引用本文： 吳永紅, 王可, 劉春濤. PDK1抑制劑對煙熏誘導的慢性阻塞性肺疾病小鼠模型體內PGE2表達的干預作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(5): 349-355. doi: 10.7507/1671-6205.202208038 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種慢性氣道炎癥性疾病，炎性細胞異常活化是病情發生與發展的主要病理基礎，其中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是不容忽視的炎癥因子之一[1-2]。近年來研究發現，慢阻肺急性加重期患者血清及誘導痰中PGE2水平明顯高于慢阻肺緩解期，而且慢阻肺急性加重和慢阻肺穩定期痰中PGE2水平均高于健康對照組，說明了PGE2參與慢阻肺的炎癥過程，PGE2可能與慢阻肺患者慢性氣道炎癥的發生發展有關[3-4]。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（3-phosphoinositede dependent protein kinase-1，PDK1）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PDK1信號系統在細胞生長、存活以及血管形成中均起到重要的作用[5]。研究發現，煙熏大鼠模型肺泡灌洗液PGE2分泌增加，同時氣道上皮PDK1 表達增加[6]。但目前尚不清楚香煙等理化因素是否會通過刺激氣道上皮PGE2分泌、調控PDK1的表達從而影響了氣道的慢性炎癥？PDK1抑制劑能否干預PGE2的表達從而減輕氣道的慢性炎癥？因此，本研究擬通過體內實驗探討PDK1抑制劑對PGE2的干預作用，為控制氣道炎癥，預防與治療慢阻肺提供新的思路。
1 資料與方法
1.1 實驗動物
SPF級別C57BL/6雄性小鼠50只，鼠齡8～10周，體重在19～23 g，小鼠購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，飼養在四川大學華西科技園動物實驗中心SPF級別動物房，分籠飼養，每一籠小鼠5只，飼料為高溫高壓滅菌飼料，均給予同樣的條件喂養，并給予12 h光照和12 h黑暗環境進行交替循環。本動物實驗通過了四川大學華西醫院動物倫理委員會的批準，倫理備案號：2020356A。
1.2 主要設備和試劑
小鼠經鼻煙熏霧化裝置、固定流量泵（美國CH Technologies），洗板機、酶標儀（美國Bio-rad），低溫研磨儀（中國Servicebio），低溫離心機（美國BECKMAN），小動物霧化給藥儀（山東濟南益延科技發展有限公司），小動物肺功能儀（美國BUXCO），渦旋震蕩儀（北京優晟聯合科技有限公司），掌上離心機（四川川奕生物公司）；細胞甩片機（美國Wescor）；細胞計數（Count star），PDK1抑制劑OSU-03012（美國Selleck Chemicals），PGE2酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特公司），萬寶路香煙（美國Marlboro），戊巴比妥鈉粉劑（山東西亞化學工業有限公司），PAS染色試劑盒（Solarbio Science），蘇木素、伊紅和苯胺藍染色液均購自珠海貝索生物技術有限公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 慢阻肺小鼠模型的構建
按照文獻［7］提供的方法，對小鼠進行熏煙處理。用萬寶路香煙（每支香煙含有尼古丁1.0 mg，11 mg煤焦油）進行熏煙，每日兩次，每次75 min，每周煙熏5 d，持續12周。每天熏煙結束后送回動物房，飼養條件同前。
1.3.2 實驗小鼠分組及處理
將小鼠隨機分為五組，每組10只，分別為正常對照組（簡稱對照組）、熏煙組、熏煙+低劑量PDK1抑制劑組（簡稱低劑量組）、熏煙+中劑量PDK1抑制劑組（簡稱中劑量組）、熏煙+高劑量PDK1抑制劑組（簡稱高劑量組）。處理方法如下：對照組，小鼠每日霧化吸入磷酸鹽緩沖液2次，每次吸入75 min，每周吸入5 d，持續12周；熏煙組，用以上方法熏煙，每日2次，每次75 min，每周煙熏5 d，持續12周，每日熏煙前腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.5 mL；低劑量組：熏煙方法與時間同熏煙組，每天熏煙前腹腔注射PDK1抑制劑0.25 mg/kg+0.9%氯化鈉注射液，總量0.5 mL；中劑量組：熏煙方法與時間同熏煙組，每天熏煙前腹腔注射PDK1抑制劑0.5 mg/kg+0.9%氯化鈉注射液，總量0.5 mL；高劑量組：熏煙方法與時間同熏煙組，每天熏煙前腹腔注射PDK1抑制劑1.0 mg/kg+0.9%氯化鈉注射液，總量0.5 mL。每組小鼠分籠飼養，每周對小鼠稱重1次，在每組籠位及小鼠固定器上均用不同顏色的貼紙做好標識，避免出現差錯。
