波的癲癇波時，若額葉LOFC區的LFP出現預示皮層功能障礙的慢波，提示此癲癇為復雜部分性發作(圖 1a)[9, 10]；若額葉LOFC區的LFP出現和DH區一致的高尖棘波，提示此癲癇發作出現了泛化(圖 1b中紅線所示)，即為部分繼發全面發作(圖 1b)。同步電生理及鼻熱敏記錄實時觀察癲癇過程中皮層功能狀態及呼吸頻率的變化情況，發現當癲癇波泛化至海馬以外的區域時，呼吸頻率明顯減慢(P<0.05；n=21)，且這種減慢持續至了癲癇停止后的一段時間。
另外，癲癇晚期呼吸次數與癲癇泛化時長(即LOFC出現癲癇波的時長)之間的相關性被用來進一步量化呼吸功能障礙與癲癇泛化之間的關系。結果顯示，呼吸次數與癲癇泛化時長呈明顯負相關(Pearson R=-0.73；P<0.001；n=30)，見圖 1c，即癲癇泛化時間越長，呼吸頻率減少的程度越嚴重。
圖1
呼吸功能障礙與癲癇泛化關系示意圖(海馬LFP上黑色豎直粗線代表 2s電刺激)?? a.部分性發作示例(癲癇波局限于海馬區域，皮層未見癲癇波); b.部分繼發全面發作示例(紅色水平線標志部分代表癲癇泛化至皮層)，鼻熱敏傳感器信號顯示呼吸明顯受影響; c.癲癇晚期呼吸次數與泛化時長明顯呈負相關
Figure1.
Schematic of respiratory dysfunction and seizure generalization (Vertical black bold lines in hippocampus LFP represent 2s electrical stimulation) a. Partial seizure without propagation to lateral orbitofrontal cortex (LOFC); b. Secondarily generalized seizure shows propagation of polyspike activity to OFC during the time period indicated by red horizontal bar, accompanied by depressed breathing measured by nasal thermistortracings (Nasal therm); c. Decreased rate of breathing during the late ictal period is correlated with duration of propagated seizure activity in the LOFC
討論
SUDEP是癲癇患者死亡的主要原因。越來越多的證據表明，癲癇發作時的呼吸功能障礙是決定SUDEP風險高低的重要因素。了解癲癇致呼吸功能障礙的相關機制對減少癲癇患者猝死率具有重要意義。
本研究中部分繼發全面發作大鼠模型顯示呼吸功能明顯受到抑制，這與其他學者發現全面性發作亦可導致呼吸功能障礙的結果一致[2, 5]。另外，我們發現呼吸次數與癲癇泛化時長呈明顯負相關，據我們所知這是首次。有研究發現用匹羅卡品預處理了的動物對血液中氣體成分改變的反應性下降，再次證明癲癇可致通氣調節功能障礙[13]，與本研究結果有共通之處。
