多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種克隆性漿細胞惡性腫瘤，其臨床表現主要有貧血、骨質破壞、腎功能不全和高鈣血癥等，發病率約占所有血液系統惡性腫瘤的10%，以65歲以上的老年人多見[1]。隨著疾病的發展可能合并骨痛、病理性骨折、腎功能衰竭等并發癥[2]。根據全球疾病負擔數據庫數據顯示，近30年來，我國MM發病數、發病率、死亡數均呈上升趨勢，嚴重威脅人民健康，帶來極重的疾病經濟負擔[3]。隨著醫療技術的不斷進步，尤其是蛋白酶體抑制劑、來那度胺及達雷妥尤單抗的應用，MM臨床結局明顯改善，患者的無進展生存期延長，但該疾病仍無法治愈，最終多數患者仍不免疾病復發死亡。MM的病因至今仍不清楚，公認的危險因素是年齡和肥胖[4-5]。肥胖會使體內積聚過多的脂肪細胞，脂肪細胞分泌多種脂肪因子，如脂聯素、瘦素和抵抗素等[6]。抵抗素是脂肪因子中的一種，是脂肪組織分泌和產生的肽激素，同時也是一種炎癥調節因子，通過激活NF-κB信號通路介導機體炎癥反應。現有研究關于抵抗素與MM風險關系研究結果不一致[7-8]。觀察性研究存在很多的局限性如數據獲取困難、易發生各種偏倚和無法直接推論因果關聯等，而孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）是一種新的流行病學研究方法，以暴露因素相關的遺傳變異為工具變量，最常用的是單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）來評估結局和暴露的因果關系，能有效避免傳統流行病學研究的混雜偏倚，同時以遺傳變異（暴露的工具變量）所解釋的變異也優于結局所解釋的變異，由此排除了反向因果問題[9]。本研究利用抵抗素和MM的全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）數據集進行兩樣本的MR分析，旨在探討抵抗素與MM之間有無因果關系。
1 資料與方法
1.1 數據來源
兩樣本MR研究的數據來源于已公開發表的GWAS匯總數據集，均可在IEU OpenGWAS project網站獲得。暴露因素抵抗素（ebi-a-GCST90012034）的GWAS數據集來自Folkersen L等發表的一項全基因組關聯分析的Meta分析，該研究共納入21 758名歐洲人，包含13 138 697個SNP[10]。結局變量MM（ieu-b-4957）的GWAS來自UK BioBank，包含了372 617名歐洲血統個體（病例組601名和對照組372 016名）。使用Plink 1.9軟件對數據集進行校正和質量控制[11]，校正內容包括研究人群的年齡、性別等因素。SNP剔除標準如下：① 最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）<0.05；② 基因型檢出率<95％；③ 不滿足Hardy-Weinberg平衡（P<1.0×10-6）；④ 鏈歧義（A/T或C/G）的SNP。MM的GWAS采用BOLT-LMM算法，該方法使用線性混合模型計算用于分析表型和基因型之間關聯的統計，并針對性別和基因型陣列進行調整。因BOLT-LMM關聯統計是線性，因此根據UK BioBank數據庫說明，通過轉化，認為log OR≈β/［μ（1?μ）］并將其轉換為對數優勢比，用于MM的遺傳關聯，其中β表示BOLT-LMA報告的效應值大小，μ值為個案分數［μ=ncase/（ncase+ncontrol）］。同理，SE值為se/μ（1?μ）[12]。然后采用兩種樣本MR方法，使用GWAS匯總統計推斷抵抗素和MM之間的因果關系。
1.2 工具變量的篩選