1.3.3 動物模型肺功能測試
熏煙結束后，稱取每只小鼠的體重。經腹腔注射2%戊巴比妥鈉注射液（0.2～0.3 mL/只）麻醉小鼠，在小鼠呼吸變緩慢均勻后，切開小鼠頸部暴露氣管并切開，放入小動物肺功能儀器中以獲取肺功能結果，分別獲得第100秒和第200秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 100 seconds and 200 seconds，分別簡稱FEV100和FEV200），以及用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、肺總量（total lung capacity，TLC）、功能殘氣量（functional residual capacity，FRC）等肺功能結果，連續測量3次，取平均值[8]。
1.3.4 動物模型處理及標本收集
小鼠肺功能測試結束后，將其固定于操作板上，消毒后剪開胸腔，暴露心臟，1 mL注射器從右心室緩慢抽取血液，每只小鼠采血量大約為0.6～0.8 mL，離心后吸取上層血清收集在EP管中，放入–80 °C冰箱凍存以備用。小鼠死亡后，用止血鉗夾住右肺主支氣管后，左肺行肺泡灌洗，灌洗液總量1.5 mL，回收支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）約1.2 mL。同時收集BALF底部的細胞進行細胞計數。剪下右肺主支氣管及右肺，放入包埋盒固定。
1.3.5 血清和BALF中PGE2的測定
將上述收集好的BALF離心后吸取BALF的上清液放置入–80 °C冰箱凍存，待所有標本收集好后，取出凍存的血清，用酶聯免疫吸附試驗測定血清與BALF中的PGE2濃度。
1.3.6 BALF細胞計數
收集離心后的BALF底部的細胞，裂解，離心，重懸，用甩片機甩片，瑞姬氏染色，光學顯微鏡上進行細胞分類計數，高倍視野下計數400個細胞，統計其中巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的百分比。
1.3.7 石蠟切片的染色
按照文獻［9］的方法進行石蠟切片，制片完成后行蘇木素–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在顯微鏡下觀察肺氣腫發生情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS 22.0進行統計分析。根據數據的分布類型，用均數±標準差（
±s）進行數據描述。兩組之間的比較時，正態分布使用t檢驗，非正態分布使用Mann-Whitney檢驗。多組之間的比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）。實驗結果經方差齊性和正態分布檢驗，方差齊性采用 LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane’s t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組小鼠一般情況比較
12周實驗結束時，19只小鼠死亡，其中熏煙組小鼠死亡5只，低劑量組死亡4只，中劑量組死亡5只，高劑量組死亡5只。死亡原因包括不耐受煙熏、腹腔藥物注射以及動物固定。對照組小鼠飼養12周后精神好，毛色黑亮，行動自如，體重增加。其他組小鼠均出現精神差，毛色變黃脫落，消瘦，體重減輕等情況，以熏煙組小鼠最為明顯，高劑量組小鼠程度最輕。實驗前后小鼠體重變化見表1。
表1
處理前后各組小鼠體重比較［g，（ 
）］
2.2 各組小鼠肺功能分析
與對照組相比，各熏煙組小鼠FEV100/FVC和FEV200/FVC均有明顯的下降，差異有統計學意義（均P=0.00），熏煙組和低劑量組的TLC和FRC明顯增加，差異有統計學意義（均P=0.00）；與熏煙組相比，中劑量組和和高劑量組小鼠FEV100/FVC、FEV200/FVC均有明顯上升，TLC和FRC有明顯的下降，差異有統計學意義（均P=0.00），而低劑量組的FEV100/FVC（P=0.956）、FEV200/FVC（P=0.387）、TLC（P=0.296）和FRC（P=0.229）與熏煙組相比，差異均無統計學意義。結果見圖1。
