術后腹腔粘連是常見的腹部外科手術并發癥之一，在所有開腹手術中有90%～95%的患者會并發腹腔粘連的形成[1, 2]。由于粘連導致的異常腹腔內附著，可引起一系列與之相關的并發癥的發生，其中包括有慢性腹部疼痛、女性不孕、腸梗阻等[3]。目前對于術后腹腔粘連的治療方法十分有限，粘連一旦形成除外手術松解尚無其他有效的措施，因此對于術后腹腔粘連的預防顯得十分必要[4]。粘連形成的過程涉及到炎癥反應、纖維形成或沉積、腹膜間皮細胞修復等，然而目前臨床中主要應用到的預防術后腹腔粘連形成的藥物主要是通過使用物理屏障隔離的藥物，通過隔開可能粘連的受損腹膜創面達到預防粘連形成的效果，并未考慮到粘連形成過程中復雜的病理生理過程[5]。因此其療效有限，尋求更加有效的預防粘連形成的藥物十分必要。
根皮素是一種天然類黃酮類小分子化合物，廣泛存在于蘋果、梨等水果表皮內，是目前新發現的一類天然皮膚美白劑[6]。目前研究表明根皮素有著廣泛的生物學作用，可以抑制炎癥反應、抗菌、抗氧化、抑制癌癥、抑制纖維形成、抑制免疫反應等[7, 8]。本研究通過體內動物實驗證實根皮素預防術后腹腔粘連形成的作用及其可能的機制，這為根皮素在術后腹腔粘連防治中的應用提供了理論依據，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及造模
本研究所有動物均購買并飼養于西安交通大學醫學部動物實驗中心并于西安交通大學醫學部動物實驗房進行實驗。40只雄性SD大鼠，普通級、6周齡、體質量150 g。將40只大鼠從1～40編號，在12 h光照12 h黑暗環境下適應1周后，在Excel軟件中使用完全隨機分組法將40只大鼠分為5組，每組8只。其中假手術組（Sham組）只行開關腹手術，其余組別均行盲腸搔刮摩擦法造模。造模方法如下：術前1 d剃去腹部毛發，術前12 h禁食；采用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后常規消毒鋪巾，取下腹正中切口長3 cm開腹；提出盲腸，使用干紗布在盲腸及其對側腹壁各摩擦30次，直至點狀出血，摩擦完畢后將磨損的盲腸與腹壁相對放置；分兩層關腹，術后第1天只進食糖鹽水，術后第2天恢復正常飲食。術后每天消毒傷口1次，術后第7天全身麻醉后以脊椎脫臼法處死大鼠。
1.2 實驗分組及處理
假手術組開腹后直接關腹，對照組及根皮素組（PHL組）大鼠造模后關腹，透明質酸鈉組（HA組）及透明質酸鈉聯用根皮素組（PHL+HA組）大鼠采用2 mL透明質酸鈉凝膠涂抹受損腹壁及盲腸后關腹。術后使用根皮素治療的組別（包括PHL組和PHL+HA組）每日予以2 mL由0.5%羧甲基纖維素鈉溶解的40 mg/kg根皮素灌胃治療，其余組別均予以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液2 mL灌胃。術后第7天采用倒“U”型切口開腹，由2位對研究設計不知情的獨立研究者采用Nair’s評分評估粘連的嚴重程度，具體評分細則詳見文獻[9]。評估粘連完畢后收集粘連組織或者正常腹膜組織（假手術組收集盲腸及其對面的腹膜組織），將收集的標本分為2份，一份凍存于–80 ℃備用，用于檢測轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平；一份使用10%甲醛水溶液固定后行石蠟包埋，用于免疫組織化學染色、HE染色和天狼星紅染色。
1.3 免疫組織化學染色
