引用本文： 霍晨鈺, 蔣利. 原發性肝癌循環腫瘤細胞富集方法的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(4): 494-500. doi: 10.7507/1007-9424.202210034 復制
原發性肝癌是世界上第七大最常見的癌癥，也是導致癌癥死亡的第二大常見原因[1]，其病理學類型主要包括肝細胞癌、肝內膽管細胞癌和混合型肝細胞癌-膽管癌，其中肝細胞癌約占原發性肝癌的90%[2]，因此后文中出現的“肝癌”指“肝細胞癌”。我國肝癌發病率和病死率均高于世界平均水平，2013年新發36.2萬例，占全國癌癥發病總數的9.8%，居第4位；死亡31.6萬例，占全國癌癥死亡總數的14.2%，居第2位[3]。雖然我國對肝癌診斷和治療水平已逐漸提高，但其預后效果仍不理想，其原因可能是早期確診困難且極易轉移和復發。因此，探究可用于肝癌早期診斷及監測的新型腫瘤檢測指標有重要意義。甲胎蛋白是目前廣泛應用于診斷肝癌的血清學指標，但其靈敏度和特異度不穩定且對腫瘤轉移和復發的預測效能尚不足。近年來，循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）已成為研究熱點。原發性或轉移性腫瘤病灶中CTC進入血液循環而引發血源性轉移[4]，它與腫瘤轉移及復發密切相關。因此，檢測肝癌患者外周血中CTC在肝癌早期診斷、動態監測、個體化治療、預后評估等方面均有較好的發展前景。但是由于CTC在外周血中數量少且異質性高，因而準確且高效富集CTC是臨床應用的重要前提，因此，筆者對目前CTC的富集方法進行綜述。
1 CTC的臨床意義及富集技術難點
1.1 CTC的臨床意義
CTC最初是由澳大利亞醫生Thomas Ashworth于1869年在乳腺癌患者血液中發現，是自發或因診療操作從原發病灶轉移到外周循環或淋巴系統，并最終在骨髓、淋巴結或被轉移的器官中生長的腫瘤細胞[5]。現有研究[6]表明，CTC參與了腫瘤的遠處轉移及術后復發，并能較好地反映腫瘤在患者體內的動態變化；此外發現，不同患者、同一患者不同部位、不同腫瘤細胞之間均存在明顯的異質性，其中肝癌、乳腺癌等均有較高的陽性CTC檢出率。穆洪等[7]研究顯示，肝癌患者手術前外周血中CTC經納米磁珠富集檢出率為96%；齊魯楠等[8]研究顯示，112例肝癌患者術前1～2 d檢測出CTC者101例（90.18%），20名健康自愿者外周血中未檢測到CTC；Liu等[9]用CellSearch系統檢測發現肝癌患者外周血CTC數量與肝癌預后密切相關。因此，進一步發展CTC獲得及檢測技術以實現對CTC分類后進一步精細研究，有助于對肝癌患者進行CTC實時監測并進行后續個體化治療。
1.2 CTC富集技術難點
采用高效的分離與富集方法來捕獲外周血液循環系統中數量極少的CTC，是對獲取的CTC進行分析鑒定并為臨床精準診療提供重要參考依據的基礎。一般來說，理想的CTC富集方法應至少具備以下特征[10]：① 高靈敏度，能夠在上億個正常細胞中發現至少1個CTC；② 高特異性，要求檢測結果準確無誤，避免出現假陽性和假陰性結果；③ 高純度，要求CTC不能被污染；④ 可重復性，回收率高；⑤ 保持細胞的活性和完整性，允許進一步分子特征鑒定和培養；⑥ 價廉，成本低，適于臨床應用。然而CTC從原發病灶脫落后，會被宿主免疫系統識別并攻擊，只有極少數高活力、高侵襲性的CTC可以存活，并在一定條件下發展為轉移病灶。有研究[11]結果顯示，每107個血液細胞中僅有≤1個CTC，并且血液中還存在大量蛋白質、核酸、糖類等物質，而用于識別CTC的生物標志物特異性較差，給CTC的分離與富集帶來極大困難；此外，血液樣本的處理包括對靶細胞進行預標記、固定細胞、裂解紅細胞、預過濾、樣本稀釋等過程，其目的是通過放大靶細胞和非靶細胞之間的差異來輔助富集過程，但是這些處理往往會干擾下游基因的檢測、造成細胞損失，從而影響富集技術在臨床應用中的實際效能[12]。因此，發展高效的CTC富集技術是CTC檢測的關鍵步驟和重要前提。
2 CTC主要富集技術
