引用本文：
曹迪, 尹玉東, 沈鴻, 隗明, 馮勝虎, 陳曦, 楊春霞, 谷麗. MIZ1
社區獲得性肺炎（CAP）是最常見的感染性疾病之一，也是重要的死亡原因之一[1]。其中，重癥CAP的醫院病死率可達到25%～50%[2]。因此，優化重癥CAP患者的早期診斷方法、尋找藥物研發的新思路具有重要意義。Myc相互作用的鋅指蛋白1（MIZ1）是由zbtb17基因編碼的蛋白，由N端的痘病毒和鋅指（POZ）結構和在其C端的13個鋅指蛋白結構組成。研究發現MIZ1在機體的炎癥調控中發揮作用[3]，并且通過調節血清白細胞介素（IL）-6、α干擾素（IFN-α）、IFN-β等多種炎癥因子的表達來起到調控炎癥反應的作用[4-7]。針對淋巴瘤的研究發現MIZ1在淋巴細胞的發育以及淋巴系腫瘤的發生發展中起重要的調控作用[8-9]。但對外周血單個核細胞（PBMC）中的MIZ1是否參與CAP的全身炎癥反應，目前尚無相關研究。本研究收集CAP患者的臨床標本，檢測患者PBMC中MIZ1 mRNA水平，探尋PBMC中MIZ1與CAP病情的嚴重程度的關系并探究其與炎癥因子的關系，以期尋找重癥CAP患者早期診斷的新指標并為重癥CAP的防治及新藥研發提供新的方向。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入2018年4月至2019年6月在北京朝陽醫院感染和臨床微生物科和呼吸科住院治療的CAP患者36例。CAP患者符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016版）》診斷標準[10]，并排除存在嚴重的非感染性肺部基礎病，包括慢性阻塞性肺疾病、肺結核、肺部腫瘤、肺水腫、肺不張、肺栓塞等的患者。依照《ATS/IDSA成人社區獲得性肺炎的診斷和治療臨床實踐指南（2019版）》重癥CAP判定標準[11]，將CAP患者分為重癥CAP和非重癥CAP兩組，各18例。本研究得到北京朝陽醫院倫理委員會的批準（2020-科-46）。所有參與者簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 臨床資料收集
收集患者性別、年齡、合并癥、轉歸及入院24 h內白細胞計數、C反應蛋白、降鈣素原的檢測結果。
1.2.2 樣本處理
采用肝素抗凝管采集CAP患者入院24 h內3 mL外周靜脈血，密度梯度離心法分離PBMC，同時采集CAP患者4 mL外周靜脈血離心分離血清。分別凍存于–80 ℃冰箱。
1.2.3 逆轉錄–定量聚合酶鏈式反應
使用Trizol reagent 試劑盒（Life Technologies公司，美國）從PBMC中提取總RNA，使用RNeasy mini kit試劑盒（Qiagen公司，美國）進行純化，使用SuperScript?II RT試劑（Thermo fisher公司，美國）進行RNA逆轉錄，使用FastSYBR?GreenMaster Mix試劑在LightCycler480 實時熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士）上進行逆轉錄–定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR），以3-磷酸甘油醛脫氫酶為內參。MIZ1引物：上游5’-GGTTCCGCCCGACTCTAACA-3’，下游5’ CTCGTCCGGCTCATTACCTG-3’。引物由睿博興科生物技術有限公司（北京）合成。RT- qPCR 數據分析采用相對定量法，MIZ1 mRNA表達水平以 2–ΔΔCt表示。
1.2.4 酶聯免疫吸附試驗
使用IL-6、IL-8、IL-10、IFN-α 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（達科為公司，中國）按照標準步驟進行檢測。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件。符合正態分布的連續變量以均數±標準差（