圖1
各組小鼠肺功能比較
a. FEV100/FVC；b. FEV200/FVC；c. TLC；d. FRC。*與對照組比較，
2.3 各組小鼠BALF細胞計數分析
對照組小鼠BALF中細胞總數少，以巨噬細胞為主，占比約90%。各熏煙組小鼠BALF中細胞總數和中性粒細胞百分比均顯著增加，而巨噬細胞百分比明顯減少，與對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。低劑量組的BALF細胞總數、中性粒細胞百分比和巨噬細胞百分比均同熏煙組相似，差異無統計學意義（P<0.05）。隨著PDK1抑制劑劑量的升高，BALF細胞總數和中性粒細胞百分比逐漸降低，而巨噬細胞百分比逐漸升高。中劑量組和高劑量組的三個觀察指標，即細胞總數、中性粒細胞百分比和巨噬細胞百分比，介于對照組和熏煙組之間，差異均有統計學意義（均P<0.05）。結果見表2。
表2
各組小鼠BALF細胞總數及主要細胞占比比較（
）
2.4 各組小鼠血清和BALF中PGE2檢測結果比較
與對照組相比，各熏煙組小鼠血清及BALF的PGE2濃度均升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與熏煙組相比，中劑量組與高劑量組小鼠的血清及BALF的PGE2濃度均有所下降，差異有統計學意義（P<0.05）。而同時，低劑量組小鼠血清和BALF中PGE2濃度與熏煙組相比下降不明顯，差異無統計學意義（P值分別為0.579、0.057）；而中劑量組與高劑量組中血清和BALF中PGE2的濃度比較，差異無統計學意義（P值分別為0.756、0.325）。結果見表3、圖2。
表3
各組小鼠血清和BALF中PGE2濃度比較（
）
圖2
各組小鼠BALF和血清中PGE2濃度比較
a. BALF；b. 血清。*與對照組比較，
2.5 各組小鼠肺組織切片HE染色比較
對照組小鼠氣道壁結構清楚，氣道上皮排列整齊，未見明顯上皮脫落，肺泡結構完整，肺小血管壁未見增厚（圖3a、b）；熏煙組小鼠細支氣管、肺泡管、肺泡囊內均存在大量氣道黏液阻塞，炎性細胞浸潤，氣道上皮排列紊亂、部分脫落、局部氣道上皮增生，管壁厚，支氣管平滑肌增厚，同時觀察到肺泡壁變薄，肺泡擴張融合，肺泡間隔、肺泡壁斷裂破壞，管壁周圍及肺間質可見炎性細胞浸潤（圖3c、d）；低劑量組小鼠氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤等情況與熏煙組相比略微減輕，差別不明顯，氣道上皮排列紊亂、局部氣道上皮增生，管壁厚，支氣管平滑肌增厚，同時觀察到肺泡壁變薄，肺泡擴張融合，程度與熏煙組差別不明顯（圖3e、f）；中劑量組小鼠可見氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤情況較熏煙組減輕，氣道上皮排列紊亂，肺泡擴張融合程度較熏煙組減輕 （圖3g、h）；高劑量組小鼠可見氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤情況較熏煙組明顯減輕，氣道上皮排列紊亂，肺泡擴張融合較熏煙組減輕（圖3i、j）。
圖3
各組小鼠肺組織病理檢查像（蘇木素–伊紅×20）
a、b. 對照組；c、d. 熏煙組；e、f. 低劑量組；g、h. 中劑量組；i、j. 高劑量組。a、c、e、g、i. 氣道；b、d、f、h、j. 肺泡。對照組小鼠氣道和肺泡結構清晰；熏煙組小鼠支氣管及肺泡內大量黏液阻塞，炎性細胞浸潤，肺泡壁變薄，肺泡擴張融合；低劑量組小鼠氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤熏煙組相比略微減輕，肺泡擴張融合程度與熏煙組差別不明顯；中劑量組小鼠氣道黏液阻塞、炎性細胞浸潤情況及肺泡擴張融合程度較熏煙組減輕 ；高劑量組小鼠氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤情況較熏煙組明顯減輕，肺泡擴張融合較熏煙組減輕。
3 討論
