引用本文： 湯建華, 劉建華, 徐濤, 劉克勤, 張鶴鳴, 張志華. 微RNA-203通過TLR4/NF-κB/NLRP3通路保護肺泡上皮細胞免受脂多糖誘導損傷. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(6): 425-431. doi: 10.7507/1671-6205.202110041 復制
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一種以肺水腫和急性炎癥為特征的危重疾病，革蘭陰性菌感染是ALI的重要誘因，發病率和病死率均較高[1-2]。由于發病機制不明，目前臨床上尚無有效的治療方案。因此，需要進一步研究調控細胞凋亡和炎癥的分子機制，為ALI/ARDS的治療提供新的干預手段。微RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼RNA，通過與靶基因的3’-非翻譯區（3’-untranslated region，3’-UTR）互補結合以調控基因表達，廣泛參與細胞增殖、分化、免疫等多個生物學過程[3]。據報道，微RNA-203（microRNA-203，miR-203）參與調控腫瘤細胞的發展過程，且與炎癥因子分泌有關[4-5]。在過去的幾十年中，對于實體瘤中miRNA功能的研究取得了很大的進展。然而，miRNA在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI中的功能機制尚未得到充分的研究。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的重要組分，可通過誘導細胞炎癥反應誘發機體免疫功能障礙[6]。據報道，抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核轉錄因子κB（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）信號通路可能有效改善LPS誘導的ALI小鼠肺組織的損傷程度[7]。早期研究顯示，miR-203在LPS誘導的小鼠肺組織中高表達，調節miR-203可能具有治療肺炎的潛力[8]。綜上，我們推測，miR-203可能通過調控TLR4/NF-κB/NLRP3保護肺泡上皮細胞免受LPS誘導的細胞凋亡和炎癥損傷。因此，本研究通過LPS誘導人肺泡上皮細胞A549，模擬肺損傷，以驗證miR-203和TLR4/NF-κB/NLRP3對肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響，并初步探討其潛在的作用機制。
1 材料與方法
1.1 材料
人肺泡上皮細胞A549購自美國典型培養物保藏中心，貨號CM-H122；胎牛血清購自蘭州榮曄生物科技有限責任公司，貨號RY-F22；Dulbecco改良Eagle培養基購自上海索萊寶生物科技有限公司，貨號90113；LPS購自上海源葉生物科技有限公司，貨號S11060；miR-203模擬物（miR-203 mimics）及其陰性對照（miR-NC）、TLR4過表達載體（pcDNA-TLR4）及其對照空載體（pcDNA）、TLR4野生型（TLR4-WT）和突變型（TLR4-MUT）載體以及定量引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate isomer/propidium iodide，annexin Ⅴ-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號分別為DD1205、P611-01、A211-01；Trizol試劑購自上海雅吉生物科技有限公司，貨號YL01592G；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6酶聯免疫吸附試驗法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購自武漢菲恩生物科技有限公司，貨號分別為AQ-H0302-B、EH365、EH0202；RIPA裂解液購自北京伊塔生物科技有限公司，貨號SY4680；一抗B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2，26 kDa）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X Protein，Bax，21 kDa）、TLR4（95 kDa）、NF-κB（65 kDa）、NLRP3（118 kDa）、內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH。37 kDa）及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG H&L均購自英國Abcam公司，貨號分別為ab53154、ab238042、ab218987、ab32536、ab260017、ab9485及ab6721。
CellXpert CO2培養箱購自美國Eppendorf生命科學公司；Multiskan FC全自動酶標儀、ProFlex? PCR系統購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國Beckman Coulter有限公司；Universal Hood II凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養與分組
將A549細胞接種于含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養基中，置于37℃培養箱中培養，至細胞融合度超過70%后添加胰蛋白酶消化細胞進行傳代培養。取對數期生長的A549細胞接種在96孔細胞培養板上（1×104個/孔）并分為6組：Control組、LPS組、LPS+miR-NC mimics組、LPS+miR-203 mimics組、LPS+miR-203 mimics+pcDNA組、LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組。Control組不做任何處理，正常培養；LPS組使用10 mg/L[9]的LPS處理24 h；LPS+miR-NC mimics組轉染miR-NC mimics培養24 h后使用LPS處理24 h；LPS+miR-203 mimics+pcDNA組共轉染miR-203 mimics和pcDNA培養24 h后使用LPS處理24 h；LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組共轉染miR-203 mimics和pcDNA-TLR4培養24 h后使用LPS處理24 h。轉染方法嚴格遵循Lipofectamine 2000制造商說明書操作。
