引用本文： 張向峰, 劉芬, 朱光發, 王增智. 重組骨橋蛋白通過抑制核因子κB和基質金屬蛋白酶2和9減輕高氧急性肺損傷. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(4): 364-369. doi: 10.7507/1671-6205.2014089 復制
臨床上往往通過氧療來糾正呼吸衰竭，有時必須吸入較高濃度的氧才能維持適當的動脈血氧分壓和血氧飽和度，然而長時間吸入高濃度的氧(＞60%)可導致肺損傷。急性肺損傷的發生機制尚未完全闡明，除了氧自由基對肺泡膜的直接損傷外，更重要的是多種炎癥細胞(巨噬細胞、中性粒細胞、血小板)及其釋放的炎性介質和蛋白酶類如明膠酶介導的肺部炎癥反應，通過降解細胞基底膜的主要組分Ⅳ型膠原，從而在細胞外基底膜的轉復中發揮重要作用[1-2]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的組織抑制酶類--基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)是主要抑制該類酶的物質，它們之間的平衡對于維持細胞外基質的結構完整及功能正常具有重要作用[3]。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是普遍存在于真核細胞中的一個轉錄因子，在炎癥反應的細胞因子網絡調節中起關鍵作用。高氧作為一種刺激因素，可激活中性粒細胞或肺組織中的NF-κB，肺組織中NF-κB被激活的同時，伴有IL-1β、TNF-α及明膠酶等mRNA表達增高，且這些mRNA均受NF-κB控制。因此，如果能夠抑制NF-κB活化將有利于肺保護，減輕肺部炎性反應[4]。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種包含精氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸整合素結合區域的糖基化的磷蛋白。OPN能調節NF-κB的生物活性，許多研究證實OPN能抑制NF-κB的活性。最近多篇研究都報道了在蛛網膜下腔出血后出現的腦損傷中，外源性OPN可通過抑制NF-κB的活性，保持腦微血管基底膜的完整性，從而減輕腦損傷[5-6]。在高氧所致急性肺損傷中，OPN是否通過影響轉錄因子NF-κB信號通路進而抑制炎性細胞因子的產生減輕肺損傷目前尚不明確。本研究觀察了外源性重組骨橋蛋白(recombinant OPN，r-OPN)對于高氧所致急性肺損傷時NF-κB和MMP-2和MMP-9表達的影響及其對肺損傷的防治作用。
對象與方法
一 材料
實驗用清潔級雄性昆明小鼠96只，體重18~20 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，按隨機數字表法分為8小組，每小組12只。其中PBS處理組分為4小組，分別為對照組(N組)、高氧24 h組(O1組)、高氧48 h組(O3組)、高氧72 h組(O5組)；r-OPN處理組同樣分為4小組，分別為對照組(n組)、高氧24 h組(O2組)、高氧48 h組(O4組)、高氧72 h組(O6組)。OPN蛋白由Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)合成，然后溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成0.1 μg/μL的溶液。
二 方法
1．動物處理：實驗組動物被置于Plexiglas氧氣室，內置氧濃度儀持續監測室內氧濃度，保證氧濃度＞95%，于暴露時間終末時取出動物。對照組小鼠置于室內空氣中。1 μL r-OPN蛋白和對照的PBS經鼻腔滴入，24 h后暴露于高氧制備不同時段(24 h，48 h，72 h)制備急性肺損傷的動物模型。
2．肺損傷嚴重程度根據以下結果判定：(1)測定肺濕重/干重比值；(2)收集胸腔積液；(3)支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白濃度測定：小鼠處死后立即行氣管插管，用1 mL PBS行支氣管肺泡灌洗，共3次，離心灌洗液并測定上清液蛋白濃度。
