引用本文： 石寶玉, 李枍恒, 阮婷, 張芩, 徐莉, 李寧. 非實時超聲支氣管鏡聯合病原宏基因組二代測序在局灶性肺部感染性疾病診斷中的應用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(10): 725-730. doi: 10.7507/1671-6205.202206047 復制
肺部感染是由各類病原體引起的氣管–支氣管和肺實質的感染，是呼吸科最常見的疾病，病原體以細菌、真菌和病毒最為常見[1]。根據有效可靠的病原學檢查結果指導抗生素應用，對肺部感染的治療至關重要[2-3]。支氣管鏡可以直視下觀察病變部位并提取分泌物，降低樣本的外界干擾，提高病灶陽性檢測結果[4]。通常，我們主要通過術前胸部CT定位，普通可曲支氣管鏡下進行肺泡灌洗、刷檢、活檢等方式獲取下呼吸道病原學標本，標本的合格率及陽性率較低。因此一些輔助技術被推廣應用，如細支氣管鏡[5]、支氣管內超聲（endobronchial ultrasound，EBUS）[6]、導航支氣管鏡[7]、計算機斷層掃描透視[7]等技術的聯合應用給支氣管鏡檢查帶來更好的前景。其中，EBUS通過超聲成像技術，實現了對小氣道周圍病變位置的精確判斷，可以通過支氣管鏡的活檢通道送入肺周圍無氣體或少氣體病灶部位，甚至可達胸膜下，直接到達病灶內部進行掃描，精準留取下呼吸道標本，增加了病原學檢查的陽性率，有助于指導抗感染治療。
傳統的病原微生物檢測方法存在敏感性低、周期長、病原譜窄、易出現假陰性和假陽性，尤其是無法快速檢測罕見或新發病原體等局限性。病原宏基因組二代測序（Metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS）可直接從患者感染病灶部位標本中提取核酸，實現病原體種屬鑒定的高通量測序技術[8]。與傳統臨床的實驗室檢測方法相比，它可以突破不同病原體類型的局限性，無偏向性的全面覆蓋數千種以上的病原體，同時鑒定細菌、真菌、病毒和寄生蟲等多種類型病原微生物，甚至已經死亡的病原體[9] 。mNGS技術已逐漸成為臨床微生物領域的重要工具，尤其可以快速應對新發病原體的感染病威脅，同時也有望增強我們檢測和追蹤感染性疾病病原體的能力[10]。
本研究通過聯合非實時超聲支氣管鏡與mNGS技術建立呼吸道感染的病原診斷新方法，以期達到如下目標：（1）應用非實時超聲支氣管鏡更加準確地采集病灶樣本，提高樣本中病原體的陽性率；（2）應用mNGS技術提高病原體的檢出率。希望通過本研究，探索非實時超聲支氣管鏡和mNGS技術在呼吸系統感染性疾病中的應用前景，為它們成為未來常規技術奠定基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究為單中心前瞻性隨機對照研究，本研究通過我院倫理委員會批準（K-2020-077-K01），并獲得患者知情同意。選取2019年9月—2021年9月于我科住院的局灶性肺部感染性疾病患者。納入標準：① 年齡>18周歲；② 單一局灶性肺部感染實性病灶，經驗性抗感染治療效果不佳或懷疑特殊病原體感染，常規方法獲得的呼吸道標本無法明確病原體；③ 抗感染治療后病情無好轉，需與其他疾病相鑒別。排除標準：① 彌漫性肺部感染；② 嚴重通氣功能障礙；③ 近期發生急性冠脈綜合征，未控制的高血壓或惡性心律失常；④ 主動脈瘤和食管靜脈曲張有破裂風險；⑤ 不能糾正的出血傾向，或出血高風險；⑥ 多發肺大泡有破裂風險；⑦ 病情危重或患者不能配合。所有患者首先完成一般資料采集，完善血常規、肝腎功能、紅細胞沉降率、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原、凝血功能、血氣分析等常規檢查。將符合以上標準的患者根據隨機數表法將患者按照1∶1的比例隨機分為試驗組和對照組。
1.2 方法