慢性阻塞性肺疾病全球倡議指出， 慢阻肺的實質是發生在氣道、肺血管和肺泡的一種慢性炎癥。在香煙等理化因素刺激下，氣道上皮細胞和肺泡巨噬細胞會釋放多種炎癥因子，誘導局部以及全身炎癥反應[1]。其中，PGE2作為一種重要的炎癥因子，在慢阻肺的慢性氣道炎癥中發揮重要的作用[10]。PGE2是一個氣道中多種細胞均能分泌的介質，如樹突狀細胞、炎癥細胞和氣道平滑肌細胞，在體內花生四烯酸經環氧化酶（cyclooxygenase， COX）和PG合成酶分解產生PGE2，是體內對生理性、化學刺激、激素、或炎癥信號的反應[11]。有研究表明，香煙煙霧暴露能夠上調COX-2表達，從而增加PGE2分泌，擴張血管并使其通透性增加，同時支氣管黏膜水腫，腺體分泌大量滲出，導致氣道阻塞，加重了氣流受限，因而引起肺功能的下降，導致慢阻肺急性加重與嚴重并發癥的發生[12-13]。近年來研究發現，慢阻肺急性加重患者血清及誘導痰中PGE2水平明顯高于慢阻肺緩解期，而且慢阻肺急性加重和慢阻肺穩定期痰中PGE2水平均高于健康對照組。慢阻肺急性加重患者誘導痰中PGE2水平與中性粒細胞數呈正相關， 與FEV1占預計值百分比呈負相關，表明了PGE2參與慢阻肺的炎癥過程，誘導痰中PGE2水平可以作為評估慢阻肺嚴重程度的指標[2, 14]。
PDK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是AGC激酶家族中的成員之一。PDK1被認為在腫瘤細胞的生長、生存和腫瘤血管生成中起關鍵作用[15]。OSU-03012是PDK1抑制劑，是COX-2抑制劑Celecoxib的衍生物[16]。COX-2是PGE2合成的限速酶，通過介導PI3K/PDK1/AKT信號通路參與多種惡性腫瘤的發生，被視作潛在的惡性腫瘤治療靶點[17]。在PI3K/PDK1/AKT信號通路中，PDK1通過激活AKT蛋白上的Thr308和Ser473 位點磷酸化，使AKT被磷酸化而激活，進一步激活下游多種效應分子，從而調節細胞生長、分裂、增殖以及凋亡的全過程[18-19]。在此途徑中，PDK1是關鍵性的蛋白激酶，起著中樞性樞紐的作用。OSU-03012通過抑制PDK1的活性，阻斷PDK1對下游效應分子的調控，從而抑制細胞增殖、促進分化及凋亡，改變細胞生物學特性[20]。而PI3K/PDK1/AKT信號通路在肺部疾病，尤其是慢性氣道炎癥性疾病中也起著至關重要的作用[21]。由此我們推測，作為PDK1抑制劑的OSU-03012有可能通過阻斷PDK1對下游效應分子的活化而調控氣道炎癥。研究發現，在煙熏大鼠慢阻肺模型中，測定PGE2分泌增加，同時氣道上皮PDK1表達增加[6]。目前為止尚不明確，PDK1是否可能通過調控PGE2的分泌影響慢阻肺患者的氣道炎癥。
本研究中，通過煙熏小鼠12周后FEV100/FVC和FEV200/FVC與對照組相比均有明顯的下降，說明煙熏小鼠造模慢阻肺是成功的。此外，而低劑量組的各項肺功能指標與熏煙組相比均未見明顯差異，而中劑量組和高劑量組小鼠FEV100/FVC和FEV200/FVC明顯升高，TLC和FRC有降低，說明使用PDK1抑制劑后小鼠肺功能有改善，且這種改善與劑量呈正相關。
煙熏小鼠12周后肺組織HE染色后可見，大量炎癥細胞浸潤，氣管壁增厚，肺泡腔擴張，肺泡壁變薄，肺泡壁斷裂融合，肺大皰形成，肺泡數目顯著減少等病理改變，均符合慢阻肺的病理改變，進一步表明煙熏小鼠慢阻肺模型建立成功。熏煙小鼠的BALF中發現炎性細胞明顯增多，中性粒細胞升高，說明煙熏小鼠的慢阻肺存在明顯的氣道炎癥改變。而同時，發現煙熏小鼠的血清和BALF中PGE2濃度較對照組小鼠明顯增高，這些均提示煙熏小鼠慢阻肺中PGE2分泌增加，同時氣道炎癥也更明顯，這與既往的研究得出的結論相似。而使用低劑量PDK1抑制劑，仍可見炎性細胞浸潤、黏液阻塞以及肺泡擴張等改變略有減輕，BALF中也可見炎性細胞減少，同時，血清和BALF中的PGE2濃度也降低，但變化不明顯；而中劑量組與高劑量組均可見炎性細胞浸潤減少，肺泡壁變薄和肺泡擴張等情況好轉，BALF中提示炎性細胞進一步減少，血清和BALF中PGE2降低，而高劑量組改善更加明顯。慢阻肺患者氣道炎癥明顯，同時PGE2分泌也增多，而使用PDK1抑制劑能夠降低PGE2的分泌，同時減輕氣道炎癥，而且隨著劑量的增加，減輕氣道炎癥及降低PGE2分泌的作用更加明顯，呈現劑量相關性。