3．肺組織切片的制備：通過氣管插管用10%中性甲醛以20 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)壓力灌注鼠肺，持續20 min后摘除置于10%中性甲醛固定12 h，常規脫水石蠟包埋，制成5 μm組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色部分切片。
4．逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定肺組織NF-κB、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達：取每只小鼠50 mg肺組織，Trizol(Gibco)提取總RNA，逆轉錄為相應的cDNA。NF-κB引物序列：上游引物5′-TGTCAGAGCCCTTGTAACTG-3′，下游引物5′-CTGTGGGTAGGATTTCTTGT-3′；產物為296 bp的cDNA片段；MMP-2引物序列：上游引物5′-CACCATCGCCCATCATCAAGT-3′，下游引物5′-TGGATTCGAGAAAAGCGCAGCGG-3′，產物為399 bp的cDNA片段；MMP-9引物序列：上游引物5′-GCTTTCGGCTGCAGCTCTGCTG-3′，下游引物5′-GAGGCCTTTGAAGGTTTGGAAT-3′，產物為305 bp的cDNA片段；TIMP-1引物序列：上游引物5′-GCTAAAAGGATTCAAGGCTGTGGG-3′，下游引物5′-AAAGCTCTTTGCTGAGCAGGGC-3′，產物為210 bp的cDNA片段。TIMP-2引物序列：上游引物5′-TGCGGGGTCTCGCTGGACGTT-3′，下游引物5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′，產物為150 bp的cDNA片段。β-actin引物序列：上游引物5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3′，下游引物5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′，產物為244 bp的cDNA片段。
PCR反應體系為25 μL，包括5 μL反轉錄產物，2.5 μL 10×PCR反應緩沖液(Mg2+終濃度為1.5 mmol/L)，0.5 U Tfl DNA聚合酶，1 mmol/L的引物。循環參數為：96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環，最后72 ℃ 10 min(NF-κB，MMP-2和MMP-9)；94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，32個循環，(TIMP-1和TIMP-2)。取10 μL PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像分析系統(Alpha Image)作密度掃描分析測定擴增條帶積分光密度值，用內參照β-actin修正比較各組表達水平的差異。
5．鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶法(SABC)檢測肺組織NF-κB蛋白的表達：鼠抗人NF-κB多克隆抗體工作液濃度為1∶100，購自美國Santa Cruz公司。滴加一抗后4 ℃過夜，同時用PBS代替一抗而其他條件均相同做陰性對照，聯苯二胺(DAB)顯色，蘇木素復染、封片。結果按Barbera等[7]確定的標準判定：陽性染色為胞漿或胞核中的棕褐色顆粒并按顏色強度分為4級：無棕色染色為陰性定為0分，淺棕色為弱陽性定為1分，棕黃色為較強陽性定為2分，深棕色為強陽性定為3分；每張片子共計數20個支氣管分別給予評分，然后得出該樣本的總評分。
三 統計學處理
采用SPSS 11.5軟件包進行統計學處理，數據以
結果
一 肺損傷嚴重程度評價結果
在暴露于高氧環境48 h后，小鼠均發生嚴重的肺損傷。暴露于高氧72 h后PBS處理組小鼠肺濕重/干重比值較r-OPN處理組小鼠肺顯著增加(q=2.83，P＜0.05)；各高氧組小鼠胸水較對照組均明顯增加，其中暴露于高氧72 h 后PBS處理組胸水增加較多，與相對應r-OPN處理組比較，差異有統計學意義(q=3.45，P＜0.01)。在暴露于高濃度氧48 h和72 h后，PBS處理組和r-OPN處理組BALF蛋白濃度均較各自對照組明顯增加(P＜0.1)；暴露于高氧48 h和72 h時，r-OPN處理組BALF蛋白濃度均明顯低于PBS處理組(P＜0.01)。結果見表 1。光鏡下觀察HE染色肺組織切片，發現暴露于高氧72 h后PBS處理組小鼠的肺組織呈現出較r-OPN處理組小鼠肺組織更為嚴重的結構毀損、肺泡塌陷及肺間質水腫(圖 1)。