1.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測miR-203與TLR4靶向關系
通過在線生物信息學miRDB網站（http://mirdb.org/）預測，miR-203與TLR4 mRNA的3’-UTR區存在靶向結合位點，將包含結合位點的TLR4 3’-UTR片段（TLR4-WT）與突變片段（TLR4-MUT）分別克隆到熒光素酶報告載體質粒中，將二者分別與miR-NC mimics、miR-203 mimics共轉染A549細胞，48 h后通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性。
1.2.3 RT-qPCR檢測A549細胞中miR-203和TLR4 mRNA的相對表達水平
根據以上分組方法培養細胞，通過Trizol提取各組細胞的總RNA，反轉錄形成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR反應，具體的反應體系及程序均按照說明書方法操作。引物均在上海吉瑪制藥技術有限公司合成：miR-203正向5’-GTATTCGCACTGGATACGACCGACC-3’，反向5’-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3’；TLR4正向5’-CCCTGGTGAGTGTGACTATTGA-3’，反向5’-TTTGAGAACAGCAACCTTGAA-3’；U6正向5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAT-3’，反向5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；GAPDH正向5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。以U6或GAPDH為內參，使用2-ΔΔct法計算目的基因的相對表達水平。
1.2.4 ELISA測定各組A549細胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平
獲取按照上述方法培養的各組A549細胞上清液，嚴格按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒說明書進行操作，添加底物顯色后在30 min內終止反應，并通過酶標儀檢測各孔細胞吸光度，根據標準曲線確定樣品的目標水平。
1.2.5 流式細胞術檢測各組A549細胞凋亡率
收集按照上述方法培養的各組A549細胞，使用PBS沖洗后懸浮細胞（2×106個/mL），吸取1 mL于流式管中，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI），室溫避光孵育15 min，通過流式細胞儀檢測A549細胞凋亡率。獨立重復3次，細胞凋亡率為早期細胞凋亡率與晚期細胞凋亡率之和。
1.2.6 蛋白印跡法檢測各組A549細胞中凋亡及TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關蛋白表達
使用RIPA裂解法裂解按照上述方法培養的各組A549細胞，提取細胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。使用10% SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF膜上，添加5%脫脂牛奶封閉2 h，添加一抗：Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κB、NLRP3及內參GAPDH（稀釋比例1∶1000），4 ℃過夜孵育，隔天使用二抗（稀釋比例1∶5000）孵育2 h后，添加ECL顯影液顯影，通過凝膠成像系統和Image J分析目的蛋白的相對表達水平。實驗獨立重復3次。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件，Shapiro-Wilk檢驗評估數據的正態分布，符合正態分布的數據使數據以均數±標準差（
±s）來表示，分別采用單因素方差分析和t檢驗檢測多組間和兩組間的統計學顯著性。P<0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 miR-203與TLR4靶向關系驗證
生物信息學分析顯示，miR-203可以與TLR4 mRNA 3’-UTR相結合（圖1a）。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與miR-NC mimics組比較，過表達的miR-203可明顯抑制TLR4的轉錄活性（P<0.05），而將TLR4的3’-UTR突變后則無抑制作用（P>0.05），結果見圖1b。
圖1
miR-203與TLR4之間關系檢測
a. Targetscan網站預測互補位點圖；b. 雙熒光素酶結果驗證靶向關系，與miR-NC mimics組比較，*
2.2 miR-203和TLR4 mRNA在A549細胞中的表達情況