綜上所述，本研究初步證實了PDK1抑制劑可能通過降低PGE2的分泌，改善氣道炎癥，減輕慢阻肺模型小鼠的病理改變，為探索慢阻肺發病機制以及潛在靶點提供了新的思路，有可能成為慢阻肺治療與預防的新方向。但是需要注意的是，本研究為體內實驗，存在樣本量小、實驗干擾因素多、PDK1抑制劑劑量尚需不斷摸索等缺陷，僅僅初步揭示了PDK1抑制劑降低PGE2分泌，減輕氣道炎癥等情況。尚存在很多懸而未決的問題，如PDK1究竟通過何種分子機制調控PGE2的表達；PGE2引起氣道炎癥的具體機制如何；是否有其他的炎癥因子和炎癥介質參與相互影響；PDK1抑制劑的合適劑量及相關的不良反應等等問題，均尚需后續通過體外細胞實驗與更大規模的體內實驗進一步驗證，探索相關的分子信號通路，才能最終得出客觀可靠的結論。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種慢性氣道炎癥性疾病，炎性細胞異常活化是病情發生與發展的主要病理基礎，其中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是不容忽視的炎癥因子之一[1-2]。近年來研究發現，慢阻肺急性加重期患者血清及誘導痰中PGE2水平明顯高于慢阻肺緩解期，而且慢阻肺急性加重和慢阻肺穩定期痰中PGE2水平均高于健康對照組，說明了PGE2參與慢阻肺的炎癥過程，PGE2可能與慢阻肺患者慢性氣道炎癥的發生發展有關[3-4]。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（3-phosphoinositede dependent protein kinase-1，PDK1）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PDK1信號系統在細胞生長、存活以及血管形成中均起到重要的作用[5]。研究發現，煙熏大鼠模型肺泡灌洗液PGE2分泌增加，同時氣道上皮PDK1 表達增加[6]。但目前尚不清楚香煙等理化因素是否會通過刺激氣道上皮PGE2分泌、調控PDK1的表達從而影響了氣道的慢性炎癥？PDK1抑制劑能否干預PGE2的表達從而減輕氣道的慢性炎癥？因此，本研究擬通過體內實驗探討PDK1抑制劑對PGE2的干預作用，為控制氣道炎癥，預防與治療慢阻肺提供新的思路。
1 資料與方法
1.1 實驗動物
SPF級別C57BL/6雄性小鼠50只，鼠齡8～10周，體重在19～23 g，小鼠購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，飼養在四川大學華西科技園動物實驗中心SPF級別動物房，分籠飼養，每一籠小鼠5只，飼料為高溫高壓滅菌飼料，均給予同樣的條件喂養，并給予12 h光照和12 h黑暗環境進行交替循環。本動物實驗通過了四川大學華西醫院動物倫理委員會的批準，倫理備案號：2020356A。
1.2 主要設備和試劑
小鼠經鼻煙熏霧化裝置、固定流量泵（美國CH Technologies），洗板機、酶標儀（美國Bio-rad），低溫研磨儀（中國Servicebio），低溫離心機（美國BECKMAN），小動物霧化給藥儀（山東濟南益延科技發展有限公司），小動物肺功能儀（美國BUXCO），渦旋震蕩儀（北京優晟聯合科技有限公司），掌上離心機（四川川奕生物公司）；細胞甩片機（美國Wescor）；細胞計數（Count star），PDK1抑制劑OSU-03012（美國Selleck Chemicals），PGE2酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特公司），萬寶路香煙（美國Marlboro），戊巴比妥鈉粉劑（山東西亞化學工業有限公司），PAS染色試劑盒（Solarbio Science），蘇木素、伊紅和苯胺藍染色液均購自珠海貝索生物技術有限公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 慢阻肺小鼠模型的構建
按照文獻［7］提供的方法，對小鼠進行熏煙處理。用萬寶路香煙（每支香煙含有尼古丁1.0 mg，11 mg煤焦油）進行熏煙，每日兩次，每次75 min，每周煙熏5 d，持續12周。每天熏煙結束后送回動物房，飼養條件同前。
1.3.2 實驗小鼠分組及處理
將小鼠隨機分為五組，每組10只，分別為正常對照組（簡稱對照組）、熏煙組、熏煙+低劑量PDK1抑制劑組（簡稱低劑量組）、熏煙+中劑量PDK1抑制劑組（簡稱中劑量組）、熏煙+高劑量PDK1抑制劑組（簡稱高劑量組）。處理方法如下：對照組，小鼠每日霧化吸入磷酸鹽緩沖液2次，每次吸入75 min，每周吸入5 d，持續12周；熏煙組，用以上方法熏煙，每日2次，每次75 min，每周煙熏5 d，持續12周，每日熏煙前腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.5 mL；低劑量組：熏煙方法與時間同熏煙組，每天熏煙前腹腔注射PDK1抑制劑0.25 mg/kg+0.9%氯化鈉注射液，總量0.5 mL；中劑量組：熏煙方法與時間同熏煙組，每天熏煙前腹腔注射PDK1抑制劑0.5 mg/kg+0.9%氯化鈉注射液，總量0.5 mL；高劑量組：熏煙方法與時間同熏煙組，每天熏煙前腹腔注射PDK1抑制劑1.0 mg/kg+0.9%氯化鈉注射液，總量0.5 mL。每組小鼠分籠飼養，每周對小鼠稱重1次，在每組籠位及小鼠固定器上均用不同顏色的貼紙做好標識，避免出現差錯。