1.2.1 樣本提取
試驗組患者采用術前胸部CT聯合非實時超聲支氣管鏡定位技術采集肺泡灌洗液，對照組采用術前胸部CT定位技術采集肺泡灌洗液。生命體征平穩、一般情況良好的患者采用咪達唑侖靜脈鎮靜，提高患者配合度，增加灌洗液回收率。術中全程進行血壓、心率、脈氧監測。對所有肺段進行檢查后，對照組根據術前CT定位行肺泡灌洗、刷檢；試驗組根據術前CT定位，進行超聲支氣管鏡檢查（圖1），探及異常回聲的肺段進行肺泡灌洗、刷檢。在灌洗肺段經活檢孔注入利多卡因1～2 mL進行局部麻醉，支氣管鏡嵌頓在目標支氣管開口，經操作孔道快速注入生理鹽水20～40 mL，以低于100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）負壓吸引采集支氣管肺泡灌洗液，根據支氣管腔塌陷情況調整。標本送檢普通培養、真菌半乳甘露聚糖抗原（galactomannan antigen，GM）試驗、結核分枝桿菌檢測及利福平耐藥試驗（Xpert MTB/RIF）及mNGS檢測。
圖1
左下葉背段局灶性實變及超聲支氣管鏡圖像
1.2.2 結果判讀
肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF陽性診斷結核分枝桿菌感染，真菌GM試驗陽性診斷侵襲性肺曲霉病，細菌真菌培養及mNGS檢測結果，結合患者癥狀、體征、檢驗、影像學表現、免疫水平及治療反應綜合分析。
1.2.3 分析指標
分析指標包括肺泡灌洗液普通培養陽性率、真菌GM試驗陽性率、Xpert MTB/RIF陽性率及mNGS檢測的陽性率以及平均住院時間和平均住院費用。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件。正態分布計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用用t檢驗，計數資料的組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率，P<0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 患者一般資料
本研究共納入96例，男54例，女42例，平均年齡（60.04±15.43）歲。試驗組與對照組均為48例。兩組患者的性別、年齡、病灶大小、血白細胞計數、中性粒細胞百分比、CRP水平、抗生素使用情況均相似，差異無統計學意義，具有可比性（P>0.05）。結果見表1。
表1
兩組患者一般情況［例/（
）］
2.2 兩組患者灌洗部位
試驗組于右上肺灌洗12例，右中肺灌洗6例，右下肺灌洗11例，左上肺灌洗10例，左下肺灌洗9例；對照組于右上肺灌洗9例，右中肺灌洗7例，右下肺灌洗15例，左上肺灌洗7例，左下肺灌洗10例，兩組灌洗部位分布比較，差異無統計學意義（χ2=1.703，P=0.79）。結果見表2。綜合分析，右肺肺炎（59例）發生率高于左肺（38例），各葉發生率依次為右下葉（26例）>右上葉（21例）>左下葉（19例）>左上葉（17例）>右中葉（13例）。
表2
兩組患者灌洗部位對比（例）
2.3 不同定位技術下肺泡灌洗液病原體檢測陽性率比較
與對照組相比，試驗組肺泡灌洗液普通培養陽性率（39.58%比16.67%，P=0.013），mNGS檢測陽性率（89.58%比72.92%，P=0.036）更高，差異有統計學意義。兩組患者肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF陽性率相似（4.17%比2.08%，P=1），真菌GM試驗陽性率相似（6.25%比4.17%，P=0.765），差異無統計學意義。結果見表3。試驗組mNGS檢測發現細菌31例，結核分枝桿菌5例，真菌4例，病毒2例，支原體3例；對照組mNGS檢測發現細菌28例，結核分枝桿菌3例，真菌3例，病毒0例，支原體3例；兩組患者mNGS檢測的病原體分布相似，差異無統計學意義（χ2=2.034，P=0.729）。