與Control組比較，LPS組A549細胞中的miR-203和TLR4 mRNA水平均升高（P<0.05）；與LPS+miR-NC mimics組比較，LPS+miR-203 mimics組A549細胞中miR-203相對表達水平升高，TLR4 mRNA水平降低（P<0.05）；與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組比較，LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組A549細胞中miR-203相對表達水平降低，TLR4 mRNA水平增高（P<0.05）；LPS組與LPS+miR-NC mimics組之間以及LPS+miR-203 mimics組與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組之間A549細胞中miR-203和TLR4 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖2。
圖2
miR-203和TLR4在各組A549細胞中的表達水平
與Control組比較，*
2.3 TNF-α、IL-1β和IL-6在各組A549細胞上清液中的表達水平變化情況
與Control組比較，LPS組A549細胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平增高（P<0.05）；與LPS+miR-NC mimics組比較，LPS+miR-203 mimics組A549細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平降低（P<0.05）；與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組比較，LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組A549細胞TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平增高（P<0.05）；LPS組與LPS+miR-NC mimics組之間以及LPS+miR-203 mimics組與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組之間A549細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖3。
圖3
TNF-α、IL-1β和IL-6在各組A549細胞上清液中的表達水平
與Control組比較，*
2.4 各組A549細胞凋亡率及Bax和Bcl-2水平變化情況
與Control組比較，LPS組A549細胞凋亡率和細胞中Bax表達增高，Bcl-2表達降低（P<0.05）；與LPS+miR-NC mimics組比較，LPS+miR-203 mimics組A549細胞中凋亡率和細胞中Bax表達降低，Bcl-2表達增高（P<0.05）；與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組比較，LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組A549細胞凋亡率和細胞中Bax表達增高，Bcl-2表達降低（P<0.05）；LPS組與LPS+miR-NC mimics組之間以及LPS+miR-203 mimics組與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組之間A549細胞凋亡率和細胞中Bax、Bcl-2表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖4。
圖4
各組A549細胞凋亡情況分析
a. 流式細胞術檢測細胞凋亡，從左至右、從上至下依次為壞死細胞、晚期凋亡細胞、活細胞和早期凋亡細胞；b. 細胞凋亡率統計圖；c. 免疫印跡檢測Bax和Bcl-2蛋白水平；d. Bax和Bcl-2蛋白水平統計圖。與Control組比較，*
2.5 各組A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3表達水平變化情況
與Control組比較，LPS組A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3表達增高（P<0.05）；與LPS+miR-NC mimics組比較，LPS+miR-203 mimics組A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3表達降低（P<0.05）；與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組比較，LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組A549細胞TLR4、NF-κB和NLRP3表達增高（P<0.05）；LPS組與LPS+miR-NC mimics組之間以及LPS+miR-203 mimics組與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組之間A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖5。
圖5
各組A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3蛋白表達水平
a. 免疫印跡檢測蛋白水平；b. 蛋白水平統計圖。與Control組比較，*
3 討論
ALI/ARDS是由間接或直接肺損傷引起的，臨床特征為肺泡–毛細血管屏障破壞和氣體交換功能障礙。ALI/ARDS的組織病理學特征為中性粒細胞浸潤、肺泡水腫等。Ⅱ型肺泡上皮細胞位于肺泡拐角處，具有合成、分泌和再利用肺表面活性物質的功能，在ALI/ARDS的發病機制中發揮核心作用[10-11]。目前，A549細胞被廣泛作為Ⅱ型肺泡上皮細胞的體外模型。因此，本研究以A549細胞為研究對象，使用LPS誘導A549細胞作為體外模擬ALI病原體模型。
