引用本文： 朱晨, 趙亞濱, 孔靈菲, 李振華, 康健. 涎液化糖鏈蛋白6在特發性肺纖維化患者支氣管肺泡灌洗液和血清中的表達及臨床意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(3): 225-228. doi: 10.7507/1671-6205.2015058 復制
特發性肺纖維化(IPF)是一種原因不明，主要發生于中老年人，局限于肺的慢性進行性致纖維化的間質性肺炎，是特發性間質性肺炎中最常見的類型，其確診后的中位生存期僅3~5年。IPF通常為隱襲性起病，主要表現為漸進性的呼吸困難伴干咳，肺功能檢查可見限制性通氣功能障礙和彌散功能障礙，約60%的患者死于肺部疾病惡化和呼吸衰竭[1-2]。IPF的發病機制至今尚未完全清楚，成纖維細胞異常增殖分化、凋亡受阻，成纖維細胞灶形成，以及細胞外基質產生增多、降解減少均可導致IPF發生。KL-6是Ⅱ型肺泡上皮細胞膜上的一種糖蛋白，可從Ⅱ型肺泡上皮細胞上脫落進入肺泡腔和血液[3]。研究表明，涎液化糖鏈蛋白6(KL-6)參與了肺纖維化過程[4]。本文旨在研究KL-6在IPF患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清中的表達水平，并與肺功能等指標進行相關性分析，探討它對IPF輔助診斷的臨床價值。
對象與方法
一 對象
選取2012年2月至2014年9月在中國醫科大學附屬第一醫院初診的IPF患者34例，結節病(SAR)Ⅰ期患者10例。IPF組診斷標準嚴格按照《特發性間質性肺纖維化循證診治指南》[5]，所有患者臨床上均有不同程度的進行性呼吸困難和干咳等癥狀，查體有Velcro啰音、杵狀指等，結合病史、肺功能、血氣分析、肺高分辨率CT(HRCT)等檢查，排除了結節病、過敏性肺泡炎、結締組織病等其他類型的彌漫性間質性肺疾病。SAR組主要為病理診斷，結合肺CT排除結核、淋巴瘤等其他類似肉芽腫性疾病，或經經驗性激素治療確診為Ⅰ期SAR患者。患者均簽署知情同意書。
二 方法
1.一般臨床資料：對符合入選標準的患者，記錄患者的性別、年齡、吸煙狀況等一般情況及體征相關信息。
2.肺功能檢測：使用德國耶格肺功能儀檢測，記錄第1秒用力呼氣容積(FEV1)占預計值百分比(FEV1%pred)、用力肺活量(FVC)占預計值百分比(FVC%pred)、一氧化碳彌散量(DLCO)占預計值百分比(DLCO%pred)。
3.纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗：右肺中葉(B4或B5)或左肺舌葉注入100 mL生理鹽水，回收至瓶中(標本回收率>35%)。收集支氣管BALF后立即采靜脈血5 mL。BALF用12目無菌紗布過濾后注入離心管中，以1 200 r/min、4 ℃下離心10 min，然后注入無菌透析袋10倍濃縮，浸入50％聚乙二醇溶液中10倍濃縮，24 h后加入生理鹽水(原BALF量的1/10)，取濃縮液-80 ℃冰箱保存備用。BALF用于細胞學檢查，檢測方法參照《中華醫學會呼吸學分會支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術規范(草案)》[6]。靜脈血離心，取血清冰凍備用。BALF中T淋巴細胞亞群檢測采用流式細胞法。
4.BALF和血清中的KL-6水平檢測：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)，用標準曲線計算樣本KL-6的濃度(U/mL)。
三 統計學處理
應用SPSS 17.0軟件進行數據處理。計數資料的組間比較采用χ2檢驗，計量資料組間比較采用單因素方差分析。相關性分析采用Pearson相關性分析(正態分布)或Spearman等級相關(非正態分布)。P<0.05為差異有統計學意義。
結果
一 一般臨床資料
IPF組患者的男/女、年齡、吸煙、杵狀指高于SAR組(P均<0.01)，出現Velcro啰音者也多于SAR組(P<0.05)。結果見表 1。
表1
兩組患者的一般情況及體征比較(二 肺功能
IPF組患者的FVC%pred低于SAR組(P<0.01)，DLCO%pred低于SAR組(P<0.01)。結果見表 2。