表3
兩組患者病原學檢測對比（例）
2.4 不同的病原體檢測方法陽性率比較
兩組患者綜合分析，與普通培養相比（27/96，28.13%），mNGS檢測細菌的陽性率更高（59/96，61.46%），差異有統計學意義（P<0.001）；與Xpert MTB/RIF相比（3/96，3.13%），mNGS檢測結核分枝桿菌的陽性率相似（8/96，8.33%），差異無統計學意義（P=0.21）；與真菌GM試驗相比（5/96，5.21%），mNGS檢出曲霉菌的陽性率相似（7/96，7.29%），差異無統計學意義（P=0.77）。綜合兩組患者普通培養、Xpert MTB/RIF、真菌GM試驗的結果，總陽性率為36.46%，mNGS檢測陽性率為81.25%，mNGS檢測的陽性率更高，差異有統計學意義（P<0.001）。結果見表4。
表4
mNGS與傳統檢測對不同病原體檢出率比較（例）
2.5 不同感染部位病原體檢測陽性率比較
試驗組肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率為89.58%，不同部位依次為左上葉100.00%=左下葉100.00%>右中葉83.33%＝右上葉83.33%>右下葉81.82%，各部位肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率差異無統計學意義（P=0.435）。對照組肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率為72.92%，不同部位依次為左下葉90.00%>右下葉80.00%=右上葉80.00%>左上葉71.43%=右中葉71.43%，各部位肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率差異無統計學意義（P=0.260）。對比兩組患者相同部位肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率，差異無統計學意義。結果見表5。
表5
兩組患者不同感染部位肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率比較
2.6 病原體分析
對照組病原mNGS結果顯示35例患者為陽性，13例為陰性。35例陽性患者中29例檢測出1種病原體，6例檢測出2種病原體；其中膿腫分枝桿菌7例，肺炎克雷伯菌6例，金黃色葡萄球菌5例，溶血葡萄球菌4例，軍團菌、肺炎支原體、結核分枝桿菌各3例，白色念珠菌、嗜麥芽窄食單胞菌、副流感嗜血桿菌、無乳鏈球菌各2例，熱帶念珠菌、鳥分枝桿菌各1例。
試驗組病原mNGS結果顯示43例患者為陽性，5例為陰性。43例陽性患者中41例檢測出1種病原體，2例檢測出2種病原體；其中膿腫分枝桿菌9例，結核分枝桿菌5例，肺炎克雷伯菌4例，銅綠假單胞菌、肺炎支原體、白色念珠菌各3例，嗜麥芽窄食單胞菌、人類皰疹病毒、輕型鏈球菌、奇異變形桿菌、流感嗜血桿菌、化膿擬桿菌、奴卡氏菌各2例，洛氏普雷沃菌、副流感嗜血桿菌、煙曲霉菌、中間普雷沃菌各1例。結果見圖2。
圖2
兩組患者病原體分布圖
a. 對照組，檢出病原體13種，共41株；b. 試驗組，檢出病原體17種，共45株。
2.7 平均住院時間及住院費用
與對照組相比，試驗組的平均住院時間更短，平均住院費用更低，差異均有統計學意義（P<0.001）。結果見表1。
3 討論