近年來研究顯示，miRNA的差異表達在肺部疾病中廣泛存在，在ALI/ARDS的多個生物學過程和信號轉導途徑中發揮著至關重要的作用。據報道，miR-203是多功能miRNA，與病毒感染[12]、炎癥反應[5]及先天免疫[13]有關。譬如：miR-203在LPS誘導的心肌細胞中高表達，沉默其表達可減弱LPS誘導的細胞凋亡和炎性因子（TNF-α、IL-6等）的表達[14]。再比如：miR-203在ALI小鼠肺組織中表達上調，LPS誘導可上調miR-203表達和促進A549細胞凋亡[7]。本研究中結果顯示，在LPS處理后的A549細胞中miR-203表達增高，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平亦增高，與既往研究結果相一致[13-14]。研究證實，細胞凋亡與ALI的嚴重程度密切相關，是維持哺乳動物體內穩態的一種宿主防御機制[1]。Bax和Bcl-2在凋亡過程中相互對立存在，通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡[15]。本研究發現，LPS誘導后A549細胞凋亡率增加，Bax表達上調，Bcl-2表達下調。以上數據表明LPS誘導A549細胞凋亡和炎癥損傷。進一步的結果顯示，過表達miR-203后LPS誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6水平及細胞凋亡均被抑制，暗示過表達miR-203可能通過降低炎癥反應保護A549細胞免受LPS誘導的細胞凋亡損傷。
TLR4是一種重要的模式識別受體，參與機體免疫反應，可有效對抗病原體微生物的感染[16]。研究發現，姜黃素可通過抑制TLR4通路削弱肺部炎癥程度，從而保護SD大鼠免受LPS誘導的急性肺損傷[17]。基于生物學分析和熒光素酶報告基因檢測，確定TLR4是A549細胞中miR-203的直接靶標，結合位點位于3’-UTR，這意味著TLR4參與miR-203介導的LPS誘導的肺泡上皮細胞的凋亡和炎癥反應。本結果表明TLR4過表達逆轉了上調miR-203對LPS誘導的細胞凋亡和炎癥反應的影響。NF-κB是一種經典的轉錄因子，通過誘導促炎介質的表達發揮功能，參與LPS、化療藥物和其他信號誘導的細胞凋亡和炎癥反應[18]。NLRP3是一種炎性小體，介導LPS誘發的ALI炎癥反應和細胞凋亡[19-20]。據研究報道，TLR4/NF-κB/NLRP3通路參與調控LPS誘導的肺部炎癥反應[21]。本研究發現，LPS誘導后TLR4、NF-κB和NLRP3表達增高，表明LPS激活TLR4/NF-κB/NLRP3通路，而miR-203上調則可逆轉LPS對此通路的激活作用；進一步研究發現，TLR4過表達可削弱miR-203對TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影響。以上數據表明，TLR4過表達可逆轉上調miR-203表達對LPS誘導的炎癥反應和細胞凋亡的影響。
綜上，本研究證實了miR-203通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路，降低A549細胞凋亡和炎癥損傷程度，發揮保護肺泡上皮細胞LPS誘導損傷功能。提示miR-203和TLR4可能參與LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷，是ALI診斷及治療的潛在靶點。我們的研究并非沒有局限性，miRNA與靶基因之間的相互作用是復雜的，TLR4僅是miR-203的其中一個靶標基因，本研究并未單獨證實TLR4在LPS誘導A549細胞中的作用，且也未反向驗證miR-203低表達對TLR4的影響。此外，本研究并未在動物模型體內同步驗證miR-203功能。因此，之后將針對以上不足重點探究以完善miR-203的作用機制。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一種以肺水腫和急性炎癥為特征的危重疾病，革蘭陰性菌感染是ALI的重要誘因，發病率和病死率均較高[1-2]。由于發病機制不明，目前臨床上尚無有效的治療方案。因此，需要進一步研究調控細胞凋亡和炎癥的分子機制，為ALI/ARDS的治療提供新的干預手段。微RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼RNA，通過與靶基因的3’-非翻譯區（3’-untranslated region，3’-UTR）互補結合以調控基因表達，廣泛參與細胞增殖、分化、免疫等多個生物學過程[3]。據報道，微RNA-203（microRNA-203，miR-203）參與調控腫瘤細胞的發展過程，且與炎癥因子分泌有關[4-5]。在過去的幾十年中，對于實體瘤中miRNA功能的研究取得了很大的進展。然而，miRNA在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI中的功能機制尚未得到充分的研究。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的重要組分，可通過誘導細胞炎癥反應誘發機體免疫功能障礙[6]。據報道，抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核轉錄因子κB（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）信號通路可能有效改善LPS誘導的ALI小鼠肺組織的損傷程度[7]。早期研究顯示，miR-203在LPS誘導的小鼠肺組織中高表達，調節miR-203可能具有治療肺炎的潛力[8]。綜上，我們推測，miR-203可能通過調控TLR4/NF-κB/NLRP3保護肺泡上皮細胞免受LPS誘導的細胞凋亡和炎癥損傷。因此，本研究通過LPS誘導人肺泡上皮細胞A549，模擬肺損傷，以驗證miR-203和TLR4/NF-κB/NLRP3對肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響，并初步探討其潛在的作用機制。
1 材料與方法
1.1 材料