CTC富集可依據CTC與其他細胞在物理或生化特性方面的差異，前者主要根據細胞密度、體積等的差異進行分離；后者主要將親和配體（抗體或適配體）固載于微通道或磁珠上，通過抗原抗體、配體適配體之間的特異性結合實現CTC的分離富集。
2.1 根據物理特性的富集方法
基于CTC與其他血液細胞在物理特性方面差異不同的富集方法，不需要對細胞進行免疫組織化學染色或抗體標記，操作簡單，成本較低，縮短了樣品的制備時間，降低了細胞損傷的風險，而且根據物理特性分離方法可以實現高通量；但由于白細胞與CTC的某些物理特性有重疊，物理分離的特異性較差，分離純度較低。
2.1.1 密度梯度離心法
此法是根據血流中不同細胞沉降系數差異，離心后在細胞分離液中獲得呈梯度分布的不同細胞層，懸浮液中顆粒的沉降速率取決于顆粒的大小以及顆粒與周圍溶液之間的密度差[13-14]。目前常用的細胞密度梯度介質為Ficoll和OncoQuick，前者分離范圍較窄，多用于分離外周血單個核細胞；后者帶有多孔篩，可有效減少白細胞污染。Ficoll和OncoQuick的回收率均約為70%～90%，而OncoQuick減少了捕獲過程中平均紅細胞血紅蛋白含量的消耗[15]，CTC純度較高[16]。此方法操作簡單、成本低，但靈敏度和特異度較低，易混雜其他細胞，也容易造成CTC丟失，出現假陰性，因此一般作為預富集方法。
2.1.2 濾過分離法
此法是基于CTC體積一般大于其他血細胞，CTC的大小為14～26 μm，白細胞為7～20 μm，紅細胞為7～8 μm[17]。濾膜濾法分離上皮源性腫瘤細胞技術是最早的濾過分離技術之一，該技術是使用乙二胺四乙酸緩沖液稀釋過的血液樣本，然后用8 μm孔徑過濾器過濾[18]。CTC由于體積較大保留在過濾器，而紅細胞和白細胞由于體積小于過濾器孔徑可以通過隨機分布的孔。通過細胞體積大小分離原理的濾膜濾法分離上皮源性腫瘤細胞技術和ScreenCell分選系統現已被應用于黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的臨床試驗[19-20]。現有技術將濾膜濾法與微流控芯片結合，可回收細胞或直接在芯片內進行分析研究，提高CTC捕獲率與通量。Clinomics公司開發的FAST[21]允許從全血中快速分離出純度較高的CTC，該裝置由一個帶有8 μm孔的軌跡蝕刻聚碳酸酯膜組成，選擇性地根據細胞大小分離CTC，并且在整個過濾過程中，膜孔填充穩定的液體，以減少堵塞和分離時間（圖1a）。全血樣本可以通過旋轉圓盤在過濾器上分離，從3 mL全血中分離CTC所需的總過濾時間少于1 min。此方法操作簡單，成本低，速度快，不易破壞細胞，然而與密度梯度離心法類似，CTC不易與體積較大的血細胞分離，體積較小的CTC容易被濾過掉，且其通量較低，易發生膜孔堵塞，因此也只作為其他方法的富集前準備方法。
圖1
示CTC分離技術
a：FAST濾過分離法；b：DLD技術；c：渦流捕獲技術；d：超聲波分離法；e：介電泳分離法；f：DPPB方案
2.1.3 流體力學方法
此法主要根據微流控芯片中流體內微粒運動的不同特性來分離細胞，主要有確定性側向位移（deterministic lateral displacement，DLD）、慣性聚焦和渦流捕獲技術3種方法。
2.1.3.1 DLD 技術
此技術是利用微流控通道的層流特性，是基于微流體尺寸差異的分離方法。基于DLD設計的芯片內具有相對于流體流動方向呈一定角度的微柱陣列，尺寸不同的顆粒在流動過程中有不同的運動軌跡[22]（圖1b）。DLD技術可直接用全血樣本在多種條件下有效分離微粒，操作簡單且對細胞存活率影響較小[21-22]。Loutherback等[23]應用呈矩陣排列的三角柱可以從血液中分離CTC，在體積流速高達10 mL/min時捕獲效率>85%，且對細胞活力無影響。DLD技術采用的芯片和材料存在不足，芯片結構為高深寬比，玻璃材料加工難達設計要求，需采用聚二甲基硅氧烷材料，但此是軟性材料，微柱間間隙小，生產時脫模易出錯，芯片成品率低，導致成本高且全血樣本堵塞風險大[24]。
2.1.3.2 慣性聚焦技術
