引用本文： 劉利華, 劉元元, 高東田, 李懷生. 痰培養聯合曲霉血清學GM試驗對診斷侵襲性曲霉感染的臨床價值研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(6): 607-609. doi: 10.7507/1671-6205.2016138 復制
近年來，肺部真菌感染的發病率不斷上升[1]，但肺部真菌感染的臨床表現，特別是曲霉感染無特異性[2]，極易誤診或漏診而喪失治療時機。傳統的診斷方法有早期診斷難、痰培養真菌法陽性率低、培養時間長且易受外源性污染等缺點，所以開發一種全新的診斷方法具有重要的現實意義。本研究以臨床診斷為標準，同時采用了痰培養聯合曲霉血清學半乳甘露聚糖(GM)試驗對侵襲性曲霉感染進行診斷，該方法提高了診斷有效率，同時也提高了臨床診斷價值。
對象與方法
一 對象
選取濟寧醫學院附屬醫院2012年7月至2013年7月的住院患者，年齡17~83歲，主要分布在重癥監護室、急診監護室、呼吸內科、腫瘤科、兒童監護室、血液科等，收集臨床癥狀為可疑曲霉感染病例216例。
二 方法
1.樣本采集：收集侵襲性真菌感染的疑似患者的全血標本3 mL，標本均于采血2 h內分離血清，-70 ℃保存，定期檢測，同時送檢痰真菌培養處理。
2.試劑和儀器：GM檢測試劑盒Platelia Aspergillus (法國Bio-Rad公司)，全自動酶聯測定儀(西班牙GRIFOLS公司)，沙堡氯霉素瓊脂糖真菌培養平板(法國梅里埃公司)。
3.試驗方法：痰真菌培養接種沙堡羅培養基放30 ℃培養7 d。GM試驗嚴格按試劑盒說明書進行操作。操作過程：300 μL血清和100 μL處理液加入EP管，混勻100 ℃煮沸3 min；10 000 r/min離心10 min；吸取50 μL處理過的血清上清液和50 μL HRPO2結合的抗GM單抗，加入已包被GM單抗的微孔板中；37 ℃孵育90 min后洗板5次；加入200 μL的底物和200 μL顯色劑，避光反應20~30 min；加入100 μL終止液終止反應。結果判定：在全自動酶聯測定儀主波450 nm，次波620 nm下測定吸光度(A)值。每次試驗均必須以標準血清A值(均值為0.3~0.8)、陽性對照A值(標準A值均值 > 1.5)、陰性對照A值(標準A值均值 < 0.5)作為試驗內質控。患者血清GM檢測結果的計算公式為：A值指數(AI)=被檢血清A值/cut off血清A均值；以AI值≥1.5為GM陽性；GM值 < 1.0為陰性。
4.評估診斷價值：曲霉感染診斷參考歐洲癌癥研究治療組織及真菌研究組(EORTC/MSG)診斷標準。確診：組織病理學證實為真菌，無菌組織及血液培養為真菌；臨床診斷：具有侵襲性曲霉感染宿主因素及臨床表現，同時伴有一項病原學依據。本研究以臨床診斷為標準，評估GM試驗與痰培養單項以及聯合檢測對肺曲霉感染的診斷價值。
三 統計學處理
應用SPSS 17.0軟件進行數據處理，計算單項試驗和聯合試驗的敏感性、特異性、陽性預測者和陰性預測值，繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)。
結果
一 痰真菌培養及GM試驗結果
通過對216例可疑曲霉感染患者的痰液及血清抗原分析，發現真菌培養陽性患者97例，其中曲霉陽性81例(煙曲霉57例、黃曲霉16例、黑曲霉8例)，鐮刀霉菌8例，石膏樣小孢子菌4例，少根霉3例，須癬毛癬菌1例。
GM試驗陽性患者59例。31例患者兩種檢測結果均為陽性，其中29例GM試驗陽性早于痰真菌培養陽性，時間為2~11 d。
二 痰真菌培養和GM試驗以及聯合檢測的敏感性和特異性
216例可疑曲霉感染病例中，最終臨床診斷曲霉感染病例53例，非曲霉菌感染病例163例。GM和真菌培養同時陽性的31例患者中，臨床確診病例30例，陽性率為96.8%。GM陽性而真菌培養陰性28例病例中，臨床確診病例20例，陽性率為71.4%；GM陰性而真菌培養陽性50例病例中，臨床確診病例2例，陽性率為4.0%；GM和真菌培養同時陰性107例，臨床確診病例2例，陽性率為1.9%。與痰真菌培養相比，聯合GM檢測的敏感性(并聯)和特異性(串聯)都有大幅提高。GM試驗與痰培養單項以及聯合檢測對肺曲霉菌感染的診斷價值見表 1。