表1
各組小鼠急性肺損傷各指標的比較(n=12，
圖1
高氧72 h小鼠肺組織病理學變化(HE ×100) a．r-OPN處理組；b．PBS處理組
二 小鼠肺組織中NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA的表達
RT-PCR結果見圖 2。PBS處理組小鼠在暴露于高氧48 h和72 h后，NF-κB mRNA表達較對照組顯著增加，與r-OPN處理組比較表達亦明顯增高(q值分別為2.96和2.87，均P＜0.05)。PBS處理組和r-OPN處理組小鼠肺組織MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達在暴露于高氧后較各自對照組均顯著增加，但PBS處理組和r-OPN處理組各時間點差異均無統計學意義；r-OPN處理組小鼠肺組織TIMP-1 mRNA的表達在暴露于高氧72 h后較相對應的PBS處理組小鼠明顯增加(q=3.05，P＜0.05)。r-OPN處理組小鼠肺組織TIMP-2 mRNA的表達在暴露于高氧48 h和72 h后較相對應的PBS處理組小鼠明顯增加(q值分別為2.87和3.16，均P＜0.05)。結果見表 2。
圖2
NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA在肺組織中的表達
表2
各組小鼠肺組織NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA表達的比較(n=12,三 小鼠肺組織中NF-κB蛋白的表達
免疫組化結果顯示，對照組中僅有個別氣道上皮細胞于胞漿中出現NF-κB蛋白弱陽性染色，當暴露于高氧環境下染色明顯增強，NF-κB蛋白表達于氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞和巨噬細胞的胞漿及細胞核中，PBS處理組胞核明顯陽性染色，胞漿亦可見陽性染色；r-OPN組肺組織可見胞漿胞核染色較同時段PBS組明顯降低。PBS處理組小鼠氣道上皮NF-κB蛋白表達量在暴露于高氧72 h后明顯高于r-OPN處理組小鼠 (53.26±4.70比32.52±7.28，q=3.21，P＜0.05)。結果見圖 3和圖 4。
圖3
高氧72 h小鼠肺組織中NF-κB蛋白的表達(SABC ×200) a．PBS處理組；b．r-OPN處理組
圖4
各組小鼠肺組織NF-κB蛋白表達的比較
與r-OPN處理組比較，*
討論
急性肺損傷(ALI)往往由重癥肺炎、嚴重的膿毒癥、嚴重的非胸部創傷、胃內容物誤吸及其他情況所引起，起病急，發病兇險，可迅速導致急性呼吸衰竭，嚴重時可引起急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)和/或多器官功能障礙綜合征。近年來，對ALI/ARDS認識逐步發展致對炎癥發生、調控的認識，大量研究證實以多形核中性粒細胞為主的炎性細胞與多種細胞因子在其發病過程中起著重要作用。除中性粒細胞外，巨噬細胞及血管內皮細胞可分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和蛋白酶類等炎性介質，對啟動早期炎癥反應與維持炎癥反應起重要作用[8-9]。
基質金屬蛋白酶2和9(MMP-2和MMP-9)是在炎癥反應、細胞外基質重建方面都起到重要作用的一類蛋白酶。ALI過程中，巨噬細胞和中性粒細胞在各種細胞因子、炎癥因子等作用下激活并釋放MMP-2和MMP-9，表達增多的MMP-2和MMP-9作用于肺泡-毛細胞血管基底膜，降解基底膜，水解細胞外基質等，破壞肺內呼吸屏障，從而直接影響肺的氣體交換，造成低氧血癥，肺功能下降，引起嚴重的肺泡-毛細血管彌散障礙，導致頑固性低氧血癥[10]。TIMP-1、TIMP-2分別與MMP-9、MMP-2具有高度親和性，不但可以抑制MMP-2、MMP-9的活化，還可以與活性化的MMP-2、MMP-9相結合導致其失去降解功能。在ALI時，TIMP-1、TIMP-2的表達也相應增加，生理條件下維持細胞外基質結構完整和細胞功能正常的動態平衡作用被破壞，間接參與了ALI的發生和發展[11]。