±s）表示，不符合正態分布的連續變量以中位數（四分位數）［M（Q1，Q3）］表示。組間比較用t檢驗或非參數檢驗中的Mann-Whitney U檢驗。組間構成比的比較采用χ2檢驗。診斷試驗評價采用受試者工作特征（ROC）曲線和曲線下面積（AUC）。相關分析采用Spearman秩相關系數。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CAP患者臨床特征
36例CAP患者臨床資料如表1所示。重癥CAP組和非重癥CAP組均以男性為主，重癥CAP組男性比例更高（P<0.05）。基礎疾病方面，兩組的糖尿病例數、心腦血管疾病例數、慢性腎病例數和慢性肝病例數差異無統計學意義（P>0.05）。重癥CAP組C反應蛋白及降鈣素原水平顯著高于非重癥CAP組（P<0.05）。重癥CAP組入住ICU例數顯著高于非重癥CAP組（P<0.05），死亡例數更多但差異無統計學意義（P>0.05）。
表1
入組CAP患者臨床特征［（
）/例］
2.2 PBMC中MIZ1 mRNA的表達水平與CAP嚴重程度的關系
RT- qPCR檢測結果顯示，相比非重癥CAP患者，重癥CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA的表達水平顯著降低（P=0.033）。結果見圖1。根據CAP為重癥或非重癥繪制PBMC中MIZ1 mRNA的表達水平的ROC曲線，AUC=0.731，P=0.018（圖2）。結果顯示，對于CAP患者，MIZ1可以良好區分重癥和非重癥。
圖1
非重癥CAP患者和重癥CAP患者MIZ1 mRNA的表達水平的比較（n=18）
散點圖，橫線顯示均數和標準差。
圖2
MIZ1診斷重癥CAP的ROC曲線
AUC=0.731，
2.3 重癥CAP患者MIZ1 mRNA與血清炎癥因子的關系
ELISA檢測結果顯示，血清炎癥因子水平中的IL-6、IL-10、IFN-α檢測結果不符合正態分布，IL-8檢測結果符合正態分布，具體結果見表2。相比非重癥CAP患者，重癥CAP患者的IL-6、IL-10顯示出增高趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
非重癥和重癥CAP患者的炎癥因子水平［pg/mL，M（Q1，Q3）/（
）］
對重癥CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA水平與血清IL-6、IL-8、IL-10和IFN-α水平分別進行相關分析，發現重癥CAP患者MIZ1 mRNA水平與IL-10水平呈負相關（圖3），Spearman相關系數為–0.620，P=0.042。MIZ1 mRNA水平與IL-6、IL-8、IFN-α水平無顯著相關性。
圖3
重癥CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA與血清IL-10的相關性（n=11）
散點圖。MIZ1 mRNA與IL-10呈負相關，Spearman相關系數為–0.620，
3 討論
本研究發現，重癥CAP和非重癥CAP患者PBMC中的MIZ1在轉錄水平上呈現出顯著差異。既往國內外研究在不同組織或細胞系、感染或非感染性炎癥中均發現MIZ1的表達和功能常與炎癥活動的程度負相關。敲除小鼠肺上皮細胞MIZ1蛋白的POZ結構使MIZ1轉錄功能缺失后，再用內毒素誘導小鼠炎癥，小鼠出現了過度炎癥、肺損傷加重和病死率升高[4]。另一項研究顯示敲除小鼠肺上皮細胞MIZ1蛋白的POZ結構會增強流感病毒感染后的肺部炎癥反應[6]。在大鼠上進行急性壞死性胰腺炎建模后，發現在胰腺和肺中MIZ1的mRNA和蛋白的水平與胰腺和肺組織的損傷程度負相關[7]。MIZ1還可限制肝細胞驅動的炎癥[12]，敲除小鼠肝細胞中的MIZ1讓腫瘤浸潤巨噬細胞的極化傾向于促進促炎表型。本研究在外周血中發現MIZ1與炎癥活動的相關性，發現重癥CAP患者PBMC中的MIZ1 mRNA表達水平比非重癥CAP患者低，該結果與既往研究相符。并且，ROC曲線顯示PBMC中的MIZ1水平可以良好區分出重癥和非重癥CAP，提示PBMC中的MIZ1水平有作為重癥CAP的標志物的潛力。