本研究采用非實時超聲支氣管鏡聯合mNGS檢測，對局灶性肺部感染患者進行病灶樣本采集，然后進行普通培養、Xpert MTB/RIF、真菌GM試驗，mNGS檢測等檢查，結果發現：1）右肺肺炎發生率高于左肺，可能和支氣管解剖結構有關；2）與對照組相比，試驗組樣本各檢測方法的陽性率更高，mNGS檢測出的病原體種類更多，可見非實時超聲支氣管鏡可提高病灶樣本的陽性率；3）與普通培養相比，mNGS檢測的病原學檢出率更高，可見mNGS檢測可提高細菌的檢出率；4）與Xpert MTB/RIF、真菌GM試驗相比，mNGS檢測的檢出率更高，但差異無統計學意義，這可能是由于本研究樣本量相對較少導致的；5）與對照組相比，試驗組可以降低平均住院時間和住院費用，可見非實時超聲支氣管鏡聯合mNGS檢測有助于局灶性肺部感染的診治，值得推廣。
難治性肺部感染，包括結核分枝桿菌在內的多種罕見或難以取樣、培養的病原體，采用普通采樣培養的方式，往往存在較高的漏診率。其病變不僅僅局限于支氣管黏膜層，治療不及時，可擴散至黏膜下、肌層、軟骨、黏膜外。因此，經支氣管鏡檢是主要的診斷手段之一，但其漏診率及誤診率仍較高[11]。EBUS技術可通過支氣管工作通道將超聲探頭送入氣管–支氣管內，進行橫斷面環形360°掃描，從而獲取清晰的黏膜層、黏膜下層、軟骨層及氣道外臨近的組織圖像，已廣泛應用于腫瘤、感染等疾病的診治中，有利于肺部病灶的定位及診斷[12]。Chen等[13]采用EBUS輔助周圍型肺部疾病的活檢診斷，發現EBUS可以發現大部分周圍型肺部病灶，疾病涵蓋腫瘤性疾病與非腫瘤性疾病，包括肺部膿腫及局灶性肺炎等疾病。Abdelghani等[14]證明采用EBUS定位選擇肺組織活檢部位，可以提高診斷率，其中包括肺部感染性疾病的診斷。Li等[15]采用EBUS技術對周圍型肺部感染性病灶進行診斷，發現可以提高標本陽性率，病原體包括細菌、真菌、病毒、結核分枝桿菌、非典型病原體。而我們的研究也證實，與對照組相比，非實時超聲支氣管鏡可提高局灶性肺部感染的標本陽性率。
由于難治性肺部感染的病原體十分復雜，包括細菌、病毒、真菌及寄生蟲等，然而目前的臨床工作中，對病原體的診斷主要還是依賴自19世紀開展的培養、染色鏡檢等傳統檢測方法，以及后續發展的核酸擴增檢測分子免疫學檢查等手段，存在著樣本處理過程復雜、花費時間長、可檢測病原體種類少等缺點，不利于病原學診斷、病情評估及治療方案制定[16]。包括肺部感染在內，目前仍有約60%的感染性疾病的病原體是診斷不明的[17]。mNGS主要是通過以二代測序為代表的高通量測序技術，對臨床來源的標本進行宏基因組學分析，以獲取病原體的物種分類、血清型、耐藥性及毒力等一系列生物信息[18]，具有無偏移、全覆蓋、高效率等優勢。《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南（2018年版）》[19]也指出mNGS能明顯提高病原體診斷的敏感性，部分病原體檢測花費的時間更短，尤其對罕見病原體的診斷具有優勢，可審慎地應用于臨床實踐之中。正是得益于測序技術的不斷進步與發展，mNGS已廣泛應用于臨床病原體的診斷，且其正變得更加全面、廉價、高效及準確[20, 21]。Li等[15]采用病原mNGS技術對周圍型肺部感染性病灶進行診斷，發現其可提高病原體的檢出率。Chao等[22]采用病原mNGS技術對急性下呼吸道感染性疾病進行診斷，發現其具有準確率高、敏感性強、病原體覆蓋廣的優點。Wang等[23]采用病原mNGS技術提高了肺部放線菌感染的診斷。Chen等[24]采用病原mNGS技術提高了肺部莢膜組織胞漿菌的診斷。我們的研究也得出與傳統病原學檢測方法相比，病原mNGS的病原學檢出率更高，病原體種類更多，可見病原mNGS可提高病原體的檢出率，對于一些特殊病原體，尤其有效。