本研究未能定位癲癇泛化引起呼吸功能障礙的責任腦區。我們推測皮層下可能存在一些關鍵性區域，這些區域被癲癇泛化后可以通過一系列網絡機制引起呼吸及意識障礙。已有研究表明，皮層及皮層下覺醒中樞在人的部分性癲癇或全面性癲癇所致發作期及發作后期的意識障礙中起著重要作用[11, 14-16]。呼吸通常受由對二氧化碳敏感的外周和中樞化學感受器調節，這些感受器中包括了對延髓呼吸中樞有支配纖維的延髓中縫核5-HT神經元[17, 18]。前期神經電生理試驗亦證實了延髓中縫核的5-HT神經元在癲癇發作過程中放電頻率明顯減少[19]。基于這些研究結果我們推測，癲癇可能通過激活與單胺類、5-HT類或其他類神經元有神經支配關系的大腦抑制性單元，引起這些神經元功能障礙，因這些神經元又是上行覺醒網絡或下行驅動延髓自主呼吸中樞的重要組成部分，從而可致意識障礙及呼吸功能障礙。正常情況下高碳酸血癥可激活延髓呼吸中樞，通過調節呼吸頻率及吸氣/呼氣時間比來促進二氧化碳從體內排出[18, 20]，然而若癲癇發作過程中及發作后期這一過程被抑制，機體即很難從癲癇后的缺氧狀態自主恢復，由此促進SUDEP的發生。未來可通過此癲癇模型，結合神經影像、電生理及神經遞質研究等方法更進一步驗證這一假說。
雖然鼻熱敏傳感器可對固定在腦立體定位儀上進行腦電記錄的動物模型進行同步監測、具有操作簡便且無創的優點，但由于其是對鼻腔溫度進行監測間接獲得呼吸數據，具有一定的有限性。未來如能將直接提供潮氣量、二氧化碳濃度、氧氣比值等呼吸參數的工具結合于立體定位儀上，實現同步進行腦電記錄及更加精確的呼吸監測，可大大促進癲癇致呼吸障礙的機制研究。
綜上，本研究為部分繼發全面發作引起呼吸功能障礙提供了進一步的證據，并首次提出呼吸障礙的嚴重程度與癲癇泛化的時長明顯相關。另外，本研究建立了可穩定獲得的將電生理試驗和呼吸監測同步進行的顳葉癲癇大鼠模型，為將來研究癲癇致呼吸障礙，甚至死亡的神經網絡機制及開發預防SUDEP發生的新藥靶點提供了一定的基礎及方向。
癲癇猝死(Sudden unexpected death in epilepsy, SUDEP)是指癲癇患者突然發生的無法解釋的死亡，通常認為其與癲癇發作有關[1, 2]，是癲癇患者最常見的死亡原因，占癲癇患者全因死亡的17%，而在難治性癲癇患者中，這一比例可能高達50%[3]。SUDEP的發病機制仍不明確，越來越多的證據表明呼吸障礙、意識喪失和發作后狀態均在其中起重要作用[2-5]。有學者認為SUDEP可能與嬰兒猝死綜合癥(Sudden infant death syndrome, SIDS)發生的機制類似，后者被發現與腦干5-羥色胺(5-Hydroxy tryptaimine, 5-HT)系統功能障礙所致窒息和缺氧相關[4, 6, 7]。
近年來由于視頻腦電圖(VEEG)技術的興起與發展，研究者們發現呼吸功能抑制不僅存在于部分性發作的患者，在部分繼發全面發作的患者中更常見，且低氧血癥在部分繼發全面發作時程度更嚴重[5]。同時，復雜部分性發作和部分繼發全面發作也存在意識水平的下降，這種意識障礙可以減少患者從俯臥位轉成仰臥位恢復氣道通暢的能力，從而大大增加了死亡率，尤其是當患者頭部朝下埋于枕頭中時[3, 8]。最近有學者發現腦干上行網狀激活系統功能受損與顳葉癲癇發作過程中及發作后的意識障礙相關[9-11]。然而癲癇發作過程中及發作后呼吸功能障礙發生的機制及其與SUDEP的關系尚未完全闡明。若存在一種動物模型既可控制癲癇發作又可對呼吸功能進行監測，無疑可以促進我們對這一研究方向的探索。
本研究正是致力于這一目標，通過電刺激顳葉獲得局灶性邊緣葉發作及部分繼發全面發作動物模型，同時實時監測呼吸模式改變，探索癲癇對呼吸模式及癲癇泛化對呼吸障礙嚴重程度的影響，為充分研究癲癇發作及發作后致呼吸功能障礙的網絡機制提供基礎。
材料與方法
1 實驗動物
實驗選取由中南大學試驗動物部購得的6只不同性別的健康成年Long-Evans大鼠，體重190~400 g。本研究通過了中南大學湘雅醫院倫理委員會的審批。
2 實時電生理實驗