評估抵抗素和MM的因果關系，本研究選擇SNP作為變量工具應滿足以下標準：① SNP與抵抗素之間高度相關，顯著性閾值為P<5×10?8；② 避免由連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）產生的偏移，R軟件設置參數條件r2=0.001，kb=10 000，選擇彼此相互獨立的SNP作為工具變量；③ 去混雜：選擇作為工具變量的SNP與混雜因素不相關，通過PhenoScanner網站對每個SNP進行檢測，與BMI、年齡相關的SNP被排除。
使用F統計量檢驗弱工具變量偏倚，采用抵抗素GWAS研究SNP的β和SE值計算每個SNP的F值，即F≈（β/SE）2。F>10定義為強工具變量，而F<10的SNP將被定義為弱工具變量，在MR分析中將被排除，確保工具變量與抵抗素強相關。
1.3 統計分析
本研究通過以下5種MR方法來估計抵抗素與MM之間的關系：逆方差加權（inverse-variance weighted，IVW）分析、加權中位數法、MR-Egger、簡單模式、加權模式，其中主要方法是IVW分析。由于結局是二分類變量，本研究需將MR結果轉換為優勢比（odds ratio，OR）評估抵抗素與MM之間的潛在的因果關系。以P<0.05為差異有統計學意義。
本研究使用水平多效性檢驗、異質性檢驗、leave-one-out法和異常值（MR-PRESSO）進行敏感性分析，確保結果的穩定和可靠。利用MR-Egger回歸分析來檢測選擇的SNP是否具有水平多效性，其回歸截距可以評估多效性的大小，越接近于0，則基因的多效性的可能性越小。異質性檢驗Q-pval>0.05則認為納入的工具變量不存在異質性，可以忽略異質性對因果效應產生的影響。MR-PRESSO檢驗以檢測潛在的異常值并獲取矯正后的估計。leave-one-out法逐步剔除每個SNP，計算剩余SNP的效應值變化大小。若剔除某個SNP后，結果發生很大改變，說明此SNP對結果影響很大，為敏感SNP，需要剔除該SNP，重新進行MR分析。MR分析均使用R 4.2.1軟件進行，R軟件包包括“TwoSampleMR”和“MR-PRESSO”。
2 結果
2.1 納入數據的基本特征
納入數據的基本特征見表1。
表1
納入數據的基本特征
2.2 MR分析
從暴露數據集中提取13個與抵抗素強相關系的SNP，在結局數據集中找到11個SNP可以作為工具變量進行MR分析。弱工具變量分析，SNP的F統計量均>10，其F值范圍為39.600～197.650，均為強工具變量，無弱工具變量對結果產生偏倚（表2）。MR分析結果顯示：IVW［OR=0.980，95%CI（0.636，1.511），P=0.930］、MR-Egger［OR=0.662，95%CI（0.331，1.322），P=0.272］、加權中位數法［OR=0.963，95%CI（0.576，1.609），P=0.886］、簡單模式［OR=0.935，95%CI（0.435，2.009），P=0.866］、加權模式［OR=0.953，95%CI（0.559，1.624），P=0.862］，5種方法均提示血清抵抗素水平與MM發生風險之間沒有因果關系。MR分析結果見表3、圖1和圖2。
表2
孟德爾隨機化分析SNP工具變量及信息表
表3
孟德爾隨機化分析結果
圖1
孟德爾隨機化分析結果散點圖
圖2
孟德爾隨機化分析結果森林圖
2.3 敏感性分析
異質性檢驗：我們進行異質性分析IVW檢驗（Q=12.419，P=0.257）和MR-Egger檢驗（Q=10.226，P=0.332），在MM中未觀察到明顯的異質性。水平多效性分析：MR-Egger回歸分析結果顯示無水平多態性的證據（截距為0.054，P=0.198）；離群值分析：使用MR-PRESSO沒有發現離群的SNP，確保了結果的準確性。leave-one-out法分析結果表明，沒有單個SNP影響到總體MR估計（圖3）。
圖3
leave-one-out法敏感性分析結果
3 討論