將各組粘連組織或正常腹膜組織石蠟包埋的組織制備成4 μm厚的石蠟切片，脫蠟后采用免疫組織化學試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，Cat:SP0041）進行免疫組織化學染色，其中Nrf2抗體（Proteintech，Cat:16396-1-AP）稀釋比例為1∶50，余操作按說明書進行。每只大鼠隨機選取3張切片進行染色，每個切片至少選取3～5個高倍鏡視野進行評估，取該大鼠的所有高倍鏡視野的均值進行下一步統計分析。完成免疫組織化學染色后由2位對研究并不知情的獨立研究者對染色情況進行評分，其中在粘連組織中Nrf2無表達評0分，輕度染色1分，中等程度染色評2分，強染色評3分，染色程度特別強、呈褐色評4分。
1.4 HE染色
隨機選取8張上述制備好的病理切片，常規脫蠟，將切片放入蘇木精水溶液中染色10 min，置入酸水及氨水中各數10 s，流水沖洗1 h后入70%和90%乙醇中脫水各10 min。采用乙醇伊紅染色液染色3 min，封片固定。對于炎癥評分情況由2位獨立研究者進行，其中每張病理切片隨機選取5個高倍鏡視野，計算其均值進行評分。粘連組織中無炎癥細胞浸潤評0分，有少量巨噬細胞、淋巴細胞或漿細胞浸潤評1分，有中等程度的巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞或漿細胞浸潤評2分，局部組織有大量炎癥細胞浸潤，形成微小膿腫或大量血管新生評3分。
1.5 天狼星紅染色
每個組織隨機選取5個以上病理切片進行天狼星紅苦味酸染色。使用0.1%天狼星紅苦味酸進行染色，然后用蘇木精復染（北京索萊寶科技有限公司，Cat:G1470）。操作按說明書進行。每張病理切片隨機選擇5個高倍視野進行膠原組織厚度測量并計算其均值。
1.6 MDA和SOD水平測定
5組大鼠粘連組織或正常腹膜組織中的MDA及SOD水平檢測均采用試劑盒（MDA，北京索萊寶科技有限公司，BC0025；SOD，南京建成生物研究所，Cat:A001-1），實驗操作方法按照說明書進行。
1.7 TGF-β1表達測定
粘連或正常腹膜組織中的TGF-β1表達水平采用大鼠TGF-β1 ELISA定量檢測試劑盒（R&D）進行，實驗方法按說明書進行。
1.8 統計學方法
本研究采用SPSS 18.0軟件行統計學分析，其中符合正態分布的計量資料使用方差分析；非正態分布或方差不齊的計量資料使用Kruskal-Wallis H檢驗。計數資料比較使用列聯表χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
本研究中40只大鼠均順利完成實驗，手術后7 d內無大鼠發生死亡或者術后并發癥出現。實驗結果見圖1。
圖1
示5組大鼠的粘連情況及Nair’s評分
a：5組大鼠最具代表性的粘連圖片，黑箭所指為粘連組織；b：5組大鼠腹膜/粘連組織的HE染色結果（ ×100），黑箭所指為正常腹膜或粘連組織；c：5組大鼠腹膜/粘連組織中的纖維沉積情況（天狼星紅染色 ×100），黑箭所指為正常腹膜或粘連組織；d：5組大鼠腹膜/粘連組織的Nrf2表達情況（免疫組織化學染色 ×100），黑箭所指為正常腹膜或粘連組織；e：5組大鼠的Nair’s評分；f：5組大鼠腹膜/粘連組織的炎癥評分情況；g：5組大鼠腹膜/粘連組織中TGF-β1的表達情況；h：5組大鼠腹膜/粘連組織中的膠原厚度，黑箭指示；i：5組大鼠腹膜/粘連組織中的MDA水平；j：5組大鼠腹膜/粘連組織中的SOD活性；k：5組大鼠腹膜/粘連組織中Nrf2表達水平的免疫組織化學評分
2.1 根皮素聯合透明質酸鈉治療抑制術后腹腔粘連形成
5組大鼠粘連情況及Nair’s評分分別見圖1a和圖1e。在假手術組僅有1只大鼠發生切口粘連；對照組所有大鼠均發生粘連，為片狀致密粘連；HA組及PHL組大鼠均有粘連形成，但粘連情況稍有改善，粘連組織稀松；PHL+HA組有2只大鼠未發生粘連，其余大鼠的粘連情況明顯減輕，粘連組織稀松。與假手術組比較，對照組、HA組和PHL組的Nair’s評分較高（P＜0.05），而PHL+HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL+HA組的Nair’s評分降低（P＜0.05），但HA組和PHL組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2 根皮素聯合透明質酸鈉抑制粘連組織中的炎癥反應水平