此技術是利用慣性升力和Dean渦流原理實現CTC分離。流體在微通道內運動時產生的慣性升力使懸浮顆粒位移，通道形狀很多，其中螺旋型應用較廣[22]。流體在通道中會產生Dean旋渦，粒子在迪恩力的作用下與慣性升力相互作用，使不同大小的粒子達到不同的平衡位置從而進行分離。Altay等[25]利用了Dean渦流和慣性升力的優點，在特定的彎曲蛇形微通道中開發了一種連續、高通量和可并行的基于尺寸的粒子聚焦技術；還有研究者[26]依據微尺度下的慣性效應設計了一種方形通道芯片，細胞在方形管道中由于Dean渦流與慣性升力共同作用，在管道長邊中點附近產生平衡位點，由于高度依賴于尺寸的慣性升力控制著細胞運動，較大的CTC更快地遷移到其平衡位置，使其他較小的細胞不聚焦并在整個通道橫截面上隨機分布。此技術能連續分離細胞，富集率高且成本低，操作簡單，對細胞損傷小。但若細胞濃度過高時細胞易受相互作用影響，影響細胞聚焦到平衡位置，降低富集純度。因此，需預先去除樣本中紅細胞，且該法對實驗流速敏感，需精確控制流速。
2.1.3.3 渦流捕獲技術
此技術是根據細胞的特性，流體在微尺度通道中膨脹時發生層流旋渦，較大細胞在慣性升力作用下易形成穩定旋渦軌道，較小細胞不能保持穩定軌道而流出芯片（圖1c）。如Vortex HT芯片將血細胞驅動至芯片中連續的長方形室，流體在流室內產生旋渦，大細胞隨著旋渦一直旋轉，小細胞則隨著液體流出；進樣結束后更換緩沖液清洗，CTC仍維持在旋渦中，然后改變流速將CTC釋放出來[27]。該方法富集的CTC純度較高，白細胞污染極少，通量大，可直接對全血處理；但該方法富集率較低（50%左右），且在更換緩沖液過程中芯片內旋渦可能消失而致CTC釋放出來，降低捕獲率。
2.1.4 基于超聲波的富集技術
此技術主要基于懸浮在流體中的粒子在暴露于超聲波中時會受到聲波力作用，通過產生的震蕩壓力分離CTC。細胞受到的震蕩壓力與細胞密度、大小及可壓縮性成正比，它以不同速度和方向流向相應通道[12]（圖1d）。有研究者[28]根據CTC和白細胞體積大小不同，采用微流控電泳芯片富集CTC，在高頻聲波作用下，CTC移向壓力通道中央，而白細胞則移向通道壁側。此方法的優點是對細胞損傷小，靈活性強；但是其缺點是，不能對全血直接處理，需預先去除紅細胞；要提前準備設備，并且要求聲波發射和放大設備的性能穩定，若聲波功率太大產生的熱會損傷細胞。
2.1.5 介電泳技術
電泳是通過帶電粒子上的凈電荷與施加電場間的作用力使帶電粒子運動。中性粒子本身無凈電荷，可通過中性粒子在非均勻電場中的極化作用產生介電泳力，因此，應用介電電泳力可將CTC分離富集。在基于雙向電泳的富集技術中，不同介電常數的細胞在電場中受到的介電電泳力大小與方向不同，可使細胞向相應方向移動（圖1e）。Gascoyne等[29]研究了介電泳場流分級分離方法從臨床血液樣本中分離CTC，此法可利用固有的腫瘤細胞特性，不需標記，細胞捕獲率超過90%，而且還可提供未經修飾的活腫瘤細胞用于培養或所有類型的分子分析。另有研究者[30]采用ApoStream?技術，此技術需先用Ficoll分離法隔離單核細胞，然后使用設備處理，剩余細胞以層流形式通過介電場，當CTC通過電極時，交變電流頻率將CTC從層流中拉到設備底部，而其他血液成分繼續流過。介電泳分離能在大約60 min內從7.5 mL血液中分離出棕黃色涂層中的CTC，回收率高，得到的細胞純度及活性均高且操作簡單，無需依賴CTC表面標志物，但所需設備復雜，與其他方法相比通量較小，仍需進一步提高其富集效率。
2.2 根據生化特性的富集方法
2.2.1 基于表面抗原差異的富集方法
以抗原為基礎的方法是利用CTC與血細胞表面特異性抗原的差異來分離CTC，主要包括免疫磁珠和固載抗體微通道方法。
2.2.1.1 免疫磁珠技術