表2
兩組患者的肺功能指標比較(三 BALF中細胞學檢查
IPF組患者BALF中中性粒細胞百分比高于SAR組(P<0.05)，SAR組淋巴細胞百分比和CD4/CD8比值高于IPF組(P<0.05)。結果見表 3。
表3
BALF中細胞總數、分類計數、T細胞亞群比較(四 BALF和血清中KL-6濃度
IPF組患者BALF和血清中KL-6濃度均高于SAR組(P<0.05)。結果見表 4。
表4
BALF和血清中KL-6濃度比較(U/mL，五 IPF組血清KL-6濃度與肺功能相關性分析
IPF組患者血清KL-6濃度與FVC%pred和DLCO%pred均呈負相關，相關系數分別為-0.46和-0.58(P均<0.01)。結果見圖 1和圖 2。
圖1
血清KL-6濃度與FVC%pred的相關性
圖2
血清KL-6濃度與DLCO%pred的相關性
討論
KL-6是由MUC1基因編碼的屬cluster9的黏蛋白1類糖蛋白，主要由增殖、再生的或受損的Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌。血清KL-6水平可以作為肺泡上皮細胞破壞和再生的指標。臨床可用于某些呼吸系統疾病如肺泡蛋白沉著癥的早期診斷和判斷病情嚴重程度。KL-6還是一種細胞表面屏障，可能有防御功能，它的水平與肺泡上皮屏障損傷相關。國內外相關研究已證明KL-6在診斷間質性肺疾病中有一定的作用[3]。KL-6是一種黏蛋白而非表面活性物質，在間質性肺疾病中KL-6過度表達可能限制肺泡的通氣和換氣功能，影響肺泡復張，從而加重肺損傷，這種過度表達可能是導致間質性肺疾病加重的一種機制[7]。另外，KL-6是一種肺成纖維細胞潛在的促增殖和抗凋亡物質，影響作用類似于轉化生長因子、成纖維細胞生長因子及血小板源性生長因子，可能為纖維化增殖的啟動因素[4]。
因基底膜受損，Ⅱ型肺泡上皮細胞增生，與此同時KL-6表達增加，被釋放入肺泡襯褶中，引起損傷處肺泡襯褶和血管通透性增強，KL-6移行到血液中，使血液中KL-6水平升高。KL-6可以促進肺成纖維細胞的遷移、增生和活化并釋放趨化因子。盡管現在IPF發病機制尚未完全清楚，但研究表明與成纖維細胞的異常增殖活化、凋亡受阻，成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，上皮-間質轉變，細胞外基質產生增多、降解減少有關。KL-6可以促進成纖維細胞產生膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，產生α-平滑肌肌動蛋白，導致上皮-間質轉變，并且誘導產生更多的細胞外基質成分。另外，KL-6通過抑制成纖維細胞表達肝細胞生長因子，導致細胞外基質過度沉積、重塑，發生肺纖維化[8]。
關于KL-6，日本的相關研究較深入，用以鑒別彌漫性間質性肺疾病、健康人及其他呼吸系統疾病的患者，血清中KL-6的臨床參考值設定為500 U/mL[9]。基于此參考值，一項關于日本人群大樣本的研究，其中包括225例不同肺疾病的患者和200名健康人，發現KL-6對間質性肺疾病特異性較高，可有效鑒別間質性肺病與其他呼吸系統疾病；與非活動期相比，活動期的血液中KL-6濃度更高；隨著間質性肺疾病的癥狀改善或惡化，KL-6在血液中的濃度也隨之變動[10]。日本厚生省的《特發性間質性肺病的診斷和治療指南》已將KL-6、表面活性蛋白D、表面活性蛋白A、乳酸脫氫酶中1個以上的指標上升作為診斷標準之一[11]。目前我國尚缺乏大樣本的研究，今后有必要進行大樣本研究以明確KL-6在中國人IPF的病情監測以及判定疾病活動性方面的作用。在BALF中，IPF以中性粒細胞為主，而結節病以淋巴細胞為主。本研究結果顯示，IPF組中性粒細胞百分比為(8.91±6.79)%，SAR組淋巴細胞百分比為(23.30±12.68)%，均高于正常值。另外，IPF組BALF和血清中KL-6水平升高明顯。IPF組血清KL-6濃度與肺容積和肺彌散功能的下降有顯著相關性，提示其在病情監測及判定疾病活動性方面的作用。KL-6有可能作為一項提示IPF臨床診斷的指標。