炎癥反應是粘連形成的始動因素，因此本研究進一步檢測了粘連組織中的炎癥反應情況（見圖1b）。在炎癥評分方面，與假手術組比較，對照組和HA組的炎癥評分較高（P＜0.05），而PHL組和PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL組及PHL+HA組的炎癥評分降低（P＜0.05），但HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05），見圖1f。
在TGF-β1的表達方面，與假手術組比較，對照組和HA組的TGF-β1表達水平較高（P＜0.05），而PHL組和PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL組及PHL+HA組的TGF-β1表達水平降低（P＜0.05），但HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05），見圖1g。
2.3 根皮素聯合透明質酸鈉抑制粘連組織中的纖維沉積
粘連形成的本質即為異常的纖維條帶，故而本研究進一步檢測了粘連組織中的膠原沉積情況，結果如圖1c和1h所示。通過天狼星紅染色，本研究發現，與假手術組比較，對照組、HA組、PHL組和PHL+HA組膠原組織厚度均升高（P＜0.05）；與對照組比較，PHL+HA組的膠原組織厚度降低（P＜0.05），但HA組和PHL組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的膠原組織厚度降低（P＜0.05）。
2.4 根皮素聯合透明質酸鈉抑制粘連組織中氧化應激水平
氧化應激反應在粘連形成過程中十分重要，過度的氧化應激反應可促進粘連形成，因此本研究進一步檢測了正常腹膜/粘連組織中氧化應激關鍵分子MDA和SOD的水平。與假手術組比較，對照組、HA組的MDA水平升高（P＜0.05），但PHL組和PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL組和PHL+HA組的MDA水平降低（P＜0.05），但HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖1i。
與假手術組比較，對照組的SOD活性降低（P＜0.05），但PHL組和PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05），HA組；與對照組比較，PHL+HA組的SOD活性升高（P＜0.05），但HA組和PHL組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05），見圖1j。
2.5 根皮素促進粘連組織中Nrf2的表達
Nrf2信號通路在氧化應激損傷中發揮著重要作用，因此本研究進一步檢測了5組大鼠正常腹膜/粘連組織中Nrf2的表達情況。結果發現，與假手術組比較，PHL組和PHL+HA組的Nrf2表達水平升高（P＜0.05），但對照組和HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL組和PHL+HA組的Nrf2表達水平升高（P＜0.05），但HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖1d和1k。
3 討論