NF-κB信號通路激活在高氧ALI中發揮重要作用。靜息狀態下，NF-κB與其抑制蛋白(inhibitor κB，IκB)相結合，以非活化形式存在于細胞質內。當細胞受到多種細胞內/外信號刺激時，IκB特異絲氨酸殘基被IκB激酶(IKK)磷酸化，引起IκB分子的多泛素化，進而被蛋白酶體降解，使NF-κB從與IκB復合物中解離出來，NF-κB迅速移位到胞核，與基因上的κB位點特異性結合，促進有關基因的轉錄，促使機體釋放過多的炎癥介質和細胞因子，如炎前細胞因子(TNF-α和IL-lβ等)，造成了由炎癥細胞和介質構成的瀑布式級聯炎癥反應。調節NF-κB的活性可以減少粒細胞浸潤與ALI炎性因子產生。因此，如果能夠抑制NF-κB活化將有利于肺保護，減輕肺部炎性反應[12]。活性氧能激活IκB激酶，使NF-κB迅速移位到胞核，與MMP-2、MMP-9基因上的κB位點特異性結合，促進MMP-2和MMP-9基因的轉錄和酶的釋放。多項研究證實激活NF-κB可促進MMP-2和MMP-9的分泌和活化，反之阻止NF-κB的激活則能抑制MMP-2和MMP-9的分泌和激活[13-15]。
OPN能調節NF-κB的生物活性。許多研究證實OPN能抑制NF-κB的活性，能預防經IL-1β和內毒素處理的非腫瘤細胞NF-κB的激活和一氧化氮的合成[16]。吸入突變的OPN能通過抑制NF-κB活性，從而抑制K-ras突變小鼠肺癌的發生[17]；對腎透明細胞癌的研究發現OPN和NF-κB的表達呈負相關[18]。在高氧所致ALI中，OPN是否通過影響轉錄因子NF-κB信號通路進而抑制炎性細胞因子的產生并減輕肺損傷目前尚不明確，既然多項研究證實OPN在其他組織中能抑制NF-κB的激活和表達，而高氧通過激活NF-κB通路加重肺損傷，OPN能減輕高氧所致ALI，那么我們假設在高氧所致ALI的上述病理生理過程中，OPN是否通過抑制NF-κB信號通路的激活進而抑制炎前細胞因子的產生來減輕高氧所致ALI？這是本研究擬探討的主要問題。
本研究證實持續吸入PBS處理組小鼠暴露于高氧可導致明顯增加的肺濕重/干重比值，出現較多胸腔積液和較高的BALF蛋白濃度為特征的肺損傷。組織學研究亦發現肺組織呈現嚴重的結構毀損、肺泡塌陷及間質水腫。肺損傷在暴露于高氧24 h后開始出現，并隨暴露時間的延長而逐漸加重。而r-OPN處理組以上指標明顯降低，光鏡下肺組織結構破壞及肺泡滲出較PBS處理組亦明顯減輕。在高氧引起的ALI中，肺組織NF-κB、MMP-2、MMP-9及其抑制劑表達均明顯增加。PBS處理組肺組織NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA表達在暴露于高氧后均明顯增加，r-OPN處理組小鼠肺組織TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達在暴露于高氧72 h后較相對應的PBS處理組小鼠明顯增加，而MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達在暴露于高氧72 h后與PBS組比較無明顯差異。提示MMPs和TIMPs二者的比例失衡在氧化劑所致的肺損傷中可能是導致肺組織結構毀損、上皮通透性增加及肺間質水腫的重要致病因素，r-OPN處理后肺損傷較輕，可能與維持MMPs和TIMPs二者的比例平衡相關。免疫組化研究結果發現PBS處理后高氧組肺組織氣道上皮細胞NF-κB表達較同時段r-OPN組明顯增強，它的表達升高在氧化劑所致的肺損傷中可能是導致肺組織結構毀損、上皮通透性增加及肺間質水腫的重要致病因素，同時炎性細胞尤其肺泡巨噬細胞和中性粒細胞亦通過表達MMPs和其他介質，從而在肺損傷和修復過程中發揮重要作用。
綜上所述，長時間吸入高氧能引起ALI伴NF-κB、MMP-2和MMP-9的表達增高，MMPs表達增高及與其抑制劑平衡失調通過降解細胞外基質在高氧所致的ALI過程中發揮重要作用。r-OPN吸入能抑制NF-κB、MMP-2和MMP-9的表達，促進MMP-2、MMP-9及其抑制劑間的平衡，從而減輕高氧所致ALI。我們以前使用OPN基因敲除的高氧所致ALI小鼠動物模型研究，發現OPN蛋白的表達能減輕高氧所致的ALI[19-20]，分析機理可能是OPN通過促進TIMPs的表達來抑制MMPs的釋放和激活，從而減輕高氧所致的ALI。本實驗的結果從另一方面證實了OPN對高氧ALI具有保護作用。
