引用本文： 遲瀟灑, 黃程, 吳夢倩, 周東. mTOR信號通路在馬桑內酯點燃大鼠難治性癲癇模型中的作用. 癲癇雜志, 2015, 1(3): 225-228. doi: 10.7507/2096-0247.20150037 復制
癲癇是一種常見的神經系統疾病，全球約有5 000萬患者，給家庭和社會帶來了嚴重的經濟負擔[1]。盡管不斷有新型抗癲癇藥應用于臨床，仍有約30%的患者在早期正規抗癲癇治療后仍不能控制癲癇發作，即難治性癲癇[2]。目前研究認為難治性癲癇的病因可能是藥物轉運體過度表達[3]，作用靶點改變等[4]，但大多數抗癲癇藥物僅控制癲癇癥狀，因而癲癇發病機制的研究仍是目前研究的重點。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路在結節性硬化癥中過度活化，導致癲癇、智能減退等神經系統癥狀[5]，且mTOR信號通路下游P-S6在匹羅卡品、海人酸等癲癇模型均存在活化，調控細胞周期、細胞增殖等[6-8]。本研究通過構建馬桑內酯點燃難治性癲癇，檢測mTOR下游P-S6的表達，以探究mTOR在難治性癲癇發病機制中的作用，為臨床治療提供一定指導。
材料與方法
1 方法
1.1 實驗動物及試劑
選取8~10周Sprague-Dawley大鼠60只，體重180~200 g；由四川大學華西醫院實驗動物中心提供，實驗開始前在室溫下保持晝夜節律。馬桑內酯注射液由成都中醫藥大學配置，有效成分濃度為5 mg/mL。主要試劑及設備如下：兔源P-S6多克隆抗體(#5364，Cell Signaling Technology，美國)，小鼠、兔多聚物酶標通用型二抗(Introgen，美國)，DAB試劑盒(Dako，加拿大)；圖像采集系統(Olympus，日本)。
1.2 模型構建及實驗分組
將60只SD大鼠隨機分為實驗組(n=50)和對照組(n=10)。根據前期實驗結果確定馬桑內酯點燃的最佳閾下劑量，給予實驗組大鼠1.75 mg/kg肌注，每84 h重復一次[9]；同時給予對照組等體積生理鹽水肌注。根據Racine[10]的5級標準判定，在連續2次注射期間，大鼠出現5次以上5級發作即達到點燃標準，點燃大鼠每7 d給藥一次，所有點燃大鼠即納入點燃組。
1.3 免疫組織化學檢測
點燃組和對照組大鼠斷頭取腦后，置于10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋。取包埋后腦組織冠狀面4μm連續切片，采用Envision法染色。切片脫蠟至水后，以3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，孵育15 min，PBS洗滌；加一抗(兔抗P-S6多克隆抗體)，37℃孵育1h, PBS洗滌；加二抗37℃孵育20 min, PBS洗滌；DAB顯色后，常規蘇木精復染，脫水、透明后固定。陰性對照采用PBS作為一抗。在高倍視野下(400倍)每張切片隨機選取5個視野，對P-S6表達陽性的細胞進行計數。
1.4 統計學方法
采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。兩組陽性細胞數采用均數±標準差表示，兩組間均數比較采用t檢驗。P值＜0.05為差異有統計學意義。
結果
1 大鼠點燃模型的建立
馬桑內酯注射12~19次后，實驗組共點燃大鼠40只，死亡3只，未點燃7只，點燃率80%。點燃大鼠在給藥間期均出現5次以上5級發作。
2 免疫組織化學分析
兩組結果顯示P-S6表達陽性細胞可見細胞膜及胞漿呈棕黃色。對照組CA1區和CA2區僅有少量星形膠質細胞表達P-S6，神經元少有表達；點燃組CA1和CA3區有大量P-S6高表達細胞，且主要集中在星形膠質細胞，神經元陽性細胞數也增加(圖 1)，點燃組CA1和CA3區陽性細胞數均高于對照組陽性細胞數，差異有統計學意義(P＜0.001)，見表 1。在海馬DG區，對照組僅有少量顆粒細胞表達P-S6，而點燃組顆粒細胞及神經元陽性細胞數明顯增加，差異有統計學意義(t=12.816, P＜0.001)，見表 1。