1.3.3 動物模型肺功能測試
熏煙結束后，稱取每只小鼠的體重。經腹腔注射2%戊巴比妥鈉注射液（0.2～0.3 mL/只）麻醉小鼠，在小鼠呼吸變緩慢均勻后，切開小鼠頸部暴露氣管并切開，放入小動物肺功能儀器中以獲取肺功能結果，分別獲得第100秒和第200秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 100 seconds and 200 seconds，分別簡稱FEV100和FEV200），以及用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、肺總量（total lung capacity，TLC）、功能殘氣量（functional residual capacity，FRC）等肺功能結果，連續測量3次，取平均值[8]。
1.3.4 動物模型處理及標本收集
小鼠肺功能測試結束后，將其固定于操作板上，消毒后剪開胸腔，暴露心臟，1 mL注射器從右心室緩慢抽取血液，每只小鼠采血量大約為0.6～0.8 mL，離心后吸取上層血清收集在EP管中，放入–80 °C冰箱凍存以備用。小鼠死亡后，用止血鉗夾住右肺主支氣管后，左肺行肺泡灌洗，灌洗液總量1.5 mL，回收支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）約1.2 mL。同時收集BALF底部的細胞進行細胞計數。剪下右肺主支氣管及右肺，放入包埋盒固定。
1.3.5 血清和BALF中PGE2的測定
將上述收集好的BALF離心后吸取BALF的上清液放置入–80 °C冰箱凍存，待所有標本收集好后，取出凍存的血清，用酶聯免疫吸附試驗測定血清與BALF中的PGE2濃度。
1.3.6 BALF細胞計數
收集離心后的BALF底部的細胞，裂解，離心，重懸，用甩片機甩片，瑞姬氏染色，光學顯微鏡上進行細胞分類計數，高倍視野下計數400個細胞，統計其中巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的百分比。
1.3.7 石蠟切片的染色
按照文獻［9］的方法進行石蠟切片，制片完成后行蘇木素–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在顯微鏡下觀察肺氣腫發生情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS 22.0進行統計分析。根據數據的分布類型，用均數±標準差（±s）進行數據描述。兩組之間的比較時，正態分布使用t檢驗，非正態分布使用Mann-Whitney檢驗。多組之間的比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）。實驗結果經方差齊性和正態分布檢驗，方差齊性采用 LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane’s t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組小鼠一般情況比較
12周實驗結束時，19只小鼠死亡，其中熏煙組小鼠死亡5只，低劑量組死亡4只，中劑量組死亡5只，高劑量組死亡5只。死亡原因包括不耐受煙熏、腹腔藥物注射以及動物固定。對照組小鼠飼養12周后精神好，毛色黑亮，行動自如，體重增加。其他組小鼠均出現精神差，毛色變黃脫落，消瘦，體重減輕等情況，以熏煙組小鼠最為明顯，高劑量組小鼠程度最輕。實驗前后小鼠體重變化見表1。
表1
處理前后各組小鼠體重比較［g，（ ）］
2.2 各組小鼠肺功能分析
與對照組相比，各熏煙組小鼠FEV100/FVC和FEV200/FVC均有明顯的下降，差異有統計學意義（均P=0.00），熏煙組和低劑量組的TLC和FRC明顯增加，差異有統計學意義（均P=0.00）；與熏煙組相比，中劑量組和和高劑量組小鼠FEV100/FVC、FEV200/FVC均有明顯上升，TLC和FRC有明顯的下降，差異有統計學意義（均P=0.00），而低劑量組的FEV100/FVC（P=0.956）、FEV200/FVC（P=0.387）、TLC（P=0.296）和FRC（P=0.229）與熏煙組相比，差異均無統計學意義。結果見圖1。
圖1
各組小鼠肺功能比較