綜上所述，在術前 CT 定位的基礎上，聯合非實時超聲支氣管鏡定位，可提高肺泡灌洗液的陽性率。與普通培養、Xpert MTB/RIF、真菌 GM 試驗相比，病原mNGS的病原體檢出率更高，種類更多。因此非實時超聲支氣管鏡聯合病原mNGS可提高局灶性肺部感染性疾病的診斷率，減少住院時間和住院費用，值得在臨床中推廣應用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺部感染是由各類病原體引起的氣管–支氣管和肺實質的感染，是呼吸科最常見的疾病，病原體以細菌、真菌和病毒最為常見[1]。根據有效可靠的病原學檢查結果指導抗生素應用，對肺部感染的治療至關重要[2-3]。支氣管鏡可以直視下觀察病變部位并提取分泌物，降低樣本的外界干擾，提高病灶陽性檢測結果[4]。通常，我們主要通過術前胸部CT定位，普通可曲支氣管鏡下進行肺泡灌洗、刷檢、活檢等方式獲取下呼吸道病原學標本，標本的合格率及陽性率較低。因此一些輔助技術被推廣應用，如細支氣管鏡[5]、支氣管內超聲（endobronchial ultrasound，EBUS）[6]、導航支氣管鏡[7]、計算機斷層掃描透視[7]等技術的聯合應用給支氣管鏡檢查帶來更好的前景。其中，EBUS通過超聲成像技術，實現了對小氣道周圍病變位置的精確判斷，可以通過支氣管鏡的活檢通道送入肺周圍無氣體或少氣體病灶部位，甚至可達胸膜下，直接到達病灶內部進行掃描，精準留取下呼吸道標本，增加了病原學檢查的陽性率，有助于指導抗感染治療。
傳統的病原微生物檢測方法存在敏感性低、周期長、病原譜窄、易出現假陰性和假陽性，尤其是無法快速檢測罕見或新發病原體等局限性。病原宏基因組二代測序（Metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS）可直接從患者感染病灶部位標本中提取核酸，實現病原體種屬鑒定的高通量測序技術[8]。與傳統臨床的實驗室檢測方法相比，它可以突破不同病原體類型的局限性，無偏向性的全面覆蓋數千種以上的病原體，同時鑒定細菌、真菌、病毒和寄生蟲等多種類型病原微生物，甚至已經死亡的病原體[9] 。mNGS技術已逐漸成為臨床微生物領域的重要工具，尤其可以快速應對新發病原體的感染病威脅，同時也有望增強我們檢測和追蹤感染性疾病病原體的能力[10]。
本研究通過聯合非實時超聲支氣管鏡與mNGS技術建立呼吸道感染的病原診斷新方法，以期達到如下目標：（1）應用非實時超聲支氣管鏡更加準確地采集病灶樣本，提高樣本中病原體的陽性率；（2）應用mNGS技術提高病原體的檢出率。希望通過本研究，探索非實時超聲支氣管鏡和mNGS技術在呼吸系統感染性疾病中的應用前景，為它們成為未來常規技術奠定基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究為單中心前瞻性隨機對照研究，本研究通過我院倫理委員會批準（K-2020-077-K01），并獲得患者知情同意。選取2019年9月—2021年9月于我科住院的局灶性肺部感染性疾病患者。納入標準：① 年齡>18周歲；② 單一局灶性肺部感染實性病灶，經驗性抗感染治療效果不佳或懷疑特殊病原體感染，常規方法獲得的呼吸道標本無法明確病原體；③ 抗感染治療后病情無好轉，需與其他疾病相鑒別。排除標準：① 彌漫性肺部感染；② 嚴重通氣功能障礙；③ 近期發生急性冠脈綜合征，未控制的高血壓或惡性心律失常；④ 主動脈瘤和食管靜脈曲張有破裂風險；⑤ 不能糾正的出血傾向，或出血高風險；⑥ 多發肺大泡有破裂風險；⑦ 病情危重或患者不能配合。所有患者首先完成一般資料采集，完善血常規、肝腎功能、紅細胞沉降率、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原、凝血功能、血氣分析等常規檢查。將符合以上標準的患者根據隨機數表法將患者按照1∶1的比例隨機分為試驗組和對照組。
1.2 方法
1.2.1 樣本提取