術后腹腔粘連是常見的腹部外科手術后并發癥之一，其發生率高，可引起一系列與之相關的并發癥的發生，嚴重威脅著人們的健康[1, 10, 11]。然而目前對于其發生發展機制及其防治策略的研究仍然較少。本研究通過動物實驗證實根皮素可以預防術后腹腔粘連的形成，其可能的機制是通過激活Nrf2通路進而抑制氧化應激反應、降低炎癥反應水平、減少纖維沉積。
炎癥反應是粘連形成的始動因素，在手術后局部腹膜組織受損，導致大量的炎癥細胞聚集，釋放大量炎癥分子，進而局部血管擴張，大量富含纖維蛋白的液體滲出[12, 13]。這些滲出的液體會在局部形成一個薄膜，此為粘連形成的雛形。而后隨著粘連組織中大量纖維細胞分泌膠原蛋白，粘連變得致密，進而形成牢固的粘連組織[14, 15]。雖然炎癥反應是組織修復的重要生物學過程，然而過度的炎癥反應可加重粘連的形成，因此抑制炎癥反應及其擴大對于預防術后腹腔粘連形成十分必要[16, 17]。在本研究中筆者發現，使用根皮素治療后可以明顯降低粘連組織中的炎癥反應水平，粘連組織中HE染色炎癥評分降低并且與粘連形成最為相關的炎癥分子TGF-β1的表達含量也明顯降低。這提示根皮素抑制炎癥反應的可能機制與降低粘連組織中炎癥反應有關。
纖維形成是術后腹腔粘連形成的另外一個重要原因，腸粘連形成的本質即為異常的腹腔內纖維條索的形成[17, 18]。在炎癥基礎上形成的早期粘連組織并不穩定，需要進一步通過纖維細胞分泌形成的各型細胞外基質成分形成穩定而致密的粘連，隨著膠原的沉積，逐漸形成穩定的粘連組織[19]。因此，預防粘連組織的另外一個可行的策略即為減輕術后纖維沉積或者形成。本研究發現，根皮素聯合透明質酸鈉治療可以明顯降低粘連組織中的膠原沉積情況。然而單獨使用根皮素并不能很好地抑制膠原的沉積，這可能與腹膜間皮細胞修補時間窗有關，在局部腹膜組織受損后，腹膜間皮細胞會在術后24 h內啟動修復，然而已經形成的粘連組織會占據受損創面的空間，導致腹膜間皮細胞只能沿著粘連組織的表面進行修復，合并使用透明質酸酸鈉后可以通過物理屏障隔開受損的創面，為腹膜間皮細胞的修復提供一時間窗，進而使得根皮素可以達到很好的預防術后腹腔粘連的作用[20]。
氧化應激在粘連形成過程中扮演著重要角色，過度激活的活性氧物質不僅會導致腹膜間皮細胞發生凋亡或壞死，并且也會促使其向纖維細胞轉化進而抑制腹膜間皮細胞的修復[21, 22]。目前研究[23]表明，抑制氧化應激反應可以減輕術后腹腔粘連形成。本研究發現使用根皮素治療后，粘連組織中氧化應激產物MDA的水平明顯降低，而清除活性氧的物質SOD的水平明顯升高，提示根皮素預防術后腹腔粘連形成的另外一個重要機制可能與降低粘連組織中氧化應激水平有關。Nrf2是抗氧化應激反應的一個重要分子，目前在多種缺血損傷模型中Nrf2均發揮著減輕活性氧的產生、促進組織修復的作用[24]。之前有研究[25]表明根皮素可以激活Nrf2的表達，本研究也得出相似的結論。這提示根皮素抑制氧化應激反應的可能機制與激活Nrf2通路有關。
本研究通過動物實驗驗證了根皮素預防術后腹腔粘連形成的作用，并證實其可能與降低炎癥反應、減輕膠原沉積、激活Nrf2通路進而抑制氧化應激反應有關。然而本研究有一定的局限性，首先本研究為動物體內實驗，對于根皮素在人體中預防術后腹腔粘連的作用尚不明確，需進一步研究；其次，本研究并未進行細胞實驗，驗證根皮素抑制氧化應激的具體作用機制，可在接下來的研究中進一步進行。總之，本研究初步在動物模型中證實了根皮素預防術后腹腔粘連形成的作用及其可能的機制，這為其在臨床中的應用奠定了理論基礎。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：張志星完成論文撰寫和實驗操作；龍延濱、宋斌、聶靈芝完成了數據收集及分析；吳云樺和都慶國審校論文。
倫理聲明：本研究已通過西安交通大學醫學院第三附屬醫院科研項目倫理審批 ［批文編號：2022-k011］。