人肺泡上皮細胞A549購自美國典型培養物保藏中心，貨號CM-H122；胎牛血清購自蘭州榮曄生物科技有限責任公司，貨號RY-F22；Dulbecco改良Eagle培養基購自上海索萊寶生物科技有限公司，貨號90113；LPS購自上海源葉生物科技有限公司，貨號S11060；miR-203模擬物（miR-203 mimics）及其陰性對照（miR-NC）、TLR4過表達載體（pcDNA-TLR4）及其對照空載體（pcDNA）、TLR4野生型（TLR4-WT）和突變型（TLR4-MUT）載體以及定量引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate isomer/propidium iodide，annexin Ⅴ-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號分別為DD1205、P611-01、A211-01；Trizol試劑購自上海雅吉生物科技有限公司，貨號YL01592G；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6酶聯免疫吸附試驗法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購自武漢菲恩生物科技有限公司，貨號分別為AQ-H0302-B、EH365、EH0202；RIPA裂解液購自北京伊塔生物科技有限公司，貨號SY4680；一抗B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2，26 kDa）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X Protein，Bax，21 kDa）、TLR4（95 kDa）、NF-κB（65 kDa）、NLRP3（118 kDa）、內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH。37 kDa）及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG H&L均購自英國Abcam公司，貨號分別為ab53154、ab238042、ab218987、ab32536、ab260017、ab9485及ab6721。
CellXpert CO2培養箱購自美國Eppendorf生命科學公司；Multiskan FC全自動酶標儀、ProFlex? PCR系統購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國Beckman Coulter有限公司；Universal Hood II凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養與分組
將A549細胞接種于含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養基中，置于37℃培養箱中培養，至細胞融合度超過70%后添加胰蛋白酶消化細胞進行傳代培養。取對數期生長的A549細胞接種在96孔細胞培養板上（1×104個/孔）并分為6組：Control組、LPS組、LPS+miR-NC mimics組、LPS+miR-203 mimics組、LPS+miR-203 mimics+pcDNA組、LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組。Control組不做任何處理，正常培養；LPS組使用10 mg/L[9]的LPS處理24 h；LPS+miR-NC mimics組轉染miR-NC mimics培養24 h后使用LPS處理24 h；LPS+miR-203 mimics+pcDNA組共轉染miR-203 mimics和pcDNA培養24 h后使用LPS處理24 h；LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組共轉染miR-203 mimics和pcDNA-TLR4培養24 h后使用LPS處理24 h。轉染方法嚴格遵循Lipofectamine 2000制造商說明書操作。
1.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測miR-203與TLR4靶向關系
通過在線生物信息學miRDB網站（http://mirdb.org/）預測，miR-203與TLR4 mRNA的3’-UTR區存在靶向結合位點，將包含結合位點的TLR4 3’-UTR片段（TLR4-WT）與突變片段（TLR4-MUT）分別克隆到熒光素酶報告載體質粒中，將二者分別與miR-NC mimics、miR-203 mimics共轉染A549細胞，48 h后通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性。
1.2.3 RT-qPCR檢測A549細胞中miR-203和TLR4 mRNA的相對表達水平
根據以上分組方法培養細胞，通過Trizol提取各組細胞的總RNA，反轉錄形成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR反應，具體的反應體系及程序均按照說明書方法操作。引物均在上海吉瑪制藥技術有限公司合成：miR-203正向5’-GTATTCGCACTGGATACGACCGACC-3’，反向5’-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3’；TLR4正向5’-CCCTGGTGAGTGTGACTATTGA-3’，反向5’-TTTGAGAACAGCAACCTTGAA-3’；U6正向5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAT-3’，反向5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；GAPDH正向5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。以U6或GAPDH為內參，使用2-ΔΔct法計算目的基因的相對表達水平。
1.2.4 ELISA測定各組A549細胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平
獲取按照上述方法培養的各組A549細胞上清液，嚴格按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒說明書進行操作，添加底物顯色后在30 min內終止反應，并通過酶標儀檢測各孔細胞吸光度，根據標準曲線確定樣品的目標水平。
1.2.5 流式細胞術檢測各組A549細胞凋亡率