試驗組患者采用術前胸部CT聯合非實時超聲支氣管鏡定位技術采集肺泡灌洗液，對照組采用術前胸部CT定位技術采集肺泡灌洗液。生命體征平穩、一般情況良好的患者采用咪達唑侖靜脈鎮靜，提高患者配合度，增加灌洗液回收率。術中全程進行血壓、心率、脈氧監測。對所有肺段進行檢查后，對照組根據術前CT定位行肺泡灌洗、刷檢；試驗組根據術前CT定位，進行超聲支氣管鏡檢查（圖1），探及異常回聲的肺段進行肺泡灌洗、刷檢。在灌洗肺段經活檢孔注入利多卡因1～2 mL進行局部麻醉，支氣管鏡嵌頓在目標支氣管開口，經操作孔道快速注入生理鹽水20～40 mL，以低于100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）負壓吸引采集支氣管肺泡灌洗液，根據支氣管腔塌陷情況調整。標本送檢普通培養、真菌半乳甘露聚糖抗原（galactomannan antigen，GM）試驗、結核分枝桿菌檢測及利福平耐藥試驗（Xpert MTB/RIF）及mNGS檢測。
圖1
左下葉背段局灶性實變及超聲支氣管鏡圖像
1.2.2 結果判讀
肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF陽性診斷結核分枝桿菌感染，真菌GM試驗陽性診斷侵襲性肺曲霉病，細菌真菌培養及mNGS檢測結果，結合患者癥狀、體征、檢驗、影像學表現、免疫水平及治療反應綜合分析。
1.2.3 分析指標
分析指標包括肺泡灌洗液普通培養陽性率、真菌GM試驗陽性率、Xpert MTB/RIF陽性率及mNGS檢測的陽性率以及平均住院時間和平均住院費用。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件。正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用用t檢驗，計數資料的組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率，P<0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 患者一般資料
本研究共納入96例，男54例，女42例，平均年齡（60.04±15.43）歲。試驗組與對照組均為48例。兩組患者的性別、年齡、病灶大小、血白細胞計數、中性粒細胞百分比、CRP水平、抗生素使用情況均相似，差異無統計學意義，具有可比性（P>0.05）。結果見表1。
表1
兩組患者一般情況［例/（）］
2.2 兩組患者灌洗部位
試驗組于右上肺灌洗12例，右中肺灌洗6例，右下肺灌洗11例，左上肺灌洗10例，左下肺灌洗9例；對照組于右上肺灌洗9例，右中肺灌洗7例，右下肺灌洗15例，左上肺灌洗7例，左下肺灌洗10例，兩組灌洗部位分布比較，差異無統計學意義（χ2=1.703，P=0.79）。結果見表2。綜合分析，右肺肺炎（59例）發生率高于左肺（38例），各葉發生率依次為右下葉（26例）>右上葉（21例）>左下葉（19例）>左上葉（17例）>右中葉（13例）。
表2
兩組患者灌洗部位對比（例）
2.3 不同定位技術下肺泡灌洗液病原體檢測陽性率比較
與對照組相比，試驗組肺泡灌洗液普通培養陽性率（39.58%比16.67%，P=0.013），mNGS檢測陽性率（89.58%比72.92%，P=0.036）更高，差異有統計學意義。兩組患者肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF陽性率相似（4.17%比2.08%，P=1），真菌GM試驗陽性率相似（6.25%比4.17%，P=0.765），差異無統計學意義。結果見表3。試驗組mNGS檢測發現細菌31例，結核分枝桿菌5例，真菌4例，病毒2例，支原體3例；對照組mNGS檢測發現細菌28例，結核分枝桿菌3例，真菌3例，病毒0例，支原體3例；兩組患者mNGS檢測的病原體分布相似，差異無統計學意義（χ2=2.034，P=0.729）。
表3
兩組患者病原學檢測對比（例）
