引用本文： 王遠芳, 鄧杰倫, 敖科萍, 李冬冬, 謝軼, 應斌武. 三種 SARS-CoV-2 抗體膠體金試劑診斷效能評價及假陽性控制策略探討. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(3): 214-218. doi: 10.7507/1671-6205.202003194 復制
冠狀病毒是屬于冠狀病毒科的有包膜的非節段的正義 RNA 病毒，包括 CoV-229E、OC43、NL63 和 HKU1，廣泛分布于人和其他哺乳動物中[1]，通常引起輕度的呼吸道疾病，但近年發生的重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrom，SARS）和中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrom，MERS）也是由冠狀病毒引起的，分別為 SARS-CoV 和 MERS-CoV[2-3]。而最近發現了一類新型冠狀病毒（SARS-CoV-2），被感染的患者臨床特征與 SARS 和 MERS 有相似之處[4]，且表現出較大的流行潛力[5]，相關疾病被命名為 COVID-19，中文名稱為新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠肺炎）。
與多數病毒感染疾病的實驗室診斷方法類似[6]，SARS-CoV-2 的實驗室診斷方法包括針對病毒核酸的定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time PCR，RT-PCR），和針對 IgM 和 IgG 抗體的化學發光法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLIA）、酶聯免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫層析法（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）等多種方法[7-8]。核酸檢測是最早被認可用于診斷新冠肺炎的方法，而在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（第七版）》中，抗體檢測已經被納入確診方法之一[9]。GICA 作為一種快速、簡便的床旁檢測方式，適用于基層及快速篩查。目前，多種 GICA 試劑已或待上市，本研究中，我們著重對三種 GICA 試劑的診斷能力進行探討。
1 材料與方法
1.1 標本采集
血清標本包括 33 份新冠肺炎確診患者標本和 45 份排除新冠肺炎患者標本。確診患者血清標本來源于四川大學華西醫院 2020 年 1～2 月確診的 12 例新冠肺炎患者的不同感染時間點的血清樣本，確診標準依據《新型冠狀病毒肺炎診療方案（第六版）》，血清收集時間最早為發病后第 3 天，最晚為發病后第 35 天。排除標本參照新型冠狀病毒肺炎診療方案（第七版），選取于同期 SARS-CoV-2 核酸檢測兩次陰性（間隔時間 24 h 以上），且 14 d 內無新冠肺炎臨床表現（發熱、干咳、乏力）的患者標本；其中合并其他呼吸道病毒感染患者樣本 21 例（鼻病毒、副流感病毒、博卡病毒、腺病毒和偏肺病毒），人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）患者樣本 5 例，高類風濕因子（rheumatoid factor，RF）樣本 4 例（RF 分別為 21 IU/mL、242 IU/mL、393 IU/mL、900 IU/mL），黃疸樣本、溶血樣本以及脂血標本各 5 例。78 份標本均采集全血，3 000 r/min 離心分離血清，嚴格密封后于–80 ℃ 保存，2 周內檢測。