臨床上往往通過氧療來糾正呼吸衰竭，有時必須吸入較高濃度的氧才能維持適當的動脈血氧分壓和血氧飽和度，然而長時間吸入高濃度的氧(＞60%)可導致肺損傷。急性肺損傷的發生機制尚未完全闡明，除了氧自由基對肺泡膜的直接損傷外，更重要的是多種炎癥細胞(巨噬細胞、中性粒細胞、血小板)及其釋放的炎性介質和蛋白酶類如明膠酶介導的肺部炎癥反應，通過降解細胞基底膜的主要組分Ⅳ型膠原，從而在細胞外基底膜的轉復中發揮重要作用[1-2]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的組織抑制酶類--基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)是主要抑制該類酶的物質，它們之間的平衡對于維持細胞外基質的結構完整及功能正常具有重要作用[3]。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是普遍存在于真核細胞中的一個轉錄因子，在炎癥反應的細胞因子網絡調節中起關鍵作用。高氧作為一種刺激因素，可激活中性粒細胞或肺組織中的NF-κB，肺組織中NF-κB被激活的同時，伴有IL-1β、TNF-α及明膠酶等mRNA表達增高，且這些mRNA均受NF-κB控制。因此，如果能夠抑制NF-κB活化將有利于肺保護，減輕肺部炎性反應[4]。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種包含精氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸整合素結合區域的糖基化的磷蛋白。OPN能調節NF-κB的生物活性，許多研究證實OPN能抑制NF-κB的活性。最近多篇研究都報道了在蛛網膜下腔出血后出現的腦損傷中，外源性OPN可通過抑制NF-κB的活性，保持腦微血管基底膜的完整性，從而減輕腦損傷[5-6]。在高氧所致急性肺損傷中，OPN是否通過影響轉錄因子NF-κB信號通路進而抑制炎性細胞因子的產生減輕肺損傷目前尚不明確。本研究觀察了外源性重組骨橋蛋白(recombinant OPN，r-OPN)對于高氧所致急性肺損傷時NF-κB和MMP-2和MMP-9表達的影響及其對肺損傷的防治作用。
對象與方法
一 材料
實驗用清潔級雄性昆明小鼠96只，體重18~20 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，按隨機數字表法分為8小組，每小組12只。其中PBS處理組分為4小組，分別為對照組(N組)、高氧24 h組(O1組)、高氧48 h組(O3組)、高氧72 h組(O5組)；r-OPN處理組同樣分為4小組，分別為對照組(n組)、高氧24 h組(O2組)、高氧48 h組(O4組)、高氧72 h組(O6組)。OPN蛋白由Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)合成，然后溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成0.1 μg/μL的溶液。
二 方法
1．動物處理：實驗組動物被置于Plexiglas氧氣室，內置氧濃度儀持續監測室內氧濃度，保證氧濃度＞95%，于暴露時間終末時取出動物。對照組小鼠置于室內空氣中。1 μL r-OPN蛋白和對照的PBS經鼻腔滴入，24 h后暴露于高氧制備不同時段(24 h，48 h，72 h)制備急性肺損傷的動物模型。
2．肺損傷嚴重程度根據以下結果判定：(1)測定肺濕重/干重比值；(2)收集胸腔積液；(3)支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白濃度測定：小鼠處死后立即行氣管插管，用1 mL PBS行支氣管肺泡灌洗，共3次，離心灌洗液并測定上清液蛋白濃度。
3．肺組織切片的制備：通過氣管插管用10%中性甲醛以20 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)壓力灌注鼠肺，持續20 min后摘除置于10%中性甲醛固定12 h，常規脫水石蠟包埋，制成5 μm組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色部分切片。