術后腹腔粘連是常見的腹部外科手術并發癥之一，在所有開腹手術中有90%～95%的患者會并發腹腔粘連的形成[1, 2]。由于粘連導致的異常腹腔內附著，可引起一系列與之相關的并發癥的發生，其中包括有慢性腹部疼痛、女性不孕、腸梗阻等[3]。目前對于術后腹腔粘連的治療方法十分有限，粘連一旦形成除外手術松解尚無其他有效的措施，因此對于術后腹腔粘連的預防顯得十分必要[4]。粘連形成的過程涉及到炎癥反應、纖維形成或沉積、腹膜間皮細胞修復等，然而目前臨床中主要應用到的預防術后腹腔粘連形成的藥物主要是通過使用物理屏障隔離的藥物，通過隔開可能粘連的受損腹膜創面達到預防粘連形成的效果，并未考慮到粘連形成過程中復雜的病理生理過程[5]。因此其療效有限，尋求更加有效的預防粘連形成的藥物十分必要。
根皮素是一種天然類黃酮類小分子化合物，廣泛存在于蘋果、梨等水果表皮內，是目前新發現的一類天然皮膚美白劑[6]。目前研究表明根皮素有著廣泛的生物學作用，可以抑制炎癥反應、抗菌、抗氧化、抑制癌癥、抑制纖維形成、抑制免疫反應等[7, 8]。本研究通過體內動物實驗證實根皮素預防術后腹腔粘連形成的作用及其可能的機制，這為根皮素在術后腹腔粘連防治中的應用提供了理論依據，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及造模
本研究所有動物均購買并飼養于西安交通大學醫學部動物實驗中心并于西安交通大學醫學部動物實驗房進行實驗。40只雄性SD大鼠，普通級、6周齡、體質量150 g。將40只大鼠從1～40編號，在12 h光照12 h黑暗環境下適應1周后，在Excel軟件中使用完全隨機分組法將40只大鼠分為5組，每組8只。其中假手術組（Sham組）只行開關腹手術，其余組別均行盲腸搔刮摩擦法造模。造模方法如下：術前1 d剃去腹部毛發，術前12 h禁食；采用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后常規消毒鋪巾，取下腹正中切口長3 cm開腹；提出盲腸，使用干紗布在盲腸及其對側腹壁各摩擦30次，直至點狀出血，摩擦完畢后將磨損的盲腸與腹壁相對放置；分兩層關腹，術后第1天只進食糖鹽水，術后第2天恢復正常飲食。術后每天消毒傷口1次，術后第7天全身麻醉后以脊椎脫臼法處死大鼠。
1.2 實驗分組及處理
假手術組開腹后直接關腹，對照組及根皮素組（PHL組）大鼠造模后關腹，透明質酸鈉組（HA組）及透明質酸鈉聯用根皮素組（PHL+HA組）大鼠采用2 mL透明質酸鈉凝膠涂抹受損腹壁及盲腸后關腹。術后使用根皮素治療的組別（包括PHL組和PHL+HA組）每日予以2 mL由0.5%羧甲基纖維素鈉溶解的40 mg/kg根皮素灌胃治療，其余組別均予以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液2 mL灌胃。術后第7天采用倒“U”型切口開腹，由2位對研究設計不知情的獨立研究者采用Nair’s評分評估粘連的嚴重程度，具體評分細則詳見文獻[9]。評估粘連完畢后收集粘連組織或者正常腹膜組織（假手術組收集盲腸及其對面的腹膜組織），將收集的標本分為2份，一份凍存于–80 ℃備用，用于檢測轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平；一份使用10%甲醛水溶液固定后行石蠟包埋，用于免疫組織化學染色、HE染色和天狼星紅染色。
1.3 免疫組織化學染色
將各組粘連組織或正常腹膜組織石蠟包埋的組織制備成4 μm厚的石蠟切片，脫蠟后采用免疫組織化學試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，Cat:SP0041）進行免疫組織化學染色，其中Nrf2抗體（Proteintech，Cat:16396-1-AP）稀釋比例為1∶50，余操作按說明書進行。每只大鼠隨機選取3張切片進行染色，每個切片至少選取3～5個高倍鏡視野進行評估，取該大鼠的所有高倍鏡視野的均值進行下一步統計分析。完成免疫組織化學染色后由2位對研究并不知情的獨立研究者對染色情況進行評分，其中在粘連組織中Nrf2無表達評0分，輕度染色1分，中等程度染色評2分，強染色評3分，染色程度特別強、呈褐色評4分。