1.2 方法
本研究采用北京熱景生物技術有限公司（試劑 A）、廣州萬孚生物技術有限公司（試劑 B）、成都華西精準醫學產業技術有限公司（試劑 C）三種 GICA 法試劑盒分別檢測患者血清樣本中的 IgM、IgG 和總抗體（IgM 與 IgG 聯合檢測），見表 1。使用羅氏通用稀釋液手工倍比稀釋樣本，用于滴度檢測，稀釋滴度為 1∶2、1∶4、1∶8 和 1∶16，其余操作流程遵循試劑說明書，以肉眼可見檢測線為陽性。
表1
三種 SARS-CoV-2 檢測試劑的基本特征
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件。
2 結果
2.1 特異性抗原、抗體檢測結果
采用三種 GICA 法試劑盒檢測 78 例樣本，敏感性 66.7%～90.9%；特異性最高可達到 100.0%，最低為 73.3%；陽性預測值 71.4%～100.0%，陰性預測值 80.4%～91.7%；漏診率和誤診率分別為 9.1%～33.3% 和 0～26.7%（表 2）。
表2
三種 GICA 法試劑盒檢測 78 份血清標本的能力評價
2.2 抗體檢出的影響因素
三種試劑檢測 33 份陽性標本，陽性率隨稀釋滴度的升高而下降（表 3）。試劑 A 的 IgM 在滴度 1∶8 水平時檢出率明顯下降（χ2=9.58，P=0.002），試劑 A-總抗體試劑 B-總抗體和試劑 C-IgM 隨滴度上升，檢出率逐漸下降。試劑 C-IgG 檢出率下降程度不明顯。在 1∶4 的滴度水平，所有試劑的陽性檢出率均超過 50%。
表3
三種 GICA 法試劑盒對不同滴度陽性血清標本的檢出率（%）
針對 12 例有多次采血時間的患者，檢測不同時間點的血清標本，發現隨發病時長增加，三種試劑的檢出率均有上升，IgG 的檢出時長明顯長于 IgM 和總抗體。在檢測終點時間（35 天），未見 IgM 或 IgG 抗體檢出率降低。結果見表 4。
表4
三種 GICA 法試劑盒不同檢測時間點陽性血清標本的檢出率（%）
對于不同類型的干擾物質，三種試劑的假陽性率不一。試劑 A-IgM 抗體僅在其他病毒感染標本中未見假陽性；試劑 B-總抗體在其他病毒感染、脂血、黃疸標本中未見假陽性；試劑 C-IgM 抗體在 HIV 感染、高 RF 標本中未見假陽性；試劑 A-總抗體和試劑 C-IgG 抗體在所有干擾標本中均未見假陽性。結果見表 5。
表5
三種 GICA 法試劑盒抗干擾能力（%）
2.3 兩種 GICA 法試劑聯合檢測
選用三種 GICA 法試劑中的兩種聯合檢測，以任意一種試劑陽性為抗體陽性，兩種試劑均陰性為抗體陰性。診斷性能見表 6。
表6
試劑盒聯合檢測 78 份血清標本的能力評價
3 討論
GICA 法快速診斷試劑相比 ELISA 和 CLIA 法，有檢測速度快、檢測條件要求低等優點，便于床旁檢測的開展，且采血對與患者密切接觸的醫護人員的風險的小于采集咽拭子，對于本次新冠肺炎在人群中的流行病學調查可有較大的幫助。與許多感染相同[10-11]，本次的新冠肺炎患者最早可在發病第 3 天就檢測到 IgM 抗體，在第 10 天之后，IgG 抗體檢出率也明顯增加。抗體窗口期與冠狀病毒核酸檢測類似[12]，而 GICA 法對樣品質量的要求不如基于核酸的檢測嚴格，不管呼吸道樣本中是否存在病毒，都可以檢測到特定抗體的存在，從而可以避免核酸檢測中因采樣不符合要求而導致大量假陰性結果[13-14]。