收集按照上述方法培養的各組A549細胞，使用PBS沖洗后懸浮細胞（2×106個/mL），吸取1 mL于流式管中，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI），室溫避光孵育15 min，通過流式細胞儀檢測A549細胞凋亡率。獨立重復3次，細胞凋亡率為早期細胞凋亡率與晚期細胞凋亡率之和。
1.2.6 蛋白印跡法檢測各組A549細胞中凋亡及TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關蛋白表達
使用RIPA裂解法裂解按照上述方法培養的各組A549細胞，提取細胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。使用10% SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF膜上，添加5%脫脂牛奶封閉2 h，添加一抗：Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κB、NLRP3及內參GAPDH（稀釋比例1∶1000），4 ℃過夜孵育，隔天使用二抗（稀釋比例1∶5000）孵育2 h后，添加ECL顯影液顯影，通過凝膠成像系統和Image J分析目的蛋白的相對表達水平。實驗獨立重復3次。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件，Shapiro-Wilk檢驗評估數據的正態分布，符合正態分布的數據使數據以均數±標準差（±s）來表示，分別采用單因素方差分析和t檢驗檢測多組間和兩組間的統計學顯著性。P<0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 miR-203與TLR4靶向關系驗證
生物信息學分析顯示，miR-203可以與TLR4 mRNA 3’-UTR相結合（圖1a）。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與miR-NC mimics組比較，過表達的miR-203可明顯抑制TLR4的轉錄活性（P<0.05），而將TLR4的3’-UTR突變后則無抑制作用（P>0.05），結果見圖1b。
圖1
miR-203與TLR4之間關系檢測
a. Targetscan網站預測互補位點圖；b. 雙熒光素酶結果驗證靶向關系，與miR-NC mimics組比較，*
2.2 miR-203和TLR4 mRNA在A549細胞中的表達情況
與Control組比較，LPS組A549細胞中的miR-203和TLR4 mRNA水平均升高（P<0.05）；與LPS+miR-NC mimics組比較，LPS+miR-203 mimics組A549細胞中miR-203相對表達水平升高，TLR4 mRNA水平降低（P<0.05）；與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組比較，LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組A549細胞中miR-203相對表達水平降低，TLR4 mRNA水平增高（P<0.05）；LPS組與LPS+miR-NC mimics組之間以及LPS+miR-203 mimics組與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組之間A549細胞中miR-203和TLR4 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖2。
圖2
miR-203和TLR4在各組A549細胞中的表達水平
與Control組比較，*
2.3 TNF-α、IL-1β和IL-6在各組A549細胞上清液中的表達水平變化情況
與Control組比較，LPS組A549細胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平增高（P<0.05）；與LPS+miR-NC mimics組比較，LPS+miR-203 mimics組A549細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平降低（P<0.05）；與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組比較，LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組A549細胞TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平增高（P<0.05）；LPS組與LPS+miR-NC mimics組之間以及LPS+miR-203 mimics組與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組之間A549細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖3。
圖3
TNF-α、IL-1β和IL-6在各組A549細胞上清液中的表達水平
與Control組比較，*
2.4 各組A549細胞凋亡率及Bax和Bcl-2水平變化情況
與Control組比較，LPS組A549細胞凋亡率和細胞中Bax表達增高，Bcl-2表達降低（P<0.05）；與LPS+miR-NC mimics組比較，LPS+miR-203 mimics組A549細胞中凋亡率和細胞中Bax表達降低，Bcl-2表達增高（P<0.05）；與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組比較，LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組A549細胞凋亡率和細胞中Bax表達增高，Bcl-2表達降低（P<0.05）；LPS組與LPS+miR-NC mimics組之間以及LPS+miR-203 mimics組與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組之間A549細胞凋亡率和細胞中Bax、Bcl-2表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖4。