本研究基于公開的GWAS匯總數據，選取與抵抗素高度相關的11個SNP作為工具變量，使用兩樣本MR法探索抵抗素與MM的因果關系，結果表明二者不存在因果關聯。
影響MM的發生因素較多，研究顯示年齡、肥胖、MM家族史、吸煙、化工相關職業是MM的危險因素[13-14]。同時既往研究認為抵抗素可能與MM的發生發展相關。一項病例-對照研究（73例MM病例和73例對照）觀察到MM患者血清抵抗素水平低，認為低水平的抵抗素可能與MM發病相關[15]，此研究中抵抗素的檢測是在確診MM后進行的，無法確定暴露因素與結局的因果關系。Santo等[7]測量來自3個MM前瞻隊列研究聯盟的178個MM病例和358個對照者在MM診斷前外周血樣本中抵抗素水平，發現較高水平的抵抗素與較低MM發病風險有弱相關，分層結果發現在男性中，觀察到抵抗素水平較高的人群中MM發生風險降低，與女性MM風險無關，其結論認為高水平抵抗素也許能夠減少MM的發病風險。然而此研究中有52.3%的患者血樣留取時間距離診斷時間大于7年，所用檢測方法為ELISA法，而抵抗素為多肽物質，易發生降解，無法長期保存，故而尚不能確定所測量的抵抗素水平是否能反應真實水平。另一項系統評價[16]研究發現，MM患者和對照組之間循環抵抗素水平差異不顯著，與前者研究結果不一致。Pang等[17]研究發現抵抗素可以通過NF-κB和PI3K/Akt途徑誘導多藥耐受（美法侖、硼替佐米和卡非佐米），此外，抵抗素還可以通過DNA甲基轉移酶DNMT/ATP結合盒轉運軸促進表觀遺傳學上的藥物排出[18-19]，證明抵抗素可在耐藥性中發揮作用。上述研究并未能夠明確抵抗素與MM發病之間存在因果關系，但提示抵抗素可能影響MM對于治療的反應性。
針對抵抗素與MM的觀察性研究容易受到環境、遺傳、免疫狀況、種族、精神心理等多種因素的影響，且不能完全排除反向因果關系的影響，從而導致抵抗素與MM之間出現虛假關聯。為明確抵抗素與MM之間是否存在因果關系，MR可以解決觀察性研究的局限性問題。應用MR研究需滿足3個假設：① 工具變量與暴露因素（抵抗素）有唯一關聯；② 工具變量與混雜因素無關聯；③ 工具變量僅能通過暴露因素與結局（MM）有關聯[20-22]。MR同時存在一定局限，孟德爾第二定律并非對所有遺傳變異適用，存在連鎖不平衡，此外基因作為工具變量無法避免弱工具、人群分層及發育代償等問題造成的偏倚[23-25]。我們的研究最終選擇11個SNP在GWAS研究中與MM相關，且與混雜因素（年齡、肥胖）不相關。本研究采用5種不同的方法（IVW、加權中位數法、MR-Egger法、簡單模式法、加權模式法）進行MR分析，結果顯示5種方法分析得到的結果一致，均不支持抵抗素與MM風險之間存在因果關系，不支持抵抗素是MM的危險因素。使用MR-Egeer回歸分析結果顯示截距數值接近0（P>0.05），表明研究結果不受基因多效性帶來偏倚的影響。進一步利用IVW和MR-Egeer法對篩選的SNP進行異質性檢驗，未觀察到異質性；同時使用MR-PRESSO也未觀察到離群值的存在。最后，在本研究中使用leave-one-out法分析發現，單個SNP不能對結果的穩健性產生影響。通過上述敏感性分析結果確保本研究結果的穩定和可靠性。
本研究的局限性：① 本研究納入的只有歐洲血統人群，因此在其他民族、國家和地區之間是否存在基因差異，仍需要進一步驗證；② 有研究發現抵抗素與男性MM患者相關，但本研究無詳細的臨床信息，不能進行年齡、性別亞組分析，因而不能分析亞組間是否存在因果聯系；③ 本研究只是統計學結果，無法進一步探討抵抗素與MM之間的生物學機制。
綜上所述，該研究從基因水平證明了抵抗素與MM之間無顯著因果關系，為研究二者之間的關聯提供了更多證據。同時有研究顯示在MM發病后，抵抗素可能造成耐藥，因此在后續的研究中可探討抵抗素在MM細胞與脂肪細胞的交互影響與耐藥機制中的作用，并且進行抵抗素與MM發病的生物機制研究，為提高MM的治療效果提供新思路。