1.4 HE染色
隨機選取8張上述制備好的病理切片，常規脫蠟，將切片放入蘇木精水溶液中染色10 min，置入酸水及氨水中各數10 s，流水沖洗1 h后入70%和90%乙醇中脫水各10 min。采用乙醇伊紅染色液染色3 min，封片固定。對于炎癥評分情況由2位獨立研究者進行，其中每張病理切片隨機選取5個高倍鏡視野，計算其均值進行評分。粘連組織中無炎癥細胞浸潤評0分，有少量巨噬細胞、淋巴細胞或漿細胞浸潤評1分，有中等程度的巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞或漿細胞浸潤評2分，局部組織有大量炎癥細胞浸潤，形成微小膿腫或大量血管新生評3分。
1.5 天狼星紅染色
每個組織隨機選取5個以上病理切片進行天狼星紅苦味酸染色。使用0.1%天狼星紅苦味酸進行染色，然后用蘇木精復染（北京索萊寶科技有限公司，Cat:G1470）。操作按說明書進行。每張病理切片隨機選擇5個高倍視野進行膠原組織厚度測量并計算其均值。
1.6 MDA和SOD水平測定
5組大鼠粘連組織或正常腹膜組織中的MDA及SOD水平檢測均采用試劑盒（MDA，北京索萊寶科技有限公司，BC0025；SOD，南京建成生物研究所，Cat:A001-1），實驗操作方法按照說明書進行。
1.7 TGF-β1表達測定
粘連或正常腹膜組織中的TGF-β1表達水平采用大鼠TGF-β1 ELISA定量檢測試劑盒（R&D）進行，實驗方法按說明書進行。
1.8 統計學方法
本研究采用SPSS 18.0軟件行統計學分析，其中符合正態分布的計量資料使用方差分析；非正態分布或方差不齊的計量資料使用Kruskal-Wallis H檢驗。計數資料比較使用列聯表χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
本研究中40只大鼠均順利完成實驗，手術后7 d內無大鼠發生死亡或者術后并發癥出現。實驗結果見圖1。
圖1
示5組大鼠的粘連情況及Nair’s評分
a：5組大鼠最具代表性的粘連圖片，黑箭所指為粘連組織；b：5組大鼠腹膜/粘連組織的HE染色結果（ ×100），黑箭所指為正常腹膜或粘連組織；c：5組大鼠腹膜/粘連組織中的纖維沉積情況（天狼星紅染色 ×100），黑箭所指為正常腹膜或粘連組織；d：5組大鼠腹膜/粘連組織的Nrf2表達情況（免疫組織化學染色 ×100），黑箭所指為正常腹膜或粘連組織；e：5組大鼠的Nair’s評分；f：5組大鼠腹膜/粘連組織的炎癥評分情況；g：5組大鼠腹膜/粘連組織中TGF-β1的表達情況；h：5組大鼠腹膜/粘連組織中的膠原厚度，黑箭指示；i：5組大鼠腹膜/粘連組織中的MDA水平；j：5組大鼠腹膜/粘連組織中的SOD活性；k：5組大鼠腹膜/粘連組織中Nrf2表達水平的免疫組織化學評分
2.1 根皮素聯合透明質酸鈉治療抑制術后腹腔粘連形成
5組大鼠粘連情況及Nair’s評分分別見圖1a和圖1e。在假手術組僅有1只大鼠發生切口粘連；對照組所有大鼠均發生粘連，為片狀致密粘連；HA組及PHL組大鼠均有粘連形成，但粘連情況稍有改善，粘連組織稀松；PHL+HA組有2只大鼠未發生粘連，其余大鼠的粘連情況明顯減輕，粘連組織稀松。與假手術組比較，對照組、HA組和PHL組的Nair’s評分較高（P＜0.05），而PHL+HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL+HA組的Nair’s評分降低（P＜0.05），但HA組和PHL組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2 根皮素聯合透明質酸鈉抑制粘連組織中的炎癥反應水平