2.4 不同的病原體檢測方法陽性率比較
兩組患者綜合分析，與普通培養相比（27/96，28.13%），mNGS檢測細菌的陽性率更高（59/96，61.46%），差異有統計學意義（P<0.001）；與Xpert MTB/RIF相比（3/96，3.13%），mNGS檢測結核分枝桿菌的陽性率相似（8/96，8.33%），差異無統計學意義（P=0.21）；與真菌GM試驗相比（5/96，5.21%），mNGS檢出曲霉菌的陽性率相似（7/96，7.29%），差異無統計學意義（P=0.77）。綜合兩組患者普通培養、Xpert MTB/RIF、真菌GM試驗的結果，總陽性率為36.46%，mNGS檢測陽性率為81.25%，mNGS檢測的陽性率更高，差異有統計學意義（P<0.001）。結果見表4。
表4
mNGS與傳統檢測對不同病原體檢出率比較（例）
2.5 不同感染部位病原體檢測陽性率比較
試驗組肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率為89.58%，不同部位依次為左上葉100.00%=左下葉100.00%>右中葉83.33%＝右上葉83.33%>右下葉81.82%，各部位肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率差異無統計學意義（P=0.435）。對照組肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率為72.92%，不同部位依次為左下葉90.00%>右下葉80.00%=右上葉80.00%>左上葉71.43%=右中葉71.43%，各部位肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率差異無統計學意義（P=0.260）。對比兩組患者相同部位肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率，差異無統計學意義。結果見表5。
表5
兩組患者不同感染部位肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率比較
2.6 病原體分析
對照組病原mNGS結果顯示35例患者為陽性，13例為陰性。35例陽性患者中29例檢測出1種病原體，6例檢測出2種病原體；其中膿腫分枝桿菌7例，肺炎克雷伯菌6例，金黃色葡萄球菌5例，溶血葡萄球菌4例，軍團菌、肺炎支原體、結核分枝桿菌各3例，白色念珠菌、嗜麥芽窄食單胞菌、副流感嗜血桿菌、無乳鏈球菌各2例，熱帶念珠菌、鳥分枝桿菌各1例。
試驗組病原mNGS結果顯示43例患者為陽性，5例為陰性。43例陽性患者中41例檢測出1種病原體，2例檢測出2種病原體；其中膿腫分枝桿菌9例，結核分枝桿菌5例，肺炎克雷伯菌4例，銅綠假單胞菌、肺炎支原體、白色念珠菌各3例，嗜麥芽窄食單胞菌、人類皰疹病毒、輕型鏈球菌、奇異變形桿菌、流感嗜血桿菌、化膿擬桿菌、奴卡氏菌各2例，洛氏普雷沃菌、副流感嗜血桿菌、煙曲霉菌、中間普雷沃菌各1例。結果見圖2。
圖2
兩組患者病原體分布圖
a. 對照組，檢出病原體13種，共41株；b. 試驗組，檢出病原體17種，共45株。
2.7 平均住院時間及住院費用
與對照組相比，試驗組的平均住院時間更短，平均住院費用更低，差異均有統計學意義（P<0.001）。結果見表1。
3 討論
本研究采用非實時超聲支氣管鏡聯合mNGS檢測，對局灶性肺部感染患者進行病灶樣本采集，然后進行普通培養、Xpert MTB/RIF、真菌GM試驗，mNGS檢測等檢查，結果發現：1）右肺肺炎發生率高于左肺，可能和支氣管解剖結構有關；2）與對照組相比，試驗組樣本各檢測方法的陽性率更高，mNGS檢測出的病原體種類更多，可見非實時超聲支氣管鏡可提高病灶樣本的陽性率；3）與普通培養相比，mNGS檢測的病原學檢出率更高，可見mNGS檢測可提高細菌的檢出率；4）與Xpert MTB/RIF、真菌GM試驗相比，mNGS檢測的檢出率更高，但差異無統計學意義，這可能是由于本研究樣本量相對較少導致的；5）與對照組相比，試驗組可以降低平均住院時間和住院費用，可見非實時超聲支氣管鏡聯合mNGS檢測有助于局灶性肺部感染的診治，值得推廣。