多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種克隆性漿細胞惡性腫瘤，其臨床表現主要有貧血、骨質破壞、腎功能不全和高鈣血癥等，發病率約占所有血液系統惡性腫瘤的10%，以65歲以上的老年人多見[1]。隨著疾病的發展可能合并骨痛、病理性骨折、腎功能衰竭等并發癥[2]。根據全球疾病負擔數據庫數據顯示，近30年來，我國MM發病數、發病率、死亡數均呈上升趨勢，嚴重威脅人民健康，帶來極重的疾病經濟負擔[3]。隨著醫療技術的不斷進步，尤其是蛋白酶體抑制劑、來那度胺及達雷妥尤單抗的應用，MM臨床結局明顯改善，患者的無進展生存期延長，但該疾病仍無法治愈，最終多數患者仍不免疾病復發死亡。MM的病因至今仍不清楚，公認的危險因素是年齡和肥胖[4-5]。肥胖會使體內積聚過多的脂肪細胞，脂肪細胞分泌多種脂肪因子，如脂聯素、瘦素和抵抗素等[6]。抵抗素是脂肪因子中的一種，是脂肪組織分泌和產生的肽激素，同時也是一種炎癥調節因子，通過激活NF-κB信號通路介導機體炎癥反應。現有研究關于抵抗素與MM風險關系研究結果不一致[7-8]。觀察性研究存在很多的局限性如數據獲取困難、易發生各種偏倚和無法直接推論因果關聯等，而孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）是一種新的流行病學研究方法，以暴露因素相關的遺傳變異為工具變量，最常用的是單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）來評估結局和暴露的因果關系，能有效避免傳統流行病學研究的混雜偏倚，同時以遺傳變異（暴露的工具變量）所解釋的變異也優于結局所解釋的變異，由此排除了反向因果問題[9]。本研究利用抵抗素和MM的全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）數據集進行兩樣本的MR分析，旨在探討抵抗素與MM之間有無因果關系。
1 資料與方法
1.1 數據來源
兩樣本MR研究的數據來源于已公開發表的GWAS匯總數據集，均可在IEU OpenGWAS project網站獲得。暴露因素抵抗素（ebi-a-GCST90012034）的GWAS數據集來自Folkersen L等發表的一項全基因組關聯分析的Meta分析，該研究共納入21 758名歐洲人，包含13 138 697個SNP[10]。結局變量MM（ieu-b-4957）的GWAS來自UK BioBank，包含了372 617名歐洲血統個體（病例組601名和對照組372 016名）。使用Plink 1.9軟件對數據集進行校正和質量控制[11]，校正內容包括研究人群的年齡、性別等因素。SNP剔除標準如下：① 最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）<0.05；② 基因型檢出率<95％；③ 不滿足Hardy-Weinberg平衡（P<1.0×10-6）；④ 鏈歧義（A/T或C/G）的SNP。MM的GWAS采用BOLT-LMM算法，該方法使用線性混合模型計算用于分析表型和基因型之間關聯的統計，并針對性別和基因型陣列進行調整。因BOLT-LMM關聯統計是線性，因此根據UK BioBank數據庫說明，通過轉化，認為log OR≈β/［μ（1?μ）］并將其轉換為對數優勢比，用于MM的遺傳關聯，其中β表示BOLT-LMA報告的效應值大小，μ值為個案分數［μ=ncase/（ncase+ncontrol）］。同理，SE值為se/μ（1?μ）[12]。然后采用兩種樣本MR方法，使用GWAS匯總統計推斷抵抗素和MM之間的因果關系。
1.2 工具變量的篩選