此法基本原理為：血液中幾乎所有細胞都有抗磁性或弱磁性[31]，故可將在CTC或血細胞表面表達的相關抗原所對應的抗體包被在具有順磁性的磁珠表面，磁珠在外加磁場中通過“磁珠/抗體-抗原/細胞”的方式與目標細胞結合而分離。根據這一原理，可以將免疫磁珠分離法分為陽性分離法和陰性分離法。陽性分離法是利用磁珠與CTC表面抗原結合而直接分離CTC，陰性分離法是通過磁珠與血細胞表面抗原結合而間接分離CTC，如白細胞通過表面的特異性CD45抗原與包被有相應抗體的磁珠結合而分離得到CTC。① 陽性分離法。此法目前已被應用于多種檢測系統，如Veridex公司的CellSearch系統，該系統選擇以大部分腫瘤細胞表面表達的上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗原作為靶點，不但可實現CTC富集，還可完成后續的固定、染色及熒光分析，該系統已被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床檢測CTC，已成為金標準[32]。但是CTC在進展過程中會發生上皮-間質轉化，并且具有上皮-間質轉化表型的CTC通常侵襲性高[33]，而且發生上皮-間質轉化的CTC表面的EpCAM會低表達甚至不表達，因而會導致結果呈現假陰性[34]，同時細胞在磁場中極易發生聚集，在分離與磁珠結合的細胞過程中可能影響細胞活性，導致無法進行后續檢測分析。因此，尋找CTC特異性抗原以及聯合其他生物標志物是未來CTC分離富集方法的重要研究方向。② 陰性分離法。此方法雖然可以有效解決漏檢的問題，但分離得到的CTC中易混有低表達血細胞抗原的非CTC細胞，富集CTC純度不佳。最常采用的是通過抗CD45抗體與磁珠結合以去除白細胞，如EasySep技術[35]使用磁場來保留白細胞，而生成的上清液保留了不表達CD45的CTC異質群體。該方法可實現不依賴CTC表面標志物。然而由于血液中CTC數量少，負性分離過程可能由于CTC被大量血細胞包裹，從而使它在分離過程中易丟失，導致回收率較低。目前，還有許多可替代的免疫磁性捕獲方法，如磁性細胞分選系統[36]、磁鐵清掃裝置[37]、Strep標記系統[38]、磁細胞離心機平臺[39]、在捕獲或釋放機制方面與CellSearch不同的仿生免疫磁小體[40]等，這些方法的分離純度更高，然而CellSearch平臺仍然是免疫磁性CTC捕獲領域的領導者[41]。
2.2.1.2 固載抗體微通道技術
此法是將細胞表面抗原對應的抗體固載于芯片的通道內壁，檢測樣本流過通道時，可以通過免疫親和作用使目標細胞表面抗原與通道內壁的抗體結合后去除雜質，然后可得到CTC。Stott等[42]通過在一種“人”字形HB芯片通道表面增添“人”字形微導管，當流體通過時可產生側向二次流，引起的渦流增加抗體包被的裝置表面與細胞相互作用次數，提高對CTC的捕獲率，HB芯片在污染白細胞中捕獲的加標癌細胞的純度為（14.0±0.1）%，而CTC芯片為（9.2±0.1）%。該方法的優點是富集過程高度自動化，操作簡單，且能實現對富集CTCs直接染色觀察，但其缺點是微通道易阻塞，不利于高通量檢測。
總之，基于細胞表面抗原的富集方法特異性較高，CTC富集常采用此法，但其局限性為重復性差、保存期短、成本高、靈敏度不佳等，仍需繼續研究并克服這些不足。
2.2.2 基于表面配體差異的富集方法
適配體可以識別并特異性地結合靶細胞。Song等[43]應用多價核酸適配體納米微球修飾的芯片對樣本進行分離，通過核酸適配體多價效應可大大增強CTC與適配體間的親和力，從而顯著提高捕獲效率，其白細胞去除率可高達99.99%，且大多數（95.8%）釋放的CTC仍能存活。與基于抗體的富集方法相似，基于適配體的富集法也可分為陽性和陰性分離法，具有親和力高、可重復、保質期長等優點，但適配體往往價格高且用量大，因而技術成本較高。
2.2.3 基于生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統的富集方法