以90/15 mg/kg體重的氯胺酮/甲苯噻嗪肌肉注射麻醉大鼠，每隔15 min檢查足趾對鑷子的疼痛反應[9]。立體定位儀上固定大鼠后，將電子探針測溫儀(BAT-12，Physitemp)的熱敏傳感器(RET-3，Physitemp)放在大鼠一側的鼻腔中用以監測呼吸頻率的變化[12]。將一雙極聚四氟乙烯涂層的不銹鋼電極(50～100 KΩ，Plastics One，E363/2-2TW/ SPC)立體定向植入大鼠一側海馬DH區(AP-3.8；ML+2.5；SI -2.6)，通過信號放大器(1800，A-M Systems)采集海馬DH區0.1～100 Hz局部場電位(LFP)的腦電信號并將其放大100倍；另將一高阻抗微電極(2～4 MΩ，FHC，UEWMGGSEDNNM)放置在同側額葉LOFC區(AP +4.2；ML +2.2；SI -2.4)，通過信號放大器采集0.1～10 KHz范圍內的腦電信號，放大100倍后連接到信號過濾器，將信號過濾為0.1～100 Hz的LFP及400 Hz～10 KHz的多神經元電位(MUA)。所有的電生理和鼻熱敏傳感器信號均通過模擬-數字信號轉換器(CED 1401)進行數字化處理，并通過Spike2記錄軟件獲得相應實時波形圖。所有的坐標均為相對于前囟的毫米數。另外，海馬的電刺激信號由脈沖刺激器通過海馬DH區的雙極電極完成，電刺激參數為180～800 uA、2 s、60 Hz、雙相方波、每相時長1ms。具體部分性發作及部分繼發全面發作的具體造模方法參看前述已發表文獻[9]。
實驗結束時，深度麻醉并處死動物后使用150 mL 1×PBS緩沖液及500 mL新鮮4%多聚甲醛進行心臟灌注，收集大腦行組織學檢查確定電極位置。
3 統計學方法
由于每次誘發的癲癇發作時長不一致，所有數據統計均以海馬刺激的時間點作為參照點。基線期選取電刺激前40 s至刺激前10 s，癲癇發作期選取DH區癲癇波消失前的15 s至消失前5 s，因此階段呼吸功能受抑制最明顯，此時段命名為癲癇晚期。呼吸頻率從鼻熱敏傳感器信號獲得[12]，具體在Spike2軟件上先將鼻熱敏傳感器信號以0.2 s為單位進行平滑處理，去除漂移后根據記錄波形選取一合適的基線，計數癲癇晚期內波形曲線與基線相交的次數，由此得到呼吸晚期的呼吸次數。皮爾森相關分析被用來研究癲癇晚期呼吸次數與癲癇泛化持續時間的關系。P值<0.05為差異具有統計學意義。
結果
本實驗6只大鼠共收集到30次顳葉癲癇發作，其中單純部分性發作9次，部分繼發全面發作21次。當DH區LFP顯示高尖棘波的癲癇波時，若額葉LOFC區的LFP出現預示皮層功能障礙的慢波，提示此癲癇為復雜部分性發作(圖 1a)[9, 10]；若額葉LOFC區的LFP出現和DH區一致的高尖棘波，提示此癲癇發作出現了泛化(圖 1b中紅線所示)，即為部分繼發全面發作(圖 1b)。同步電生理及鼻熱敏記錄實時觀察癲癇過程中皮層功能狀態及呼吸頻率的變化情況，發現當癲癇波泛化至海馬以外的區域時，呼吸頻率明顯減慢(P<0.05；n=21)，且這種減慢持續至了癲癇停止后的一段時間。
另外，癲癇晚期呼吸次數與癲癇泛化時長(即LOFC出現癲癇波的時長)之間的相關性被用來進一步量化呼吸功能障礙與癲癇泛化之間的關系。結果顯示，呼吸次數與癲癇泛化時長呈明顯負相關(Pearson R=-0.73；P<0.001；n=30)，見圖 1c，即癲癇泛化時間越長，呼吸頻率減少的程度越嚴重。
圖1
呼吸功能障礙與癲癇泛化關系示意圖(海馬LFP上黑色豎直粗線代表 2s電刺激)?? a.部分性發作示例(癲癇波局限于海馬區域，皮層未見癲癇波); b.部分繼發全面發作示例(紅色水平線標志部分代表癲癇泛化至皮層)，鼻熱敏傳感器信號顯示呼吸明顯受影響; c.癲癇晚期呼吸次數與泛化時長明顯呈負相關
Figure1.