圖1
兩組免疫組織化學P-S6蛋白表達結果?a?對照組海馬(×40)；b?點燃組海馬(×40)；c?對照組CA1區(×200)；d?點燃組CA1區(×200)；e?對照組CA3區(×200)；f?點燃組CA3區(×200)；g?點燃組DG區(×200)；h?點燃組DG區(×200)
表1
兩組陽性細胞數比較(討論
難治性癲癇的致殘率和病死率均較高，且藥物和手術治療效果均不佳，其發病機制仍是研究的難點和熱點[11]。mTOR信號通路在結節性硬化癥中的重要作用提示其可能與癲癇的發生相關[12-14]。本研究通過建立難治性癲癇大鼠模型，探究mTOR信號通路在癲癇發病機制中的作用。
本研究結果顯示，對照組有少量P-S6表達，主要集中在CA1區和CA3區的膠質細胞，DG區僅有少量顆粒細胞呈陽性；而點燃組P-S6陽性細胞在海馬各區均高于對照組，且明顯見星形膠質細胞增生。這表明在馬桑內酯點燃SD大鼠難治性癲癇模型中，mTOR信號通路過度活化可能與難治性癲癇的發病機制密切相關。Wang等[9]對馬桑內酯點燃模型的研究證實，該點燃模型對多種抗癲癇藥物耐藥，是一種穩定的難治性癲癇模型。張立霞等[15]對24例難治性癲癇患者腦組織檢測結果顯示致癇灶腦組織P-mTOR、P-S6、P-4EBP1表達均高于對照組。這可能是由于mTOR下游的P-S6活化可增加嘧啶基序列mRNA的翻譯功能，引起海馬齒狀回軸突異常發芽、細胞死亡，進而導致癲癇的發生[16-18]。Wong等[19]對肺癌耐藥機制的研究發現，mTOR信號通路能夠調控多耐藥蛋白(Multidrug resistance, Mdr1)的表達來影響肺癌的耐藥性。由于Mdr1過度活化能夠降低中樞神經系統藥物濃度[20]，是難治性癲癇的重要機制，mTOR可能影響Mdr1的表達而影響神經系統對藥物的反應。
綜上所述，本研究通過對馬桑內酯點燃大鼠難治性癲癇模型的研究，證實mTOR信號通路活化與難治性癲癇發病密切相關，但其具體機制仍需進一步基礎研究。mTOR信號通路可能是抗癲癇作用的新靶點。
癲癇是一種常見的神經系統疾病，全球約有5 000萬患者，給家庭和社會帶來了嚴重的經濟負擔[1]。盡管不斷有新型抗癲癇藥應用于臨床，仍有約30%的患者在早期正規抗癲癇治療后仍不能控制癲癇發作，即難治性癲癇[2]。目前研究認為難治性癲癇的病因可能是藥物轉運體過度表達[3]，作用靶點改變等[4]，但大多數抗癲癇藥物僅控制癲癇癥狀，因而癲癇發病機制的研究仍是目前研究的重點。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路在結節性硬化癥中過度活化，導致癲癇、智能減退等神經系統癥狀[5]，且mTOR信號通路下游P-S6在匹羅卡品、海人酸等癲癇模型均存在活化，調控細胞周期、細胞增殖等[6-8]。本研究通過構建馬桑內酯點燃難治性癲癇，檢測mTOR下游P-S6的表達，以探究mTOR在難治性癲癇發病機制中的作用，為臨床治療提供一定指導。
材料與方法
1 方法
1.1 實驗動物及試劑
選取8~10周Sprague-Dawley大鼠60只，體重180~200 g；由四川大學華西醫院實驗動物中心提供，實驗開始前在室溫下保持晝夜節律。馬桑內酯注射液由成都中醫藥大學配置，有效成分濃度為5 mg/mL。主要試劑及設備如下：兔源P-S6多克隆抗體(#5364，Cell Signaling Technology，美國)，小鼠、兔多聚物酶標通用型二抗(Introgen，美國)，DAB試劑盒(Dako，加拿大)；圖像采集系統(Olympus，日本)。
1.2 模型構建及實驗分組
將60只SD大鼠隨機分為實驗組(n=50)和對照組(n=10)。根據前期實驗結果確定馬桑內酯點燃的最佳閾下劑量，給予實驗組大鼠1.75 mg/kg肌注，每84 h重復一次[9]；同時給予對照組等體積生理鹽水肌注。根據Racine[10]的5級標準判定，在連續2次注射期間，大鼠出現5次以上5級發作即達到點燃標準，點燃大鼠每7 d給藥一次，所有點燃大鼠即納入點燃組。