a. FEV100/FVC；b. FEV200/FVC；c. TLC；d. FRC。*與對照組比較，
2.3 各組小鼠BALF細胞計數分析
對照組小鼠BALF中細胞總數少，以巨噬細胞為主，占比約90%。各熏煙組小鼠BALF中細胞總數和中性粒細胞百分比均顯著增加，而巨噬細胞百分比明顯減少，與對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。低劑量組的BALF細胞總數、中性粒細胞百分比和巨噬細胞百分比均同熏煙組相似，差異無統計學意義（P<0.05）。隨著PDK1抑制劑劑量的升高，BALF細胞總數和中性粒細胞百分比逐漸降低，而巨噬細胞百分比逐漸升高。中劑量組和高劑量組的三個觀察指標，即細胞總數、中性粒細胞百分比和巨噬細胞百分比，介于對照組和熏煙組之間，差異均有統計學意義（均P<0.05）。結果見表2。
表2
各組小鼠BALF細胞總數及主要細胞占比比較（）
2.4 各組小鼠血清和BALF中PGE2檢測結果比較
與對照組相比，各熏煙組小鼠血清及BALF的PGE2濃度均升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與熏煙組相比，中劑量組與高劑量組小鼠的血清及BALF的PGE2濃度均有所下降，差異有統計學意義（P<0.05）。而同時，低劑量組小鼠血清和BALF中PGE2濃度與熏煙組相比下降不明顯，差異無統計學意義（P值分別為0.579、0.057）；而中劑量組與高劑量組中血清和BALF中PGE2的濃度比較，差異無統計學意義（P值分別為0.756、0.325）。結果見表3、圖2。
表3
各組小鼠血清和BALF中PGE2濃度比較（）
圖2
各組小鼠BALF和血清中PGE2濃度比較
a. BALF；b. 血清。*與對照組比較，
2.5 各組小鼠肺組織切片HE染色比較
對照組小鼠氣道壁結構清楚，氣道上皮排列整齊，未見明顯上皮脫落，肺泡結構完整，肺小血管壁未見增厚（圖3a、b）；熏煙組小鼠細支氣管、肺泡管、肺泡囊內均存在大量氣道黏液阻塞，炎性細胞浸潤，氣道上皮排列紊亂、部分脫落、局部氣道上皮增生，管壁厚，支氣管平滑肌增厚，同時觀察到肺泡壁變薄，肺泡擴張融合，肺泡間隔、肺泡壁斷裂破壞，管壁周圍及肺間質可見炎性細胞浸潤（圖3c、d）；低劑量組小鼠氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤等情況與熏煙組相比略微減輕，差別不明顯，氣道上皮排列紊亂、局部氣道上皮增生，管壁厚，支氣管平滑肌增厚，同時觀察到肺泡壁變薄，肺泡擴張融合，程度與熏煙組差別不明顯（圖3e、f）；中劑量組小鼠可見氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤情況較熏煙組減輕，氣道上皮排列紊亂，肺泡擴張融合程度較熏煙組減輕 （圖3g、h）；高劑量組小鼠可見氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤情況較熏煙組明顯減輕，氣道上皮排列紊亂，肺泡擴張融合較熏煙組減輕（圖3i、j）。
圖3
各組小鼠肺組織病理檢查像（蘇木素–伊紅×20）
a、b. 對照組；c、d. 熏煙組；e、f. 低劑量組；g、h. 中劑量組；i、j. 高劑量組。a、c、e、g、i. 氣道；b、d、f、h、j. 肺泡。對照組小鼠氣道和肺泡結構清晰；熏煙組小鼠支氣管及肺泡內大量黏液阻塞，炎性細胞浸潤，肺泡壁變薄，肺泡擴張融合；低劑量組小鼠氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤熏煙組相比略微減輕，肺泡擴張融合程度與熏煙組差別不明顯；中劑量組小鼠氣道黏液阻塞、炎性細胞浸潤情況及肺泡擴張融合程度較熏煙組減輕 ；高劑量組小鼠氣道黏液阻塞及炎性細胞浸潤情況較熏煙組明顯減輕，肺泡擴張融合較熏煙組減輕。
3 討論
慢性阻塞性肺疾病全球倡議指出， 慢阻肺的實質是發生在氣道、肺血管和肺泡的一種慢性炎癥。在香煙等理化因素刺激下，氣道上皮細胞和肺泡巨噬細胞會釋放多種炎癥因子，誘導局部以及全身炎癥反應[1]。其中，PGE2作為一種重要的炎癥因子，在慢阻肺的慢性氣道炎癥中發揮重要的作用[10]。PGE2是一個氣道中多種細胞均能分泌的介質，如樹突狀細胞、炎癥細胞和氣道平滑肌細胞，在體內花生四烯酸經環氧化酶（cyclooxygenase， COX）和PG合成酶分解產生PGE2，是體內對生理性、化學刺激、激素、或炎癥信號的反應[11]。有研究表明，香煙煙霧暴露能夠上調COX-2表達，從而增加PGE2分泌，擴張血管并使其通透性增加，同時支氣管黏膜水腫，腺體分泌大量滲出，導致氣道阻塞，加重了氣流受限，因而引起肺功能的下降，導致慢阻肺急性加重與嚴重并發癥的發生[12-13]。近年來研究發現，慢阻肺急性加重患者血清及誘導痰中PGE2水平明顯高于慢阻肺緩解期，而且慢阻肺急性加重和慢阻肺穩定期痰中PGE2水平均高于健康對照組。慢阻肺急性加重患者誘導痰中PGE2水平與中性粒細胞數呈正相關， 與FEV1占預計值百分比呈負相關，表明了PGE2參與慢阻肺的炎癥過程，誘導痰中PGE2水平可以作為評估慢阻肺嚴重程度的指標[2, 14]。