圖4
各組A549細胞凋亡情況分析
a. 流式細胞術檢測細胞凋亡，從左至右、從上至下依次為壞死細胞、晚期凋亡細胞、活細胞和早期凋亡細胞；b. 細胞凋亡率統計圖；c. 免疫印跡檢測Bax和Bcl-2蛋白水平；d. Bax和Bcl-2蛋白水平統計圖。與Control組比較，*
2.5 各組A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3表達水平變化情況
與Control組比較，LPS組A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3表達增高（P<0.05）；與LPS+miR-NC mimics組比較，LPS+miR-203 mimics組A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3表達降低（P<0.05）；與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組比較，LPS+miR-203 mimics+pcDNA-TLR4組A549細胞TLR4、NF-κB和NLRP3表達增高（P<0.05）；LPS組與LPS+miR-NC mimics組之間以及LPS+miR-203 mimics組與LPS+miR-203 mimics+pcDNA組之間A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖5。
圖5
各組A549細胞中TLR4、NF-κB和NLRP3蛋白表達水平
a. 免疫印跡檢測蛋白水平；b. 蛋白水平統計圖。與Control組比較，*
3 討論
ALI/ARDS是由間接或直接肺損傷引起的，臨床特征為肺泡–毛細血管屏障破壞和氣體交換功能障礙。ALI/ARDS的組織病理學特征為中性粒細胞浸潤、肺泡水腫等。Ⅱ型肺泡上皮細胞位于肺泡拐角處，具有合成、分泌和再利用肺表面活性物質的功能，在ALI/ARDS的發病機制中發揮核心作用[10-11]。目前，A549細胞被廣泛作為Ⅱ型肺泡上皮細胞的體外模型。因此，本研究以A549細胞為研究對象，使用LPS誘導A549細胞作為體外模擬ALI病原體模型。
近年來研究顯示，miRNA的差異表達在肺部疾病中廣泛存在，在ALI/ARDS的多個生物學過程和信號轉導途徑中發揮著至關重要的作用。據報道，miR-203是多功能miRNA，與病毒感染[12]、炎癥反應[5]及先天免疫[13]有關。譬如：miR-203在LPS誘導的心肌細胞中高表達，沉默其表達可減弱LPS誘導的細胞凋亡和炎性因子（TNF-α、IL-6等）的表達[14]。再比如：miR-203在ALI小鼠肺組織中表達上調，LPS誘導可上調miR-203表達和促進A549細胞凋亡[7]。本研究中結果顯示，在LPS處理后的A549細胞中miR-203表達增高，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平亦增高，與既往研究結果相一致[13-14]。研究證實，細胞凋亡與ALI的嚴重程度密切相關，是維持哺乳動物體內穩態的一種宿主防御機制[1]。Bax和Bcl-2在凋亡過程中相互對立存在，通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡[15]。本研究發現，LPS誘導后A549細胞凋亡率增加，Bax表達上調，Bcl-2表達下調。以上數據表明LPS誘導A549細胞凋亡和炎癥損傷。進一步的結果顯示，過表達miR-203后LPS誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6水平及細胞凋亡均被抑制，暗示過表達miR-203可能通過降低炎癥反應保護A549細胞免受LPS誘導的細胞凋亡損傷。
TLR4是一種重要的模式識別受體，參與機體免疫反應，可有效對抗病原體微生物的感染[16]。研究發現，姜黃素可通過抑制TLR4通路削弱肺部炎癥程度，從而保護SD大鼠免受LPS誘導的急性肺損傷[17]。基于生物學分析和熒光素酶報告基因檢測，確定TLR4是A549細胞中miR-203的直接靶標，結合位點位于3’-UTR，這意味著TLR4參與miR-203介導的LPS誘導的肺泡上皮細胞的凋亡和炎癥反應。本結果表明TLR4過表達逆轉了上調miR-203對LPS誘導的細胞凋亡和炎癥反應的影響。NF-κB是一種經典的轉錄因子，通過誘導促炎介質的表達發揮功能，參與LPS、化療藥物和其他信號誘導的細胞凋亡和炎癥反應[18]。NLRP3是一種炎性小體，介導LPS誘發的ALI炎癥反應和細胞凋亡[19-20]。據研究報道，TLR4/NF-κB/NLRP3通路參與調控LPS誘導的肺部炎癥反應[21]。本研究發現，LPS誘導后TLR4、NF-κB和NLRP3表達增高，表明LPS激活TLR4/NF-κB/NLRP3通路，而miR-203上調則可逆轉LPS對此通路的激活作用；進一步研究發現，TLR4過表達可削弱miR-203對TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影響。以上數據表明，TLR4過表達可逆轉上調miR-203表達對LPS誘導的炎癥反應和細胞凋亡的影響。
綜上，本研究證實了miR-203通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路，降低A549細胞凋亡和炎癥損傷程度，發揮保護肺泡上皮細胞LPS誘導損傷功能。提示miR-203和TLR4可能參與LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷，是ALI診斷及治療的潛在靶點。我們的研究并非沒有局限性，miRNA與靶基因之間的相互作用是復雜的，TLR4僅是miR-203的其中一個靶標基因，本研究并未單獨證實TLR4在LPS誘導A549細胞中的作用，且也未反向驗證miR-203低表達對TLR4的影響。此外，本研究并未在動物模型體內同步驗證miR-203功能。因此，之后將針對以上不足重點探究以完善miR-203的作用機制。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