評估抵抗素和MM的因果關系，本研究選擇SNP作為變量工具應滿足以下標準：① SNP與抵抗素之間高度相關，顯著性閾值為P<5×10?8；② 避免由連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）產生的偏移，R軟件設置參數條件r2=0.001，kb=10 000，選擇彼此相互獨立的SNP作為工具變量；③ 去混雜：選擇作為工具變量的SNP與混雜因素不相關，通過PhenoScanner網站對每個SNP進行檢測，與BMI、年齡相關的SNP被排除。
使用F統計量檢驗弱工具變量偏倚，采用抵抗素GWAS研究SNP的β和SE值計算每個SNP的F值，即F≈（β/SE）2。F>10定義為強工具變量，而F<10的SNP將被定義為弱工具變量，在MR分析中將被排除，確保工具變量與抵抗素強相關。
1.3 統計分析
本研究通過以下5種MR方法來估計抵抗素與MM之間的關系：逆方差加權（inverse-variance weighted，IVW）分析、加權中位數法、MR-Egger、簡單模式、加權模式，其中主要方法是IVW分析。由于結局是二分類變量，本研究需將MR結果轉換為優勢比（odds ratio，OR）評估抵抗素與MM之間的潛在的因果關系。以P<0.05為差異有統計學意義。
本研究使用水平多效性檢驗、異質性檢驗、leave-one-out法和異常值（MR-PRESSO）進行敏感性分析，確保結果的穩定和可靠。利用MR-Egger回歸分析來檢測選擇的SNP是否具有水平多效性，其回歸截距可以評估多效性的大小，越接近于0，則基因的多效性的可能性越小。異質性檢驗Q-pval>0.05則認為納入的工具變量不存在異質性，可以忽略異質性對因果效應產生的影響。MR-PRESSO檢驗以檢測潛在的異常值并獲取矯正后的估計。leave-one-out法逐步剔除每個SNP，計算剩余SNP的效應值變化大小。若剔除某個SNP后，結果發生很大改變，說明此SNP對結果影響很大，為敏感SNP，需要剔除該SNP，重新進行MR分析。MR分析均使用R 4.2.1軟件進行，R軟件包包括“TwoSampleMR”和“MR-PRESSO”。
2 結果
2.1 納入數據的基本特征
納入數據的基本特征見表1。
表1
納入數據的基本特征
2.2 MR分析
從暴露數據集中提取13個與抵抗素強相關系的SNP，在結局數據集中找到11個SNP可以作為工具變量進行MR分析。弱工具變量分析，SNP的F統計量均>10，其F值范圍為39.600～197.650，均為強工具變量，無弱工具變量對結果產生偏倚（表2）。MR分析結果顯示：IVW［OR=0.980，95%CI（0.636，1.511），P=0.930］、MR-Egger［OR=0.662，95%CI（0.331，1.322），P=0.272］、加權中位數法［OR=0.963，95%CI（0.576，1.609），P=0.886］、簡單模式［OR=0.935，95%CI（0.435，2.009），P=0.866］、加權模式［OR=0.953，95%CI（0.559，1.624），P=0.862］，5種方法均提示血清抵抗素水平與MM發生風險之間沒有因果關系。MR分析結果見表3、圖1和圖2。
表2
孟德爾隨機化分析SNP工具變量及信息表
表3
孟德爾隨機化分析結果
圖1
孟德爾隨機化分析結果散點圖
圖2
孟德爾隨機化分析結果森林圖
2.3 敏感性分析
異質性檢驗：我們進行異質性分析IVW檢驗（Q=12.419，P=0.257）和MR-Egger檢驗（Q=10.226，P=0.332），在MM中未觀察到明顯的異質性。水平多效性分析：MR-Egger回歸分析結果顯示無水平多態性的證據（截距為0.054，P=0.198）；離群值分析：使用MR-PRESSO沒有發現離群的SNP，確保了結果的準確性。leave-one-out法分析結果表明，沒有單個SNP影響到總體MR估計（圖3）。
圖3
leave-one-out法敏感性分析結果
3 討論