表1
GM試驗與痰培養單項以及聯合檢測對肺曲霉菌感染的診斷價值[%(例/例)]
三 痰真菌培養和GM試驗及聯合檢測的ROC曲線分析
痰真菌培養診斷肺曲霉菌感染的ROC曲線下面積(AUC)為0.652，95%CI 0.565~0.738。GM試驗診斷肺曲霉菌感染的AUC為0.944，95%CI 0.903~0.985。兩者聯合檢測的AUC為0.960，95%CI 0.929~0.992。結果見圖 1和圖 2。
圖1
痰真菌培養和GM試驗的ROC曲線
圖2
痰真菌培養和GM試驗聯合檢測的ROC曲線
討論
真菌感染嚴重危害人類健康，尤其是曲霉感染，病情進展快，死亡率高，因此臨床上尋找快速、高效、特異的曲霉感染診斷方法十分重要。早期診斷、早期治療對病情的預后有重要意義。GM是曲霉屬真菌細胞壁上的一種半乳甘露聚糖成分，感染早期患者血液中該抗原的含量即可增高，而在細菌及其他真菌感染時不能檢出，故檢測患者血清GM抗原對曲霉感染診斷有重要的價值。本研究結果顯示與國外研究報道相吻合[3-8]。GM檢測試劑盒Platelia Aspergillus (法國Bio-Rad公司)對曲霉的檢測在以AI≥1.5為陽性標準時敏感性為69%，特異性為96%；而當以AI≥1.0為陽性標準時，敏感性為100%，特異性為92%[9-11]。因此，臨床中可將判斷標準適當調整以提高該檢測方法的敏感性或特異性。
利用ELISA法檢測患者血清中的半乳甘露聚糖診斷曲霉菌感染，有很高的敏感性和特異性，標本采集簡單方便，并且診斷時間早于真菌培養法，可達到早期診斷、早期治療、挽救患者生命的目的，可以在臨床上推廣應用。目前β-內酰胺類抗菌藥物是影響GM試驗出現假陽性結果最常見的原因。而傳統方法--真菌培養法有陽性率低、時間較長、痰標本容易造成外源性污染等缺點，易延誤診斷或造成臨床誤診，但可以明確具體的曲霉感染類型。真菌培養和GM試驗兩種方法各有優缺點，聯合兩種方法可互為補充，可將敏感性和特異性提高到98.1%和99.4%。因此，痰真菌培養聯合曲霉血清學試驗對診斷侵襲性曲霉菌感染具有更好的效果，大大提高了臨床診斷價值。
近年來，肺部真菌感染的發病率不斷上升[1]，但肺部真菌感染的臨床表現，特別是曲霉感染無特異性[2]，極易誤診或漏診而喪失治療時機。傳統的診斷方法有早期診斷難、痰培養真菌法陽性率低、培養時間長且易受外源性污染等缺點，所以開發一種全新的診斷方法具有重要的現實意義。本研究以臨床診斷為標準，同時采用了痰培養聯合曲霉血清學半乳甘露聚糖(GM)試驗對侵襲性曲霉感染進行診斷，該方法提高了診斷有效率，同時也提高了臨床診斷價值。
對象與方法
一 對象
選取濟寧醫學院附屬醫院2012年7月至2013年7月的住院患者，年齡17~83歲，主要分布在重癥監護室、急診監護室、呼吸內科、腫瘤科、兒童監護室、血液科等，收集臨床癥狀為可疑曲霉感染病例216例。
二 方法
1.樣本采集：收集侵襲性真菌感染的疑似患者的全血標本3 mL，標本均于采血2 h內分離血清，-70 ℃保存，定期檢測，同時送檢痰真菌培養處理。
2.試劑和儀器：GM檢測試劑盒Platelia Aspergillus (法國Bio-Rad公司)，全自動酶聯測定儀(西班牙GRIFOLS公司)，沙堡氯霉素瓊脂糖真菌培養平板(法國梅里埃公司)。
3.試驗方法：痰真菌培養接種沙堡羅培養基放30 ℃培養7 d。GM試驗嚴格按試劑盒說明書進行操作。操作過程：300 μL血清和100 μL處理液加入EP管，混勻100 ℃煮沸3 min；10 000 r/min離心10 min；吸取50 μL處理過的血清上清液和50 μL HRPO2結合的抗GM單抗，加入已包被GM單抗的微孔板中；37 ℃孵育90 min后洗板5次；加入200 μL的底物和200 μL顯色劑，避光反應20~30 min；加入100 μL終止液終止反應。結果判定：在全自動酶聯測定儀主波450 nm，次波620 nm下測定吸光度(A)值。每次試驗均必須以標準血清A值(均值為0.3~0.8)、陽性對照A值(標準A值均值 > 1.5)、陰性對照A值(標準A值均值 < 0.5)作為試驗內質控。患者血清GM檢測結果的計算公式為：A值指數(AI)=被檢血清A值/cut off血清A均值；以AI值≥1.5為GM陽性；GM值 < 1.0為陰性。