炎癥反應是粘連形成的始動因素，因此本研究進一步檢測了粘連組織中的炎癥反應情況（見圖1b）。在炎癥評分方面，與假手術組比較，對照組和HA組的炎癥評分較高（P＜0.05），而PHL組和PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL組及PHL+HA組的炎癥評分降低（P＜0.05），但HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05），見圖1f。
在TGF-β1的表達方面，與假手術組比較，對照組和HA組的TGF-β1表達水平較高（P＜0.05），而PHL組和PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL組及PHL+HA組的TGF-β1表達水平降低（P＜0.05），但HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05），見圖1g。
2.3 根皮素聯合透明質酸鈉抑制粘連組織中的纖維沉積
粘連形成的本質即為異常的纖維條帶，故而本研究進一步檢測了粘連組織中的膠原沉積情況，結果如圖1c和1h所示。通過天狼星紅染色，本研究發現，與假手術組比較，對照組、HA組、PHL組和PHL+HA組膠原組織厚度均升高（P＜0.05）；與對照組比較，PHL+HA組的膠原組織厚度降低（P＜0.05），但HA組和PHL組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的膠原組織厚度降低（P＜0.05）。
2.4 根皮素聯合透明質酸鈉抑制粘連組織中氧化應激水平
氧化應激反應在粘連形成過程中十分重要，過度的氧化應激反應可促進粘連形成，因此本研究進一步檢測了正常腹膜/粘連組織中氧化應激關鍵分子MDA和SOD的水平。與假手術組比較，對照組、HA組的MDA水平升高（P＜0.05），但PHL組和PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL組和PHL+HA組的MDA水平降低（P＜0.05），但HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖1i。
與假手術組比較，對照組的SOD活性降低（P＜0.05），但PHL組和PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05），HA組；與對照組比較，PHL+HA組的SOD活性升高（P＜0.05），但HA組和PHL組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05），見圖1j。
2.5 根皮素促進粘連組織中Nrf2的表達
Nrf2信號通路在氧化應激損傷中發揮著重要作用，因此本研究進一步檢測了5組大鼠正常腹膜/粘連組織中Nrf2的表達情況。結果發現，與假手術組比較，PHL組和PHL+HA組的Nrf2表達水平升高（P＜0.05），但對照組和HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，PHL組和PHL+HA組的Nrf2表達水平升高（P＜0.05），但HA組的差異無統計學意義（P>0.05）；與HA組和PHL組比較，PHL+HA組的差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖1d和1k。
3 討論