結合文獻資料，細胞不同部位的MIZ1參與不同的調控作用，從兩個方面參與炎癥活動：（1）位于細胞質中的MIZ1負向調節腫瘤壞死因子-α（TNF-α）激活c-Jun氨基末端激酶信號通路的過程，抑制TNF-α的后續作用[4-6]；（2）位于細胞核內的MIZ1可抑制核因子κB信號通路的增強因子CCAAT增強子結合蛋白δ的轉錄活性，從而負向調節細菌及內毒素誘導的過度的炎癥反應[6]。
本研究發現重癥CAP患者PBMC中的MIZ1與血清IL-10的水平呈負相關。既往研究發現，甲型流感病毒感染后MIZ1基因缺陷細胞中的IL-6表達水平高于野生型細胞[6]。該項研究還發現MIZ1可以抑制IFN-α/β的表達，敲除或敲降MIZ1可以使感染流感病毒的小鼠肺上皮細胞中的IFN-α/β升高[6]。既往無MIZ1與IL-10相關性的報道。有文獻報道，與健康個體相比CAP患者血清中IL-10水平顯著增加，且重癥CAP患者血清IL-10水平明顯高于非重癥患者和健康個體[13]。本研究中不同組IL-10水平的變化趨勢與既往報道相符。同時我們發現，重癥CAP患者PBMC中的MIZ1與血清IL-10的水平呈負相關，該結果提示MIZ1可能影響IL-10的表達，可針對兩者之間是否存在上下游關系展開后續研究，進一步探索MIZ1參與的炎癥調控過程。
本研究為重癥CAP患者的診斷提供了新思路，加深了對重癥CAP的發生發展機制的認識，為重癥CAP的防治及新藥研發提供了新方向。同時，本研究存在著局限性：本研究納入病例偏少，且缺乏對于MIZ1與IL-10相互作用的關系和機制的探索，需要后續的細胞實驗及動物實驗加以闡釋。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
社區獲得性肺炎（CAP）是最常見的感染性疾病之一，也是重要的死亡原因之一[1]。其中，重癥CAP的醫院病死率可達到25%～50%[2]。因此，優化重癥CAP患者的早期診斷方法、尋找藥物研發的新思路具有重要意義。Myc相互作用的鋅指蛋白1（MIZ1）是由zbtb17基因編碼的蛋白，由N端的痘病毒和鋅指（POZ）結構和在其C端的13個鋅指蛋白結構組成。研究發現MIZ1在機體的炎癥調控中發揮作用[3]，并且通過調節血清白細胞介素（IL）-6、α干擾素（IFN-α）、IFN-β等多種炎癥因子的表達來起到調控炎癥反應的作用[4-7]。針對淋巴瘤的研究發現MIZ1在淋巴細胞的發育以及淋巴系腫瘤的發生發展中起重要的調控作用[8-9]。但對外周血單個核細胞（PBMC）中的MIZ1是否參與CAP的全身炎癥反應，目前尚無相關研究。本研究收集CAP患者的臨床標本，檢測患者PBMC中MIZ1 mRNA水平，探尋PBMC中MIZ1與CAP病情的嚴重程度的關系并探究其與炎癥因子的關系，以期尋找重癥CAP患者早期診斷的新指標并為重癥CAP的防治及新藥研發提供新的方向。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入2018年4月至2019年6月在北京朝陽醫院感染和臨床微生物科和呼吸科住院治療的CAP患者36例。CAP患者符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016版）》診斷標準[10]，并排除存在嚴重的非感染性肺部基礎病，包括慢性阻塞性肺疾病、肺結核、肺部腫瘤、肺水腫、肺不張、肺栓塞等的患者。依照《ATS/IDSA成人社區獲得性肺炎的診斷和治療臨床實踐指南（2019版）》重癥CAP判定標準[11]，將CAP患者分為重癥CAP和非重癥CAP兩組，各18例。本研究得到北京朝陽醫院倫理委員會的批準（2020-科-46）。所有參與者簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 臨床資料收集