本研究尚有許多不足之處，由于收集標本時的臨床實際情況，對照組采用尚未發生肺纖維化的SAR Ⅰ期患者，而非正常健康人。并且本研究時間較短，病例數相對偏少，尚未對患者進行隨訪以及動態觀察治療后KL-6水平。關于KL-6在IPF中的作用機制有待于進一步研究。
特發性肺纖維化(IPF)是一種原因不明，主要發生于中老年人，局限于肺的慢性進行性致纖維化的間質性肺炎，是特發性間質性肺炎中最常見的類型，其確診后的中位生存期僅3~5年。IPF通常為隱襲性起病，主要表現為漸進性的呼吸困難伴干咳，肺功能檢查可見限制性通氣功能障礙和彌散功能障礙，約60%的患者死于肺部疾病惡化和呼吸衰竭[1-2]。IPF的發病機制至今尚未完全清楚，成纖維細胞異常增殖分化、凋亡受阻，成纖維細胞灶形成，以及細胞外基質產生增多、降解減少均可導致IPF發生。KL-6是Ⅱ型肺泡上皮細胞膜上的一種糖蛋白，可從Ⅱ型肺泡上皮細胞上脫落進入肺泡腔和血液[3]。研究表明，涎液化糖鏈蛋白6(KL-6)參與了肺纖維化過程[4]。本文旨在研究KL-6在IPF患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清中的表達水平，并與肺功能等指標進行相關性分析，探討它對IPF輔助診斷的臨床價值。
對象與方法
一 對象
選取2012年2月至2014年9月在中國醫科大學附屬第一醫院初診的IPF患者34例，結節病(SAR)Ⅰ期患者10例。IPF組診斷標準嚴格按照《特發性間質性肺纖維化循證診治指南》[5]，所有患者臨床上均有不同程度的進行性呼吸困難和干咳等癥狀，查體有Velcro啰音、杵狀指等，結合病史、肺功能、血氣分析、肺高分辨率CT(HRCT)等檢查，排除了結節病、過敏性肺泡炎、結締組織病等其他類型的彌漫性間質性肺疾病。SAR組主要為病理診斷，結合肺CT排除結核、淋巴瘤等其他類似肉芽腫性疾病，或經經驗性激素治療確診為Ⅰ期SAR患者。患者均簽署知情同意書。
二 方法
1.一般臨床資料：對符合入選標準的患者，記錄患者的性別、年齡、吸煙狀況等一般情況及體征相關信息。
2.肺功能檢測：使用德國耶格肺功能儀檢測，記錄第1秒用力呼氣容積(FEV1)占預計值百分比(FEV1%pred)、用力肺活量(FVC)占預計值百分比(FVC%pred)、一氧化碳彌散量(DLCO)占預計值百分比(DLCO%pred)。
3.纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗：右肺中葉(B4或B5)或左肺舌葉注入100 mL生理鹽水，回收至瓶中(標本回收率>35%)。收集支氣管BALF后立即采靜脈血5 mL。BALF用12目無菌紗布過濾后注入離心管中，以1 200 r/min、4 ℃下離心10 min，然后注入無菌透析袋10倍濃縮，浸入50％聚乙二醇溶液中10倍濃縮，24 h后加入生理鹽水(原BALF量的1/10)，取濃縮液-80 ℃冰箱保存備用。BALF用于細胞學檢查，檢測方法參照《中華醫學會呼吸學分會支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術規范(草案)》[6]。靜脈血離心，取血清冰凍備用。BALF中T淋巴細胞亞群檢測采用流式細胞法。
4.BALF和血清中的KL-6水平檢測：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)，用標準曲線計算樣本KL-6的濃度(U/mL)。
三 統計學處理
應用SPSS 17.0軟件進行數據處理。計數資料的組間比較采用χ2檢驗，計量資料組間比較采用單因素方差分析。相關性分析采用Pearson相關性分析(正態分布)或Spearman等級相關(非正態分布)。P<0.05為差異有統計學意義。
結果
一 一般臨床資料
IPF組患者的男/女、年齡、吸煙、杵狀指高于SAR組(P均<0.01)，出現Velcro啰音者也多于SAR組(P<0.05)。結果見表 1。
表1
兩組患者的一般情況及體征比較(二 肺功能
IPF組患者的FVC%pred低于SAR組(P<0.01)，DLCO%pred低于SAR組(P<0.01)。結果見表 2。
表2
兩組患者的肺功能指標比較(三 BALF中細胞學檢查
IPF組患者BALF中中性粒細胞百分比高于SAR組(P<0.05)，SAR組淋巴細胞百分比和CD4/CD8比值高于IPF組(P<0.05)。結果見表 3。