本研究使用的三種試劑分別檢測 SARS-CoV-2 的 IgM 抗體、IgG 抗體和總抗體。IgM 抗體的敏感性總體高于 IgG 抗體和總抗體，但同時 IgM 抗體的誤診率也明顯較高，陽性預測值較差（71.4% 和 83.3%）。IgG 的檢測在特異性和陽性預測值方面表現較好，但敏感性較低，不利于早期診斷。總抗體作為將 IgM 和 IgG 共同檢測的方法，在各項評價指標中的結果均較高，總抗體檢測的約登指數最高。在臨床使用 GICA 試劑的過程中，建議使用總抗體檢測試劑，以保證靈敏度和特異性，降低因假陽性和假陰性帶來的漏診和誤診，或將總抗體與 IgG/IgM 抗體聯合檢測。相比于 IgG 和總抗體，IgM 抗體的檢測陽性率隨滴度增加，下降更為明顯，但所有試劑在均可保證在稀釋至 1: 8 時檢出率大于 50%。
在 SARS 和 MERS 的研究中，由于針對普通感冒 CoV 的抗體人群中的高血清陽性率，加上針對免疫原性 CoV 蛋白保守部分的抗體交叉反應存在，可能會造成假陽性結果[14-15]，此論點在本次 SARS-CoV-2 中還未進行過研究，但由于 SARS-CoV-2 與 SARS 病毒的同一性較高（約 79%）[16]，產生交叉反應的可能性也存在，為該試劑的假陽性埋下伏筆。據報道，SARS-CoV 的 N 蛋白與人類Ⅰ型冠狀病毒 229E，貓傳染性腹膜炎病毒和豬傳染性胃腸炎病毒等抗原性Ⅰ類動物冠狀病毒的抗血清發生抗原性交叉反應。因此，使用完整的 N 蛋白作為抗原進行血清學檢測可能會導致特異性和敏感性問題[17]，本研究中三類試劑的 IgM 和總抗體使用 S 蛋白全長和 N 蛋白全長包被，總抗體額外增加 S-SRBD+N 蛋白包被，有造成檢測結果假陽性的可能。針對 MERS 的假陽性問題，已經開發出使用 MERS-CoV S 蛋白的 S1 片段作為抗原的無細胞蛋白微陣列，而且競爭法可有效降低抗體檢測的假陽性率[18]，但目前 GICA 法還未見競爭法試劑面世，因此我們認為這樣的方法可以在 SARS-CoV-2 的后續研究中進行探討。
高 RF 對三種試劑的干擾均較大，假陽性率最高可達到 60%。RF 是針對 IgG 的可結晶片段區域上的抗原決定簇的自身抗體，因此，RF 可以與捕獲抗體（膠體金標記的抗體）結合。通過在條帶上捕獲抗體，可以很容易地檢測到這種抗體復合物，從而導致假陽性[19]，這也是本研究中 IgM 假陽性率高于 IgG 的可能原因。故對于自身免疫病患者，GICA 法的結果判斷需要慎重。另外，HIV 感染患者使用 GICA 法檢測結果也可能出現假陽性結果，這在其他病毒感染疾病的檢測中很少發現，可能是由于 HIV 與 SARS-CoV-2 在基因序列有相似之處，有可能造成交叉反應[20]。在針對臨床患者的檢測中，需關注患者是否為 HIV 感染者。
除了感染性疾病和自身免疫性疾病產生的交叉反應外，血清標本的質量也對檢測結果有一定影響。本研究發現脂血、溶血和黃疸可影響 IgM 的檢測，但對 IgG 和總抗體的結果無影響。脂血血清中的脂蛋白可以非特異性地干擾各種類型的免疫檢測，主要原因是阻斷對應的的結合位點，對于不同性質的免疫反應，干擾可導致結果假陰性或假陽性[21]，相比雙抗原夾心法檢測 IgG 和總抗體，捕獲法更容易受到甘油三酯的影響。溶血和黃疸標本由于血清顏色較深，造成檢測條帶本底過重，對肉眼檢測的結果有較大影響。中和實驗在一定程度上可以消除交叉反應，降低假陽性率[14, 18]。
綜上，GICA 法快速診斷試劑是一種便捷、安全的檢測方式，試劑性能符合篩查實驗的要求，對新冠肺炎的檢測結果較為可靠。但試劑對標本的要求較高，應特別注意標本前處理，方法易受到多種干擾因素的影響。臨床實驗室應注意不同試劑在檢出能力和潛在交叉反應之間的性能差異，或使用多種抗體聯合檢測，并制定出合適本實驗室的檢測策略。本研究有一些局限性。首先，標本數量偏少；其次，暫未考慮流行率對診斷效能的影響。第三，本研究在 HIV 引起的假陽性方面的研究亟待深入，更大的干擾樣本量有助于對試劑干擾因素的研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