收集患者性別、年齡、合并癥、轉歸及入院24 h內白細胞計數、C反應蛋白、降鈣素原的檢測結果。
1.2.2 樣本處理
采用肝素抗凝管采集CAP患者入院24 h內3 mL外周靜脈血，密度梯度離心法分離PBMC，同時采集CAP患者4 mL外周靜脈血離心分離血清。分別凍存于–80 ℃冰箱。
1.2.3 逆轉錄–定量聚合酶鏈式反應
使用Trizol reagent 試劑盒（Life Technologies公司，美國）從PBMC中提取總RNA，使用RNeasy mini kit試劑盒（Qiagen公司，美國）進行純化，使用SuperScript?II RT試劑（Thermo fisher公司，美國）進行RNA逆轉錄，使用FastSYBR?GreenMaster Mix試劑在LightCycler480 實時熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士）上進行逆轉錄–定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR），以3-磷酸甘油醛脫氫酶為內參。MIZ1引物：上游5’-GGTTCCGCCCGACTCTAACA-3’，下游5’ CTCGTCCGGCTCATTACCTG-3’。引物由睿博興科生物技術有限公司（北京）合成。RT- qPCR 數據分析采用相對定量法，MIZ1 mRNA表達水平以 2–ΔΔCt表示。
1.2.4 酶聯免疫吸附試驗
使用IL-6、IL-8、IL-10、IFN-α 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（達科為公司，中國）按照標準步驟進行檢測。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件。符合正態分布的連續變量以均數±標準差（±s）表示，不符合正態分布的連續變量以中位數（四分位數）［M（Q1，Q3）］表示。組間比較用t檢驗或非參數檢驗中的Mann-Whitney U檢驗。組間構成比的比較采用χ2檢驗。診斷試驗評價采用受試者工作特征（ROC）曲線和曲線下面積（AUC）。相關分析采用Spearman秩相關系數。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CAP患者臨床特征
36例CAP患者臨床資料如表1所示。重癥CAP組和非重癥CAP組均以男性為主，重癥CAP組男性比例更高（P<0.05）。基礎疾病方面，兩組的糖尿病例數、心腦血管疾病例數、慢性腎病例數和慢性肝病例數差異無統計學意義（P>0.05）。重癥CAP組C反應蛋白及降鈣素原水平顯著高于非重癥CAP組（P<0.05）。重癥CAP組入住ICU例數顯著高于非重癥CAP組（P<0.05），死亡例數更多但差異無統計學意義（P>0.05）。
表1
入組CAP患者臨床特征［（）/例］
2.2 PBMC中MIZ1 mRNA的表達水平與CAP嚴重程度的關系
RT- qPCR檢測結果顯示，相比非重癥CAP患者，重癥CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA的表達水平顯著降低（P=0.033）。結果見圖1。根據CAP為重癥或非重癥繪制PBMC中MIZ1 mRNA的表達水平的ROC曲線，AUC=0.731，P=0.018（圖2）。結果顯示，對于CAP患者，MIZ1可以良好區分重癥和非重癥。
圖1
非重癥CAP患者和重癥CAP患者MIZ1 mRNA的表達水平的比較（n=18）
散點圖，橫線顯示均數和標準差。
圖2
MIZ1診斷重癥CAP的ROC曲線
AUC=0.731，
2.3 重癥CAP患者MIZ1 mRNA與血清炎癥因子的關系