4．逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定肺組織NF-κB、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達：取每只小鼠50 mg肺組織，Trizol(Gibco)提取總RNA，逆轉錄為相應的cDNA。NF-κB引物序列：上游引物5′-TGTCAGAGCCCTTGTAACTG-3′，下游引物5′-CTGTGGGTAGGATTTCTTGT-3′；產物為296 bp的cDNA片段；MMP-2引物序列：上游引物5′-CACCATCGCCCATCATCAAGT-3′，下游引物5′-TGGATTCGAGAAAAGCGCAGCGG-3′，產物為399 bp的cDNA片段；MMP-9引物序列：上游引物5′-GCTTTCGGCTGCAGCTCTGCTG-3′，下游引物5′-GAGGCCTTTGAAGGTTTGGAAT-3′，產物為305 bp的cDNA片段；TIMP-1引物序列：上游引物5′-GCTAAAAGGATTCAAGGCTGTGGG-3′，下游引物5′-AAAGCTCTTTGCTGAGCAGGGC-3′，產物為210 bp的cDNA片段。TIMP-2引物序列：上游引物5′-TGCGGGGTCTCGCTGGACGTT-3′，下游引物5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′，產物為150 bp的cDNA片段。β-actin引物序列：上游引物5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3′，下游引物5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′，產物為244 bp的cDNA片段。
PCR反應體系為25 μL，包括5 μL反轉錄產物，2.5 μL 10×PCR反應緩沖液(Mg2+終濃度為1.5 mmol/L)，0.5 U Tfl DNA聚合酶，1 mmol/L的引物。循環參數為：96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環，最后72 ℃ 10 min(NF-κB，MMP-2和MMP-9)；94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，32個循環，(TIMP-1和TIMP-2)。取10 μL PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像分析系統(Alpha Image)作密度掃描分析測定擴增條帶積分光密度值，用內參照β-actin修正比較各組表達水平的差異。
5．鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶法(SABC)檢測肺組織NF-κB蛋白的表達：鼠抗人NF-κB多克隆抗體工作液濃度為1∶100，購自美國Santa Cruz公司。滴加一抗后4 ℃過夜，同時用PBS代替一抗而其他條件均相同做陰性對照，聯苯二胺(DAB)顯色，蘇木素復染、封片。結果按Barbera等[7]確定的標準判定：陽性染色為胞漿或胞核中的棕褐色顆粒并按顏色強度分為4級：無棕色染色為陰性定為0分，淺棕色為弱陽性定為1分，棕黃色為較強陽性定為2分，深棕色為強陽性定為3分；每張片子共計數20個支氣管分別給予評分，然后得出該樣本的總評分。
三 統計學處理
采用SPSS 11.5軟件包進行統計學處理，數據以
結果
一 肺損傷嚴重程度評價結果
在暴露于高氧環境48 h后，小鼠均發生嚴重的肺損傷。暴露于高氧72 h后PBS處理組小鼠肺濕重/干重比值較r-OPN處理組小鼠肺顯著增加(q=2.83，P＜0.05)；各高氧組小鼠胸水較對照組均明顯增加，其中暴露于高氧72 h 后PBS處理組胸水增加較多，與相對應r-OPN處理組比較，差異有統計學意義(q=3.45，P＜0.01)。在暴露于高濃度氧48 h和72 h后，PBS處理組和r-OPN處理組BALF蛋白濃度均較各自對照組明顯增加(P＜0.1)；暴露于高氧48 h和72 h時，r-OPN處理組BALF蛋白濃度均明顯低于PBS處理組(P＜0.01)。結果見表 1。光鏡下觀察HE染色肺組織切片，發現暴露于高氧72 h后PBS處理組小鼠的肺組織呈現出較r-OPN處理組小鼠肺組織更為嚴重的結構毀損、肺泡塌陷及肺間質水腫(圖 1)。