術后腹腔粘連是常見的腹部外科手術后并發癥之一，其發生率高，可引起一系列與之相關的并發癥的發生，嚴重威脅著人們的健康[1, 10, 11]。然而目前對于其發生發展機制及其防治策略的研究仍然較少。本研究通過動物實驗證實根皮素可以預防術后腹腔粘連的形成，其可能的機制是通過激活Nrf2通路進而抑制氧化應激反應、降低炎癥反應水平、減少纖維沉積。
炎癥反應是粘連形成的始動因素，在手術后局部腹膜組織受損，導致大量的炎癥細胞聚集，釋放大量炎癥分子，進而局部血管擴張，大量富含纖維蛋白的液體滲出[12, 13]。這些滲出的液體會在局部形成一個薄膜，此為粘連形成的雛形。而后隨著粘連組織中大量纖維細胞分泌膠原蛋白，粘連變得致密，進而形成牢固的粘連組織[14, 15]。雖然炎癥反應是組織修復的重要生物學過程，然而過度的炎癥反應可加重粘連的形成，因此抑制炎癥反應及其擴大對于預防術后腹腔粘連形成十分必要[16, 17]。在本研究中筆者發現，使用根皮素治療后可以明顯降低粘連組織中的炎癥反應水平，粘連組織中HE染色炎癥評分降低并且與粘連形成最為相關的炎癥分子TGF-β1的表達含量也明顯降低。這提示根皮素抑制炎癥反應的可能機制與降低粘連組織中炎癥反應有關。
纖維形成是術后腹腔粘連形成的另外一個重要原因，腸粘連形成的本質即為異常的腹腔內纖維條索的形成[17, 18]。在炎癥基礎上形成的早期粘連組織并不穩定，需要進一步通過纖維細胞分泌形成的各型細胞外基質成分形成穩定而致密的粘連，隨著膠原的沉積，逐漸形成穩定的粘連組織[19]。因此，預防粘連組織的另外一個可行的策略即為減輕術后纖維沉積或者形成。本研究發現，根皮素聯合透明質酸鈉治療可以明顯降低粘連組織中的膠原沉積情況。然而單獨使用根皮素并不能很好地抑制膠原的沉積，這可能與腹膜間皮細胞修補時間窗有關，在局部腹膜組織受損后，腹膜間皮細胞會在術后24 h內啟動修復，然而已經形成的粘連組織會占據受損創面的空間，導致腹膜間皮細胞只能沿著粘連組織的表面進行修復，合并使用透明質酸酸鈉后可以通過物理屏障隔開受損的創面，為腹膜間皮細胞的修復提供一時間窗，進而使得根皮素可以達到很好的預防術后腹腔粘連的作用[20]。
氧化應激在粘連形成過程中扮演著重要角色，過度激活的活性氧物質不僅會導致腹膜間皮細胞發生凋亡或壞死，并且也會促使其向纖維細胞轉化進而抑制腹膜間皮細胞的修復[21, 22]。目前研究[23]表明，抑制氧化應激反應可以減輕術后腹腔粘連形成。本研究發現使用根皮素治療后，粘連組織中氧化應激產物MDA的水平明顯降低，而清除活性氧的物質SOD的水平明顯升高，提示根皮素預防術后腹腔粘連形成的另外一個重要機制可能與降低粘連組織中氧化應激水平有關。Nrf2是抗氧化應激反應的一個重要分子，目前在多種缺血損傷模型中Nrf2均發揮著減輕活性氧的產生、促進組織修復的作用[24]。之前有研究[25]表明根皮素可以激活Nrf2的表達，本研究也得出相似的結論。這提示根皮素抑制氧化應激反應的可能機制與激活Nrf2通路有關。
本研究通過動物實驗驗證了根皮素預防術后腹腔粘連形成的作用，并證實其可能與降低炎癥反應、減輕膠原沉積、激活Nrf2通路進而抑制氧化應激反應有關。然而本研究有一定的局限性，首先本研究為動物體內實驗，對于根皮素在人體中預防術后腹腔粘連的作用尚不明確，需進一步研究；其次，本研究并未進行細胞實驗，驗證根皮素抑制氧化應激的具體作用機制，可在接下來的研究中進一步進行。總之，本研究初步在動物模型中證實了根皮素預防術后腹腔粘連形成的作用及其可能的機制，這為其在臨床中的應用奠定了理論基礎。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：張志星完成論文撰寫和實驗操作；龍延濱、宋斌、聶靈芝完成了數據收集及分析；吳云樺和都慶國審校論文。
倫理聲明：本研究已通過西安交通大學醫學院第三附屬醫院科研項目倫理審批 ［批文編號：2022-k011］。