ELISA檢測結果顯示，血清炎癥因子水平中的IL-6、IL-10、IFN-α檢測結果不符合正態分布，IL-8檢測結果符合正態分布，具體結果見表2。相比非重癥CAP患者，重癥CAP患者的IL-6、IL-10顯示出增高趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
非重癥和重癥CAP患者的炎癥因子水平［pg/mL，M（Q1，Q3）/（）］
對重癥CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA水平與血清IL-6、IL-8、IL-10和IFN-α水平分別進行相關分析，發現重癥CAP患者MIZ1 mRNA水平與IL-10水平呈負相關（圖3），Spearman相關系數為–0.620，P=0.042。MIZ1 mRNA水平與IL-6、IL-8、IFN-α水平無顯著相關性。
圖3
重癥CAP患者PBMC中MIZ1 mRNA與血清IL-10的相關性（n=11）
散點圖。MIZ1 mRNA與IL-10呈負相關，Spearman相關系數為–0.620，
3 討論
本研究發現，重癥CAP和非重癥CAP患者PBMC中的MIZ1在轉錄水平上呈現出顯著差異。既往國內外研究在不同組織或細胞系、感染或非感染性炎癥中均發現MIZ1的表達和功能常與炎癥活動的程度負相關。敲除小鼠肺上皮細胞MIZ1蛋白的POZ結構使MIZ1轉錄功能缺失后，再用內毒素誘導小鼠炎癥，小鼠出現了過度炎癥、肺損傷加重和病死率升高[4]。另一項研究顯示敲除小鼠肺上皮細胞MIZ1蛋白的POZ結構會增強流感病毒感染后的肺部炎癥反應[6]。在大鼠上進行急性壞死性胰腺炎建模后，發現在胰腺和肺中MIZ1的mRNA和蛋白的水平與胰腺和肺組織的損傷程度負相關[7]。MIZ1還可限制肝細胞驅動的炎癥[12]，敲除小鼠肝細胞中的MIZ1讓腫瘤浸潤巨噬細胞的極化傾向于促進促炎表型。本研究在外周血中發現MIZ1與炎癥活動的相關性，發現重癥CAP患者PBMC中的MIZ1 mRNA表達水平比非重癥CAP患者低，該結果與既往研究相符。并且，ROC曲線顯示PBMC中的MIZ1水平可以良好區分出重癥和非重癥CAP，提示PBMC中的MIZ1水平有作為重癥CAP的標志物的潛力。
結合文獻資料，細胞不同部位的MIZ1參與不同的調控作用，從兩個方面參與炎癥活動：（1）位于細胞質中的MIZ1負向調節腫瘤壞死因子-α（TNF-α）激活c-Jun氨基末端激酶信號通路的過程，抑制TNF-α的后續作用[4-6]；（2）位于細胞核內的MIZ1可抑制核因子κB信號通路的增強因子CCAAT增強子結合蛋白δ的轉錄活性，從而負向調節細菌及內毒素誘導的過度的炎癥反應[6]。
本研究發現重癥CAP患者PBMC中的MIZ1與血清IL-10的水平呈負相關。既往研究發現，甲型流感病毒感染后MIZ1基因缺陷細胞中的IL-6表達水平高于野生型細胞[6]。該項研究還發現MIZ1可以抑制IFN-α/β的表達，敲除或敲降MIZ1可以使感染流感病毒的小鼠肺上皮細胞中的IFN-α/β升高[6]。既往無MIZ1與IL-10相關性的報道。有文獻報道，與健康個體相比CAP患者血清中IL-10水平顯著增加，且重癥CAP患者血清IL-10水平明顯高于非重癥患者和健康個體[13]。本研究中不同組IL-10水平的變化趨勢與既往報道相符。同時我們發現，重癥CAP患者PBMC中的MIZ1與血清IL-10的水平呈負相關，該結果提示MIZ1可能影響IL-10的表達，可針對兩者之間是否存在上下游關系展開后續研究，進一步探索MIZ1參與的炎癥調控過程。
本研究為重癥CAP患者的診斷提供了新思路，加深了對重癥CAP的發生發展機制的認識，為重癥CAP的防治及新藥研發提供了新方向。同時，本研究存在著局限性：本研究納入病例偏少，且缺乏對于MIZ1與IL-10相互作用的關系和機制的探索，需要后續的細胞實驗及動物實驗加以闡釋。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