Schematic of respiratory dysfunction and seizure generalization (Vertical black bold lines in hippocampus LFP represent 2s electrical stimulation) a. Partial seizure without propagation to lateral orbitofrontal cortex (LOFC); b. Secondarily generalized seizure shows propagation of polyspike activity to OFC during the time period indicated by red horizontal bar, accompanied by depressed breathing measured by nasal thermistortracings (Nasal therm); c. Decreased rate of breathing during the late ictal period is correlated with duration of propagated seizure activity in the LOFC
討論
SUDEP是癲癇患者死亡的主要原因。越來越多的證據表明，癲癇發作時的呼吸功能障礙是決定SUDEP風險高低的重要因素。了解癲癇致呼吸功能障礙的相關機制對減少癲癇患者猝死率具有重要意義。
本研究中部分繼發全面發作大鼠模型顯示呼吸功能明顯受到抑制，這與其他學者發現全面性發作亦可導致呼吸功能障礙的結果一致[2, 5]。另外，我們發現呼吸次數與癲癇泛化時長呈明顯負相關，據我們所知這是首次。有研究發現用匹羅卡品預處理了的動物對血液中氣體成分改變的反應性下降，再次證明癲癇可致通氣調節功能障礙[13]，與本研究結果有共通之處。
本研究未能定位癲癇泛化引起呼吸功能障礙的責任腦區。我們推測皮層下可能存在一些關鍵性區域，這些區域被癲癇泛化后可以通過一系列網絡機制引起呼吸及意識障礙。已有研究表明，皮層及皮層下覺醒中樞在人的部分性癲癇或全面性癲癇所致發作期及發作后期的意識障礙中起著重要作用[11, 14-16]。呼吸通常受由對二氧化碳敏感的外周和中樞化學感受器調節，這些感受器中包括了對延髓呼吸中樞有支配纖維的延髓中縫核5-HT神經元[17, 18]。前期神經電生理試驗亦證實了延髓中縫核的5-HT神經元在癲癇發作過程中放電頻率明顯減少[19]。基于這些研究結果我們推測，癲癇可能通過激活與單胺類、5-HT類或其他類神經元有神經支配關系的大腦抑制性單元，引起這些神經元功能障礙，因這些神經元又是上行覺醒網絡或下行驅動延髓自主呼吸中樞的重要組成部分，從而可致意識障礙及呼吸功能障礙。正常情況下高碳酸血癥可激活延髓呼吸中樞，通過調節呼吸頻率及吸氣/呼氣時間比來促進二氧化碳從體內排出[18, 20]，然而若癲癇發作過程中及發作后期這一過程被抑制，機體即很難從癲癇后的缺氧狀態自主恢復，由此促進SUDEP的發生。未來可通過此癲癇模型，結合神經影像、電生理及神經遞質研究等方法更進一步驗證這一假說。
雖然鼻熱敏傳感器可對固定在腦立體定位儀上進行腦電記錄的動物模型進行同步監測、具有操作簡便且無創的優點，但由于其是對鼻腔溫度進行監測間接獲得呼吸數據，具有一定的有限性。未來如能將直接提供潮氣量、二氧化碳濃度、氧氣比值等呼吸參數的工具結合于立體定位儀上，實現同步進行腦電記錄及更加精確的呼吸監測，可大大促進癲癇致呼吸障礙的機制研究。
綜上，本研究為部分繼發全面發作引起呼吸功能障礙提供了進一步的證據，并首次提出呼吸障礙的嚴重程度與癲癇泛化的時長明顯相關。另外，本研究建立了可穩定獲得的將電生理試驗和呼吸監測同步進行的顳葉癲癇大鼠模型，為將來研究癲癇致呼吸障礙，甚至死亡的神經網絡機制及開發預防SUDEP發生的新藥靶點提供了一定的基礎及方向。