難治性肺部感染，包括結核分枝桿菌在內的多種罕見或難以取樣、培養的病原體，采用普通采樣培養的方式，往往存在較高的漏診率。其病變不僅僅局限于支氣管黏膜層，治療不及時，可擴散至黏膜下、肌層、軟骨、黏膜外。因此，經支氣管鏡檢是主要的診斷手段之一，但其漏診率及誤診率仍較高[11]。EBUS技術可通過支氣管工作通道將超聲探頭送入氣管–支氣管內，進行橫斷面環形360°掃描，從而獲取清晰的黏膜層、黏膜下層、軟骨層及氣道外臨近的組織圖像，已廣泛應用于腫瘤、感染等疾病的診治中，有利于肺部病灶的定位及診斷[12]。Chen等[13]采用EBUS輔助周圍型肺部疾病的活檢診斷，發現EBUS可以發現大部分周圍型肺部病灶，疾病涵蓋腫瘤性疾病與非腫瘤性疾病，包括肺部膿腫及局灶性肺炎等疾病。Abdelghani等[14]證明采用EBUS定位選擇肺組織活檢部位，可以提高診斷率，其中包括肺部感染性疾病的診斷。Li等[15]采用EBUS技術對周圍型肺部感染性病灶進行診斷，發現可以提高標本陽性率，病原體包括細菌、真菌、病毒、結核分枝桿菌、非典型病原體。而我們的研究也證實，與對照組相比，非實時超聲支氣管鏡可提高局灶性肺部感染的標本陽性率。
由于難治性肺部感染的病原體十分復雜，包括細菌、病毒、真菌及寄生蟲等，然而目前的臨床工作中，對病原體的診斷主要還是依賴自19世紀開展的培養、染色鏡檢等傳統檢測方法，以及后續發展的核酸擴增檢測分子免疫學檢查等手段，存在著樣本處理過程復雜、花費時間長、可檢測病原體種類少等缺點，不利于病原學診斷、病情評估及治療方案制定[16]。包括肺部感染在內，目前仍有約60%的感染性疾病的病原體是診斷不明的[17]。mNGS主要是通過以二代測序為代表的高通量測序技術，對臨床來源的標本進行宏基因組學分析，以獲取病原體的物種分類、血清型、耐藥性及毒力等一系列生物信息[18]，具有無偏移、全覆蓋、高效率等優勢。《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南（2018年版）》[19]也指出mNGS能明顯提高病原體診斷的敏感性，部分病原體檢測花費的時間更短，尤其對罕見病原體的診斷具有優勢，可審慎地應用于臨床實踐之中。正是得益于測序技術的不斷進步與發展，mNGS已廣泛應用于臨床病原體的診斷，且其正變得更加全面、廉價、高效及準確[20, 21]。Li等[15]采用病原mNGS技術對周圍型肺部感染性病灶進行診斷，發現其可提高病原體的檢出率。Chao等[22]采用病原mNGS技術對急性下呼吸道感染性疾病進行診斷，發現其具有準確率高、敏感性強、病原體覆蓋廣的優點。Wang等[23]采用病原mNGS技術提高了肺部放線菌感染的診斷。Chen等[24]采用病原mNGS技術提高了肺部莢膜組織胞漿菌的診斷。我們的研究也得出與傳統病原學檢測方法相比，病原mNGS的病原學檢出率更高，病原體種類更多，可見病原mNGS可提高病原體的檢出率，對于一些特殊病原體，尤其有效。
綜上所述，在術前 CT 定位的基礎上，聯合非實時超聲支氣管鏡定位，可提高肺泡灌洗液的陽性率。與普通培養、Xpert MTB/RIF、真菌 GM 試驗相比，病原mNGS的病原體檢出率更高，種類更多。因此非實時超聲支氣管鏡聯合病原mNGS可提高局灶性肺部感染性疾病的診斷率，減少住院時間和住院費用，值得在臨床中推廣應用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