冠狀病毒是屬于冠狀病毒科的有包膜的非節段的正義 RNA 病毒，包括 CoV-229E、OC43、NL63 和 HKU1，廣泛分布于人和其他哺乳動物中[1]，通常引起輕度的呼吸道疾病，但近年發生的重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrom，SARS）和中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrom，MERS）也是由冠狀病毒引起的，分別為 SARS-CoV 和 MERS-CoV[2-3]。而最近發現了一類新型冠狀病毒（SARS-CoV-2），被感染的患者臨床特征與 SARS 和 MERS 有相似之處[4]，且表現出較大的流行潛力[5]，相關疾病被命名為 COVID-19，中文名稱為新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠肺炎）。
與多數病毒感染疾病的實驗室診斷方法類似[6]，SARS-CoV-2 的實驗室診斷方法包括針對病毒核酸的定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time PCR，RT-PCR），和針對 IgM 和 IgG 抗體的化學發光法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLIA）、酶聯免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫層析法（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）等多種方法[7-8]。核酸檢測是最早被認可用于診斷新冠肺炎的方法，而在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（第七版）》中，抗體檢測已經被納入確診方法之一[9]。GICA 作為一種快速、簡便的床旁檢測方式，適用于基層及快速篩查。目前，多種 GICA 試劑已或待上市，本研究中，我們著重對三種 GICA 試劑的診斷能力進行探討。
1 材料與方法
1.1 標本采集
血清標本包括 33 份新冠肺炎確診患者標本和 45 份排除新冠肺炎患者標本。確診患者血清標本來源于四川大學華西醫院 2020 年 1～2 月確診的 12 例新冠肺炎患者的不同感染時間點的血清樣本，確診標準依據《新型冠狀病毒肺炎診療方案（第六版）》，血清收集時間最早為發病后第 3 天，最晚為發病后第 35 天。排除標本參照新型冠狀病毒肺炎診療方案（第七版），選取于同期 SARS-CoV-2 核酸檢測兩次陰性（間隔時間 24 h 以上），且 14 d 內無新冠肺炎臨床表現（發熱、干咳、乏力）的患者標本；其中合并其他呼吸道病毒感染患者樣本 21 例（鼻病毒、副流感病毒、博卡病毒、腺病毒和偏肺病毒），人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）患者樣本 5 例，高類風濕因子（rheumatoid factor，RF）樣本 4 例（RF 分別為 21 IU/mL、242 IU/mL、393 IU/mL、900 IU/mL），黃疸樣本、溶血樣本以及脂血標本各 5 例。78 份標本均采集全血，3 000 r/min 離心分離血清，嚴格密封后于–80 ℃ 保存，2 周內檢測。
1.2 方法