4.評估診斷價值：曲霉感染診斷參考歐洲癌癥研究治療組織及真菌研究組(EORTC/MSG)診斷標準。確診：組織病理學證實為真菌，無菌組織及血液培養為真菌；臨床診斷：具有侵襲性曲霉感染宿主因素及臨床表現，同時伴有一項病原學依據。本研究以臨床診斷為標準，評估GM試驗與痰培養單項以及聯合檢測對肺曲霉感染的診斷價值。
三 統計學處理
應用SPSS 17.0軟件進行數據處理，計算單項試驗和聯合試驗的敏感性、特異性、陽性預測者和陰性預測值，繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)。
結果
一 痰真菌培養及GM試驗結果
通過對216例可疑曲霉感染患者的痰液及血清抗原分析，發現真菌培養陽性患者97例，其中曲霉陽性81例(煙曲霉57例、黃曲霉16例、黑曲霉8例)，鐮刀霉菌8例，石膏樣小孢子菌4例，少根霉3例，須癬毛癬菌1例。
GM試驗陽性患者59例。31例患者兩種檢測結果均為陽性，其中29例GM試驗陽性早于痰真菌培養陽性，時間為2~11 d。
二 痰真菌培養和GM試驗以及聯合檢測的敏感性和特異性
216例可疑曲霉感染病例中，最終臨床診斷曲霉感染病例53例，非曲霉菌感染病例163例。GM和真菌培養同時陽性的31例患者中，臨床確診病例30例，陽性率為96.8%。GM陽性而真菌培養陰性28例病例中，臨床確診病例20例，陽性率為71.4%；GM陰性而真菌培養陽性50例病例中，臨床確診病例2例，陽性率為4.0%；GM和真菌培養同時陰性107例，臨床確診病例2例，陽性率為1.9%。與痰真菌培養相比，聯合GM檢測的敏感性(并聯)和特異性(串聯)都有大幅提高。GM試驗與痰培養單項以及聯合檢測對肺曲霉菌感染的診斷價值見表 1。
表1
GM試驗與痰培養單項以及聯合檢測對肺曲霉菌感染的診斷價值[%(例/例)]
三 痰真菌培養和GM試驗及聯合檢測的ROC曲線分析
痰真菌培養診斷肺曲霉菌感染的ROC曲線下面積(AUC)為0.652，95%CI 0.565~0.738。GM試驗診斷肺曲霉菌感染的AUC為0.944，95%CI 0.903~0.985。兩者聯合檢測的AUC為0.960，95%CI 0.929~0.992。結果見圖 1和圖 2。
圖1
痰真菌培養和GM試驗的ROC曲線
圖2
痰真菌培養和GM試驗聯合檢測的ROC曲線
討論
真菌感染嚴重危害人類健康，尤其是曲霉感染，病情進展快，死亡率高，因此臨床上尋找快速、高效、特異的曲霉感染診斷方法十分重要。早期診斷、早期治療對病情的預后有重要意義。GM是曲霉屬真菌細胞壁上的一種半乳甘露聚糖成分，感染早期患者血液中該抗原的含量即可增高，而在細菌及其他真菌感染時不能檢出，故檢測患者血清GM抗原對曲霉感染診斷有重要的價值。本研究結果顯示與國外研究報道相吻合[3-8]。GM檢測試劑盒Platelia Aspergillus (法國Bio-Rad公司)對曲霉的檢測在以AI≥1.5為陽性標準時敏感性為69%，特異性為96%；而當以AI≥1.0為陽性標準時，敏感性為100%，特異性為92%[9-11]。因此，臨床中可將判斷標準適當調整以提高該檢測方法的敏感性或特異性。
利用ELISA法檢測患者血清中的半乳甘露聚糖診斷曲霉菌感染，有很高的敏感性和特異性，標本采集簡單方便，并且診斷時間早于真菌培養法，可達到早期診斷、早期治療、挽救患者生命的目的，可以在臨床上推廣應用。目前β-內酰胺類抗菌藥物是影響GM試驗出現假陽性結果最常見的原因。而傳統方法--真菌培養法有陽性率低、時間較長、痰標本容易造成外源性污染等缺點，易延誤診斷或造成臨床誤診，但可以明確具體的曲霉感染類型。真菌培養和GM試驗兩種方法各有優缺點，聯合兩種方法可互為補充，可將敏感性和特異性提高到98.1%和99.4%。因此，痰真菌培養聯合曲霉血清學試驗對診斷侵襲性曲霉菌感染具有更好的效果，大大提高了臨床診斷價值。