表3
BALF中細胞總數、分類計數、T細胞亞群比較(四 BALF和血清中KL-6濃度
IPF組患者BALF和血清中KL-6濃度均高于SAR組(P<0.05)。結果見表 4。
表4
BALF和血清中KL-6濃度比較(U/mL，五 IPF組血清KL-6濃度與肺功能相關性分析
IPF組患者血清KL-6濃度與FVC%pred和DLCO%pred均呈負相關，相關系數分別為-0.46和-0.58(P均<0.01)。結果見圖 1和圖 2。
圖1
血清KL-6濃度與FVC%pred的相關性
圖2
血清KL-6濃度與DLCO%pred的相關性
討論
KL-6是由MUC1基因編碼的屬cluster9的黏蛋白1類糖蛋白，主要由增殖、再生的或受損的Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌。血清KL-6水平可以作為肺泡上皮細胞破壞和再生的指標。臨床可用于某些呼吸系統疾病如肺泡蛋白沉著癥的早期診斷和判斷病情嚴重程度。KL-6還是一種細胞表面屏障，可能有防御功能，它的水平與肺泡上皮屏障損傷相關。國內外相關研究已證明KL-6在診斷間質性肺疾病中有一定的作用[3]。KL-6是一種黏蛋白而非表面活性物質，在間質性肺疾病中KL-6過度表達可能限制肺泡的通氣和換氣功能，影響肺泡復張，從而加重肺損傷，這種過度表達可能是導致間質性肺疾病加重的一種機制[7]。另外，KL-6是一種肺成纖維細胞潛在的促增殖和抗凋亡物質，影響作用類似于轉化生長因子、成纖維細胞生長因子及血小板源性生長因子，可能為纖維化增殖的啟動因素[4]。
因基底膜受損，Ⅱ型肺泡上皮細胞增生，與此同時KL-6表達增加，被釋放入肺泡襯褶中，引起損傷處肺泡襯褶和血管通透性增強，KL-6移行到血液中，使血液中KL-6水平升高。KL-6可以促進肺成纖維細胞的遷移、增生和活化并釋放趨化因子。盡管現在IPF發病機制尚未完全清楚，但研究表明與成纖維細胞的異常增殖活化、凋亡受阻，成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，上皮-間質轉變，細胞外基質產生增多、降解減少有關。KL-6可以促進成纖維細胞產生膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，產生α-平滑肌肌動蛋白，導致上皮-間質轉變，并且誘導產生更多的細胞外基質成分。另外，KL-6通過抑制成纖維細胞表達肝細胞生長因子，導致細胞外基質過度沉積、重塑，發生肺纖維化[8]。
關于KL-6，日本的相關研究較深入，用以鑒別彌漫性間質性肺疾病、健康人及其他呼吸系統疾病的患者，血清中KL-6的臨床參考值設定為500 U/mL[9]。基于此參考值，一項關于日本人群大樣本的研究，其中包括225例不同肺疾病的患者和200名健康人，發現KL-6對間質性肺疾病特異性較高，可有效鑒別間質性肺病與其他呼吸系統疾病；與非活動期相比，活動期的血液中KL-6濃度更高；隨著間質性肺疾病的癥狀改善或惡化，KL-6在血液中的濃度也隨之變動[10]。日本厚生省的《特發性間質性肺病的診斷和治療指南》已將KL-6、表面活性蛋白D、表面活性蛋白A、乳酸脫氫酶中1個以上的指標上升作為診斷標準之一[11]。目前我國尚缺乏大樣本的研究，今后有必要進行大樣本研究以明確KL-6在中國人IPF的病情監測以及判定疾病活動性方面的作用。在BALF中，IPF以中性粒細胞為主，而結節病以淋巴細胞為主。本研究結果顯示，IPF組中性粒細胞百分比為(8.91±6.79)%，SAR組淋巴細胞百分比為(23.30±12.68)%，均高于正常值。另外，IPF組BALF和血清中KL-6水平升高明顯。IPF組血清KL-6濃度與肺容積和肺彌散功能的下降有顯著相關性，提示其在病情監測及判定疾病活動性方面的作用。KL-6有可能作為一項提示IPF臨床診斷的指標。
本研究尚有許多不足之處，由于收集標本時的臨床實際情況，對照組采用尚未發生肺纖維化的SAR Ⅰ期患者，而非正常健康人。并且本研究時間較短，病例數相對偏少，尚未對患者進行隨訪以及動態觀察治療后KL-6水平。關于KL-6在IPF中的作用機制有待于進一步研究。