PDK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是AGC激酶家族中的成員之一。PDK1被認為在腫瘤細胞的生長、生存和腫瘤血管生成中起關鍵作用[15]。OSU-03012是PDK1抑制劑，是COX-2抑制劑Celecoxib的衍生物[16]。COX-2是PGE2合成的限速酶，通過介導PI3K/PDK1/AKT信號通路參與多種惡性腫瘤的發生，被視作潛在的惡性腫瘤治療靶點[17]。在PI3K/PDK1/AKT信號通路中，PDK1通過激活AKT蛋白上的Thr308和Ser473 位點磷酸化，使AKT被磷酸化而激活，進一步激活下游多種效應分子，從而調節細胞生長、分裂、增殖以及凋亡的全過程[18-19]。在此途徑中，PDK1是關鍵性的蛋白激酶，起著中樞性樞紐的作用。OSU-03012通過抑制PDK1的活性，阻斷PDK1對下游效應分子的調控，從而抑制細胞增殖、促進分化及凋亡，改變細胞生物學特性[20]。而PI3K/PDK1/AKT信號通路在肺部疾病，尤其是慢性氣道炎癥性疾病中也起著至關重要的作用[21]。由此我們推測，作為PDK1抑制劑的OSU-03012有可能通過阻斷PDK1對下游效應分子的活化而調控氣道炎癥。研究發現，在煙熏大鼠慢阻肺模型中，測定PGE2分泌增加，同時氣道上皮PDK1表達增加[6]。目前為止尚不明確，PDK1是否可能通過調控PGE2的分泌影響慢阻肺患者的氣道炎癥。
本研究中，通過煙熏小鼠12周后FEV100/FVC和FEV200/FVC與對照組相比均有明顯的下降，說明煙熏小鼠造模慢阻肺是成功的。此外，而低劑量組的各項肺功能指標與熏煙組相比均未見明顯差異，而中劑量組和高劑量組小鼠FEV100/FVC和FEV200/FVC明顯升高，TLC和FRC有降低，說明使用PDK1抑制劑后小鼠肺功能有改善，且這種改善與劑量呈正相關。
煙熏小鼠12周后肺組織HE染色后可見，大量炎癥細胞浸潤，氣管壁增厚，肺泡腔擴張，肺泡壁變薄，肺泡壁斷裂融合，肺大皰形成，肺泡數目顯著減少等病理改變，均符合慢阻肺的病理改變，進一步表明煙熏小鼠慢阻肺模型建立成功。熏煙小鼠的BALF中發現炎性細胞明顯增多，中性粒細胞升高，說明煙熏小鼠的慢阻肺存在明顯的氣道炎癥改變。而同時，發現煙熏小鼠的血清和BALF中PGE2濃度較對照組小鼠明顯增高，這些均提示煙熏小鼠慢阻肺中PGE2分泌增加，同時氣道炎癥也更明顯，這與既往的研究得出的結論相似。而使用低劑量PDK1抑制劑，仍可見炎性細胞浸潤、黏液阻塞以及肺泡擴張等改變略有減輕，BALF中也可見炎性細胞減少，同時，血清和BALF中的PGE2濃度也降低，但變化不明顯；而中劑量組與高劑量組均可見炎性細胞浸潤減少，肺泡壁變薄和肺泡擴張等情況好轉，BALF中提示炎性細胞進一步減少，血清和BALF中PGE2降低，而高劑量組改善更加明顯。慢阻肺患者氣道炎癥明顯，同時PGE2分泌也增多，而使用PDK1抑制劑能夠降低PGE2的分泌，同時減輕氣道炎癥，而且隨著劑量的增加，減輕氣道炎癥及降低PGE2分泌的作用更加明顯，呈現劑量相關性。
綜上所述，本研究初步證實了PDK1抑制劑可能通過降低PGE2的分泌，改善氣道炎癥，減輕慢阻肺模型小鼠的病理改變，為探索慢阻肺發病機制以及潛在靶點提供了新的思路，有可能成為慢阻肺治療與預防的新方向。但是需要注意的是，本研究為體內實驗，存在樣本量小、實驗干擾因素多、PDK1抑制劑劑量尚需不斷摸索等缺陷，僅僅初步揭示了PDK1抑制劑降低PGE2分泌，減輕氣道炎癥等情況。尚存在很多懸而未決的問題，如PDK1究竟通過何種分子機制調控PGE2的表達；PGE2引起氣道炎癥的具體機制如何；是否有其他的炎癥因子和炎癥介質參與相互影響；PDK1抑制劑的合適劑量及相關的不良反應等等問題，均尚需后續通過體外細胞實驗與更大規模的體內實驗進一步驗證，探索相關的分子信號通路，才能最終得出客觀可靠的結論。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