本研究采用北京熱景生物技術有限公司（試劑 A）、廣州萬孚生物技術有限公司（試劑 B）、成都華西精準醫學產業技術有限公司（試劑 C）三種 GICA 法試劑盒分別檢測患者血清樣本中的 IgM、IgG 和總抗體（IgM 與 IgG 聯合檢測），見表 1。使用羅氏通用稀釋液手工倍比稀釋樣本，用于滴度檢測，稀釋滴度為 1∶2、1∶4、1∶8 和 1∶16，其余操作流程遵循試劑說明書，以肉眼可見檢測線為陽性。
表1
三種 SARS-CoV-2 檢測試劑的基本特征
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件。
2 結果
2.1 特異性抗原、抗體檢測結果
采用三種 GICA 法試劑盒檢測 78 例樣本，敏感性 66.7%～90.9%；特異性最高可達到 100.0%，最低為 73.3%；陽性預測值 71.4%～100.0%，陰性預測值 80.4%～91.7%；漏診率和誤診率分別為 9.1%～33.3% 和 0～26.7%（表 2）。
表2
三種 GICA 法試劑盒檢測 78 份血清標本的能力評價
2.2 抗體檢出的影響因素
三種試劑檢測 33 份陽性標本，陽性率隨稀釋滴度的升高而下降（表 3）。試劑 A 的 IgM 在滴度 1∶8 水平時檢出率明顯下降（χ2=9.58，P=0.002），試劑 A-總抗體試劑 B-總抗體和試劑 C-IgM 隨滴度上升，檢出率逐漸下降。試劑 C-IgG 檢出率下降程度不明顯。在 1∶4 的滴度水平，所有試劑的陽性檢出率均超過 50%。
表3
三種 GICA 法試劑盒對不同滴度陽性血清標本的檢出率（%）
針對 12 例有多次采血時間的患者，檢測不同時間點的血清標本，發現隨發病時長增加，三種試劑的檢出率均有上升，IgG 的檢出時長明顯長于 IgM 和總抗體。在檢測終點時間（35 天），未見 IgM 或 IgG 抗體檢出率降低。結果見表 4。
表4
三種 GICA 法試劑盒不同檢測時間點陽性血清標本的檢出率（%）
對于不同類型的干擾物質，三種試劑的假陽性率不一。試劑 A-IgM 抗體僅在其他病毒感染標本中未見假陽性；試劑 B-總抗體在其他病毒感染、脂血、黃疸標本中未見假陽性；試劑 C-IgM 抗體在 HIV 感染、高 RF 標本中未見假陽性；試劑 A-總抗體和試劑 C-IgG 抗體在所有干擾標本中均未見假陽性。結果見表 5。
表5
三種 GICA 法試劑盒抗干擾能力（%）
2.3 兩種 GICA 法試劑聯合檢測
選用三種 GICA 法試劑中的兩種聯合檢測，以任意一種試劑陽性為抗體陽性，兩種試劑均陰性為抗體陰性。診斷性能見表 6。
表6
試劑盒聯合檢測 78 份血清標本的能力評價
3 討論
GICA 法快速診斷試劑相比 ELISA 和 CLIA 法，有檢測速度快、檢測條件要求低等優點，便于床旁檢測的開展，且采血對與患者密切接觸的醫護人員的風險的小于采集咽拭子，對于本次新冠肺炎在人群中的流行病學調查可有較大的幫助。與許多感染相同[10-11]，本次的新冠肺炎患者最早可在發病第 3 天就檢測到 IgM 抗體，在第 10 天之后，IgG 抗體檢出率也明顯增加。抗體窗口期與冠狀病毒核酸檢測類似[12]，而 GICA 法對樣品質量的要求不如基于核酸的檢測嚴格，不管呼吸道樣本中是否存在病毒，都可以檢測到特定抗體的存在，從而可以避免核酸檢測中因采樣不符合要求而導致大量假陰性結果[13-14]。