表1
各組小鼠急性肺損傷各指標的比較(n=12，
圖1
高氧72 h小鼠肺組織病理學變化(HE ×100) a．r-OPN處理組；b．PBS處理組
二 小鼠肺組織中NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA的表達
RT-PCR結果見圖 2。PBS處理組小鼠在暴露于高氧48 h和72 h后，NF-κB mRNA表達較對照組顯著增加，與r-OPN處理組比較表達亦明顯增高(q值分別為2.96和2.87，均P＜0.05)。PBS處理組和r-OPN處理組小鼠肺組織MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達在暴露于高氧后較各自對照組均顯著增加，但PBS處理組和r-OPN處理組各時間點差異均無統計學意義；r-OPN處理組小鼠肺組織TIMP-1 mRNA的表達在暴露于高氧72 h后較相對應的PBS處理組小鼠明顯增加(q=3.05，P＜0.05)。r-OPN處理組小鼠肺組織TIMP-2 mRNA的表達在暴露于高氧48 h和72 h后較相對應的PBS處理組小鼠明顯增加(q值分別為2.87和3.16，均P＜0.05)。結果見表 2。
圖2
NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA在肺組織中的表達
表2
各組小鼠肺組織NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA表達的比較(n=12,三 小鼠肺組織中NF-κB蛋白的表達
免疫組化結果顯示，對照組中僅有個別氣道上皮細胞于胞漿中出現NF-κB蛋白弱陽性染色，當暴露于高氧環境下染色明顯增強，NF-κB蛋白表達于氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞和巨噬細胞的胞漿及細胞核中，PBS處理組胞核明顯陽性染色，胞漿亦可見陽性染色；r-OPN組肺組織可見胞漿胞核染色較同時段PBS組明顯降低。PBS處理組小鼠氣道上皮NF-κB蛋白表達量在暴露于高氧72 h后明顯高于r-OPN處理組小鼠 (53.26±4.70比32.52±7.28，q=3.21，P＜0.05)。結果見圖 3和圖 4。
圖3
高氧72 h小鼠肺組織中NF-κB蛋白的表達(SABC ×200) a．PBS處理組；b．r-OPN處理組
圖4
各組小鼠肺組織NF-κB蛋白表達的比較
與r-OPN處理組比較，*
討論
急性肺損傷(ALI)往往由重癥肺炎、嚴重的膿毒癥、嚴重的非胸部創傷、胃內容物誤吸及其他情況所引起，起病急，發病兇險，可迅速導致急性呼吸衰竭，嚴重時可引起急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)和/或多器官功能障礙綜合征。近年來，對ALI/ARDS認識逐步發展致對炎癥發生、調控的認識，大量研究證實以多形核中性粒細胞為主的炎性細胞與多種細胞因子在其發病過程中起著重要作用。除中性粒細胞外，巨噬細胞及血管內皮細胞可分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和蛋白酶類等炎性介質，對啟動早期炎癥反應與維持炎癥反應起重要作用[8-9]。
基質金屬蛋白酶2和9(MMP-2和MMP-9)是在炎癥反應、細胞外基質重建方面都起到重要作用的一類蛋白酶。ALI過程中，巨噬細胞和中性粒細胞在各種細胞因子、炎癥因子等作用下激活并釋放MMP-2和MMP-9，表達增多的MMP-2和MMP-9作用于肺泡-毛細胞血管基底膜，降解基底膜，水解細胞外基質等，破壞肺內呼吸屏障，從而直接影響肺的氣體交換，造成低氧血癥，肺功能下降，引起嚴重的肺泡-毛細血管彌散障礙，導致頑固性低氧血癥[10]。TIMP-1、TIMP-2分別與MMP-9、MMP-2具有高度親和性，不但可以抑制MMP-2、MMP-9的活化，還可以與活性化的MMP-2、MMP-9相結合導致其失去降解功能。在ALI時，TIMP-1、TIMP-2的表達也相應增加，生理條件下維持細胞外基質結構完整和細胞功能正常的動態平衡作用被破壞，間接參與了ALI的發生和發展[11]。