本研究基于公開的GWAS匯總數據，選取與抵抗素高度相關的11個SNP作為工具變量，使用兩樣本MR法探索抵抗素與MM的因果關系，結果表明二者不存在因果關聯。
影響MM的發生因素較多，研究顯示年齡、肥胖、MM家族史、吸煙、化工相關職業是MM的危險因素[13-14]。同時既往研究認為抵抗素可能與MM的發生發展相關。一項病例-對照研究（73例MM病例和73例對照）觀察到MM患者血清抵抗素水平低，認為低水平的抵抗素可能與MM發病相關[15]，此研究中抵抗素的檢測是在確診MM后進行的，無法確定暴露因素與結局的因果關系。Santo等[7]測量來自3個MM前瞻隊列研究聯盟的178個MM病例和358個對照者在MM診斷前外周血樣本中抵抗素水平，發現較高水平的抵抗素與較低MM發病風險有弱相關，分層結果發現在男性中，觀察到抵抗素水平較高的人群中MM發生風險降低，與女性MM風險無關，其結論認為高水平抵抗素也許能夠減少MM的發病風險。然而此研究中有52.3%的患者血樣留取時間距離診斷時間大于7年，所用檢測方法為ELISA法，而抵抗素為多肽物質，易發生降解，無法長期保存，故而尚不能確定所測量的抵抗素水平是否能反應真實水平。另一項系統評價[16]研究發現，MM患者和對照組之間循環抵抗素水平差異不顯著，與前者研究結果不一致。Pang等[17]研究發現抵抗素可以通過NF-κB和PI3K/Akt途徑誘導多藥耐受（美法侖、硼替佐米和卡非佐米），此外，抵抗素還可以通過DNA甲基轉移酶DNMT/ATP結合盒轉運軸促進表觀遺傳學上的藥物排出[18-19]，證明抵抗素可在耐藥性中發揮作用。上述研究并未能夠明確抵抗素與MM發病之間存在因果關系，但提示抵抗素可能影響MM對于治療的反應性。
針對抵抗素與MM的觀察性研究容易受到環境、遺傳、免疫狀況、種族、精神心理等多種因素的影響，且不能完全排除反向因果關系的影響，從而導致抵抗素與MM之間出現虛假關聯。為明確抵抗素與MM之間是否存在因果關系，MR可以解決觀察性研究的局限性問題。應用MR研究需滿足3個假設：① 工具變量與暴露因素（抵抗素）有唯一關聯；② 工具變量與混雜因素無關聯；③ 工具變量僅能通過暴露因素與結局（MM）有關聯[20-22]。MR同時存在一定局限，孟德爾第二定律并非對所有遺傳變異適用，存在連鎖不平衡，此外基因作為工具變量無法避免弱工具、人群分層及發育代償等問題造成的偏倚[23-25]。我們的研究最終選擇11個SNP在GWAS研究中與MM相關，且與混雜因素（年齡、肥胖）不相關。本研究采用5種不同的方法（IVW、加權中位數法、MR-Egger法、簡單模式法、加權模式法）進行MR分析，結果顯示5種方法分析得到的結果一致，均不支持抵抗素與MM風險之間存在因果關系，不支持抵抗素是MM的危險因素。使用MR-Egeer回歸分析結果顯示截距數值接近0（P>0.05），表明研究結果不受基因多效性帶來偏倚的影響。進一步利用IVW和MR-Egeer法對篩選的SNP進行異質性檢驗，未觀察到異質性；同時使用MR-PRESSO也未觀察到離群值的存在。最后，在本研究中使用leave-one-out法分析發現，單個SNP不能對結果的穩健性產生影響。通過上述敏感性分析結果確保本研究結果的穩定和可靠性。
本研究的局限性：① 本研究納入的只有歐洲血統人群，因此在其他民族、國家和地區之間是否存在基因差異，仍需要進一步驗證；② 有研究發現抵抗素與男性MM患者相關，但本研究無詳細的臨床信息，不能進行年齡、性別亞組分析，因而不能分析亞組間是否存在因果聯系；③ 本研究只是統計學結果，無法進一步探討抵抗素與MM之間的生物學機制。
綜上所述，該研究從基因水平證明了抵抗素與MM之間無顯著因果關系，為研究二者之間的關聯提供了更多證據。同時有研究顯示在MM發病后，抵抗素可能造成耐藥，因此在后續的研究中可探討抵抗素在MM細胞與脂肪細胞的交互影響與耐藥機制中的作用，并且進行抵抗素與MM發病的生物機制研究，為提高MM的治療效果提供新思路。