本研究使用的三種試劑分別檢測 SARS-CoV-2 的 IgM 抗體、IgG 抗體和總抗體。IgM 抗體的敏感性總體高于 IgG 抗體和總抗體，但同時 IgM 抗體的誤診率也明顯較高，陽性預測值較差（71.4% 和 83.3%）。IgG 的檢測在特異性和陽性預測值方面表現較好，但敏感性較低，不利于早期診斷。總抗體作為將 IgM 和 IgG 共同檢測的方法，在各項評價指標中的結果均較高，總抗體檢測的約登指數最高。在臨床使用 GICA 試劑的過程中，建議使用總抗體檢測試劑，以保證靈敏度和特異性，降低因假陽性和假陰性帶來的漏診和誤診，或將總抗體與 IgG/IgM 抗體聯合檢測。相比于 IgG 和總抗體，IgM 抗體的檢測陽性率隨滴度增加，下降更為明顯，但所有試劑在均可保證在稀釋至 1: 8 時檢出率大于 50%。
在 SARS 和 MERS 的研究中，由于針對普通感冒 CoV 的抗體人群中的高血清陽性率，加上針對免疫原性 CoV 蛋白保守部分的抗體交叉反應存在，可能會造成假陽性結果[14-15]，此論點在本次 SARS-CoV-2 中還未進行過研究，但由于 SARS-CoV-2 與 SARS 病毒的同一性較高（約 79%）[16]，產生交叉反應的可能性也存在，為該試劑的假陽性埋下伏筆。據報道，SARS-CoV 的 N 蛋白與人類Ⅰ型冠狀病毒 229E，貓傳染性腹膜炎病毒和豬傳染性胃腸炎病毒等抗原性Ⅰ類動物冠狀病毒的抗血清發生抗原性交叉反應。因此，使用完整的 N 蛋白作為抗原進行血清學檢測可能會導致特異性和敏感性問題[17]，本研究中三類試劑的 IgM 和總抗體使用 S 蛋白全長和 N 蛋白全長包被，總抗體額外增加 S-SRBD+N 蛋白包被，有造成檢測結果假陽性的可能。針對 MERS 的假陽性問題，已經開發出使用 MERS-CoV S 蛋白的 S1 片段作為抗原的無細胞蛋白微陣列，而且競爭法可有效降低抗體檢測的假陽性率[18]，但目前 GICA 法還未見競爭法試劑面世，因此我們認為這樣的方法可以在 SARS-CoV-2 的后續研究中進行探討。
高 RF 對三種試劑的干擾均較大，假陽性率最高可達到 60%。RF 是針對 IgG 的可結晶片段區域上的抗原決定簇的自身抗體，因此，RF 可以與捕獲抗體（膠體金標記的抗體）結合。通過在條帶上捕獲抗體，可以很容易地檢測到這種抗體復合物，從而導致假陽性[19]，這也是本研究中 IgM 假陽性率高于 IgG 的可能原因。故對于自身免疫病患者，GICA 法的結果判斷需要慎重。另外，HIV 感染患者使用 GICA 法檢測結果也可能出現假陽性結果，這在其他病毒感染疾病的檢測中很少發現，可能是由于 HIV 與 SARS-CoV-2 在基因序列有相似之處，有可能造成交叉反應[20]。在針對臨床患者的檢測中，需關注患者是否為 HIV 感染者。
除了感染性疾病和自身免疫性疾病產生的交叉反應外，血清標本的質量也對檢測結果有一定影響。本研究發現脂血、溶血和黃疸可影響 IgM 的檢測，但對 IgG 和總抗體的結果無影響。脂血血清中的脂蛋白可以非特異性地干擾各種類型的免疫檢測，主要原因是阻斷對應的的結合位點，對于不同性質的免疫反應，干擾可導致結果假陰性或假陽性[21]，相比雙抗原夾心法檢測 IgG 和總抗體，捕獲法更容易受到甘油三酯的影響。溶血和黃疸標本由于血清顏色較深，造成檢測條帶本底過重，對肉眼檢測的結果有較大影響。中和實驗在一定程度上可以消除交叉反應，降低假陽性率[14, 18]。
綜上，GICA 法快速診斷試劑是一種便捷、安全的檢測方式，試劑性能符合篩查實驗的要求，對新冠肺炎的檢測結果較為可靠。但試劑對標本的要求較高，應特別注意標本前處理，方法易受到多種干擾因素的影響。臨床實驗室應注意不同試劑在檢出能力和潛在交叉反應之間的性能差異，或使用多種抗體聯合檢測，并制定出合適本實驗室的檢測策略。本研究有一些局限性。首先，標本數量偏少；其次，暫未考慮流行率對診斷效能的影響。第三，本研究在 HIV 引起的假陽性方面的研究亟待深入，更大的干擾樣本量有助于對試劑干擾因素的研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