NF-κB信號通路激活在高氧ALI中發揮重要作用。靜息狀態下，NF-κB與其抑制蛋白(inhibitor κB，IκB)相結合，以非活化形式存在于細胞質內。當細胞受到多種細胞內/外信號刺激時，IκB特異絲氨酸殘基被IκB激酶(IKK)磷酸化，引起IκB分子的多泛素化，進而被蛋白酶體降解，使NF-κB從與IκB復合物中解離出來，NF-κB迅速移位到胞核，與基因上的κB位點特異性結合，促進有關基因的轉錄，促使機體釋放過多的炎癥介質和細胞因子，如炎前細胞因子(TNF-α和IL-lβ等)，造成了由炎癥細胞和介質構成的瀑布式級聯炎癥反應。調節NF-κB的活性可以減少粒細胞浸潤與ALI炎性因子產生。因此，如果能夠抑制NF-κB活化將有利于肺保護，減輕肺部炎性反應[12]。活性氧能激活IκB激酶，使NF-κB迅速移位到胞核，與MMP-2、MMP-9基因上的κB位點特異性結合，促進MMP-2和MMP-9基因的轉錄和酶的釋放。多項研究證實激活NF-κB可促進MMP-2和MMP-9的分泌和活化，反之阻止NF-κB的激活則能抑制MMP-2和MMP-9的分泌和激活[13-15]。
OPN能調節NF-κB的生物活性。許多研究證實OPN能抑制NF-κB的活性，能預防經IL-1β和內毒素處理的非腫瘤細胞NF-κB的激活和一氧化氮的合成[16]。吸入突變的OPN能通過抑制NF-κB活性，從而抑制K-ras突變小鼠肺癌的發生[17]；對腎透明細胞癌的研究發現OPN和NF-κB的表達呈負相關[18]。在高氧所致ALI中，OPN是否通過影響轉錄因子NF-κB信號通路進而抑制炎性細胞因子的產生并減輕肺損傷目前尚不明確，既然多項研究證實OPN在其他組織中能抑制NF-κB的激活和表達，而高氧通過激活NF-κB通路加重肺損傷，OPN能減輕高氧所致ALI，那么我們假設在高氧所致ALI的上述病理生理過程中，OPN是否通過抑制NF-κB信號通路的激活進而抑制炎前細胞因子的產生來減輕高氧所致ALI？這是本研究擬探討的主要問題。
本研究證實持續吸入PBS處理組小鼠暴露于高氧可導致明顯增加的肺濕重/干重比值，出現較多胸腔積液和較高的BALF蛋白濃度為特征的肺損傷。組織學研究亦發現肺組織呈現嚴重的結構毀損、肺泡塌陷及間質水腫。肺損傷在暴露于高氧24 h后開始出現，并隨暴露時間的延長而逐漸加重。而r-OPN處理組以上指標明顯降低，光鏡下肺組織結構破壞及肺泡滲出較PBS處理組亦明顯減輕。在高氧引起的ALI中，肺組織NF-κB、MMP-2、MMP-9及其抑制劑表達均明顯增加。PBS處理組肺組織NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA表達在暴露于高氧后均明顯增加，r-OPN處理組小鼠肺組織TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達在暴露于高氧72 h后較相對應的PBS處理組小鼠明顯增加，而MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達在暴露于高氧72 h后與PBS組比較無明顯差異。提示MMPs和TIMPs二者的比例失衡在氧化劑所致的肺損傷中可能是導致肺組織結構毀損、上皮通透性增加及肺間質水腫的重要致病因素，r-OPN處理后肺損傷較輕，可能與維持MMPs和TIMPs二者的比例平衡相關。免疫組化研究結果發現PBS處理后高氧組肺組織氣道上皮細胞NF-κB表達較同時段r-OPN組明顯增強，它的表達升高在氧化劑所致的肺損傷中可能是導致肺組織結構毀損、上皮通透性增加及肺間質水腫的重要致病因素，同時炎性細胞尤其肺泡巨噬細胞和中性粒細胞亦通過表達MMPs和其他介質，從而在肺損傷和修復過程中發揮重要作用。
綜上所述，長時間吸入高氧能引起ALI伴NF-κB、MMP-2和MMP-9的表達增高，MMPs表達增高及與其抑制劑平衡失調通過降解細胞外基質在高氧所致的ALI過程中發揮重要作用。r-OPN吸入能抑制NF-κB、MMP-2和MMP-9的表達，促進MMP-2、MMP-9及其抑制劑間的平衡，從而減輕高氧所致ALI。我們以前使用OPN基因敲除的高氧所致ALI小鼠動物模型研究，發現OPN蛋白的表達能減輕高氧所致的ALI[19-20]，分析機理可能是OPN通過促進TIMPs的表達來抑制MMPs的釋放和激活，從而減輕高氧所致的ALI。本實驗的結果從另一方面證實了OPN對高氧ALI具有保護作用。