1.3 免疫組織化學檢測
點燃組和對照組大鼠斷頭取腦后，置于10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋。取包埋后腦組織冠狀面4μm連續切片，采用Envision法染色。切片脫蠟至水后，以3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，孵育15 min，PBS洗滌；加一抗(兔抗P-S6多克隆抗體)，37℃孵育1h, PBS洗滌；加二抗37℃孵育20 min, PBS洗滌；DAB顯色后，常規蘇木精復染，脫水、透明后固定。陰性對照采用PBS作為一抗。在高倍視野下(400倍)每張切片隨機選取5個視野，對P-S6表達陽性的細胞進行計數。
1.4 統計學方法
采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。兩組陽性細胞數采用均數±標準差表示，兩組間均數比較采用t檢驗。P值＜0.05為差異有統計學意義。
結果
1 大鼠點燃模型的建立
馬桑內酯注射12~19次后，實驗組共點燃大鼠40只，死亡3只，未點燃7只，點燃率80%。點燃大鼠在給藥間期均出現5次以上5級發作。
2 免疫組織化學分析
兩組結果顯示P-S6表達陽性細胞可見細胞膜及胞漿呈棕黃色。對照組CA1區和CA2區僅有少量星形膠質細胞表達P-S6，神經元少有表達；點燃組CA1和CA3區有大量P-S6高表達細胞，且主要集中在星形膠質細胞，神經元陽性細胞數也增加(圖 1)，點燃組CA1和CA3區陽性細胞數均高于對照組陽性細胞數，差異有統計學意義(P＜0.001)，見表 1。在海馬DG區，對照組僅有少量顆粒細胞表達P-S6，而點燃組顆粒細胞及神經元陽性細胞數明顯增加，差異有統計學意義(t=12.816, P＜0.001)，見表 1。
圖1
兩組免疫組織化學P-S6蛋白表達結果?a?對照組海馬(×40)；b?點燃組海馬(×40)；c?對照組CA1區(×200)；d?點燃組CA1區(×200)；e?對照組CA3區(×200)；f?點燃組CA3區(×200)；g?點燃組DG區(×200)；h?點燃組DG區(×200)
表1
兩組陽性細胞數比較(討論
難治性癲癇的致殘率和病死率均較高，且藥物和手術治療效果均不佳，其發病機制仍是研究的難點和熱點[11]。mTOR信號通路在結節性硬化癥中的重要作用提示其可能與癲癇的發生相關[12-14]。本研究通過建立難治性癲癇大鼠模型，探究mTOR信號通路在癲癇發病機制中的作用。
本研究結果顯示，對照組有少量P-S6表達，主要集中在CA1區和CA3區的膠質細胞，DG區僅有少量顆粒細胞呈陽性；而點燃組P-S6陽性細胞在海馬各區均高于對照組，且明顯見星形膠質細胞增生。這表明在馬桑內酯點燃SD大鼠難治性癲癇模型中，mTOR信號通路過度活化可能與難治性癲癇的發病機制密切相關。Wang等[9]對馬桑內酯點燃模型的研究證實，該點燃模型對多種抗癲癇藥物耐藥，是一種穩定的難治性癲癇模型。張立霞等[15]對24例難治性癲癇患者腦組織檢測結果顯示致癇灶腦組織P-mTOR、P-S6、P-4EBP1表達均高于對照組。這可能是由于mTOR下游的P-S6活化可增加嘧啶基序列mRNA的翻譯功能，引起海馬齒狀回軸突異常發芽、細胞死亡，進而導致癲癇的發生[16-18]。Wong等[19]對肺癌耐藥機制的研究發現，mTOR信號通路能夠調控多耐藥蛋白(Multidrug resistance, Mdr1)的表達來影響肺癌的耐藥性。由于Mdr1過度活化能夠降低中樞神經系統藥物濃度[20]，是難治性癲癇的重要機制，mTOR可能影響Mdr1的表達而影響神經系統對藥物的反應。
綜上所述，本研究通過對馬桑內酯點燃大鼠難治性癲癇模型的研究，證實mTOR信號通路活化與難治性癲癇發病密切相關，但其具體機制仍需進一步基礎研究。mTOR信號通路可能是抗癲癇作用的新靶點。