生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統是自然界已知的最強非共價相互作用之一，現有配體的親和性幾乎都無法超過該系統[44]。基于此，Chen等[45]建立了DNA酶催化近端蛋白生物素化（DNAzyme-catalyzed proximal protein biotinylation，DPPB）方案（圖1f），利用一種工程化的DNA基人工酶，誘導共價沉積在CTC膜上的生物素，此方案通過增加生物素的數量和細胞表面共價與非共價相互作用的比例，使CTC與磁珠的結合增強，通過此方案富集得到的高表達EpCAM和低表達EpCAM的CTC捕獲效率分別為92.2%和81.3%，較傳統方法（分別為69.6%和38.8%）提高，避免了普通免疫磁珠技術造成的低表達EpCAM亞群缺失，且DPPB基濃縮后CTC的純度有所提高，高表達EpCAM細胞的CTC純度提高了769倍，低表達EpCAM細胞的CTC純度提高了270倍。
2.3 多種原理聯合的富集方法
前面介紹的根據物理特性和生化特性的富集方法各有利弊（表1）。因此，探討將多種方法在同一設備中組合應用，從而提高CTC分離富集的純度與效率，以彌補單一方法的局限性。近年來，對微流控芯片的研究進展迅速，其原理可分為生物親和法與物理篩選法，生物親和法主要依賴抗原抗體或配體與適配體的特異性結合，選擇性高但捕獲率低，往往影響細胞活性；物理篩選法主要依賴細胞間物理性質差異，通過外加物理場誘導分離，操作簡單，不破壞細胞，但分離純度較低。利用微流控芯片的集成優勢，可將這兩種方法結合或與其他方法聯合使用，可以達到更好的分離富集效果。例如，為解決CTC低表達EpCAM抗原導致捕獲率低的問題，Wu等[46]在聚乳酸-羥基乙酸共聚物纖維化基底上同時修飾EpCAM和N-鈣黏蛋白適配體，實驗表明，可在確保捕獲到EpCAM正常表達的CTC的同時，減少對EpCAM低表達CTC的遺漏，減少了假陰性結果。Chen等[47]開發了一種橫向過濾陣列微流體設備，利用側向微柱陣列結構的芯片，在微柱上修飾EpCAM抗體，將基于尺寸的分離與基于免疫親和性的CTC分離相結合，CTC的捕獲效率可達（98.7±1.2）%，同時可保證較大通量。CTC-iChip[48]是使用了多種方法組合的新型芯片，首先將血液樣本用免疫磁珠技術陽性或陰性分離，其次利用DLD將有核細胞與紅細胞和血小板分離，然后細胞通過一個應用慣性聚焦方法排列在一條接近單一的管線中的微流控通道，細胞通過磁場進行最終富集。CTC-iChip的富集靈敏度較高，分離時需要磁力較低，從而提高了細胞收集量和細胞純度回收率[49]，具有高通量（每小時可處理8 mL血液）、高回收率的特點，而且富集得到的細胞活力較高，有利于進一步分析培養。我國歐洋等[50]報道根據“物理方法捕獲，形態方法鑒定，免疫方法識別”的方案研發出具有自主知識產權的CTC檢測設備——CTC-Biopsy檢測系統及其配套診斷試劑，已應用于肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、結直腸癌和腎癌的臨床研究，在此６種癌中對肝癌的靈敏度最高（77.8%），食管癌的靈敏度最低（42.86%）。
表1
示不同CTC富集方法的對比
3 總結與展望
CTC用于惡性腫瘤及肝癌患者早期診斷、分期、分層診療依據及療效監控的意義已得到醫學界的肯定。利用CTC檢測進行肝癌診斷及預后判斷往往需要兩步：即CTC分離富集和分析檢測。目前正在研究開發的CTC分離富集技術繁多，但各種技術均存在一定缺陷，仍有問題亟需解決，如：① 物理篩選法雖然通量高、不依賴生物標志物、細胞活力影響小，但捕獲率低；生物親和法純度和捕獲率較高但通量小且易損傷細胞。因此，如何通過將多種方法結合以實現高效的CTC富集仍需深入研究。② 生物親和法中靈敏度和特異度均較高的靶點選擇仍存在較大問題，尚需大量研究驗證現有靶點的有效性。③ 由于CTC本身的異質性及它在血行播散過程中發生上皮-間質轉換，現有技術尚不足以篩選出外周血中所有類型CTC，因此，在進行技術改進的同時進一步對CTC多種亞型深入認識十分重要。④ CTC易脫落并進入外周血液循環系統且在循環系統中半衰期較短，目前對CTC轉移規律研究不足，缺少證據表明最佳CTC檢測時間及檢測周期。⑤ 對于不同類型癌使用不同分離富集方法的結果不同，難以對各種方法進行系統評估和比較。⑥ 目前尚無對富集方法選擇及檢測結果解讀的統一標準，還需進行大量臨床研究以實現現有檢測方法的標準化。雖然還有許多問題要解決，但已有大量研究正在進行且已取得一些成果。因各種方法尚有其局限性而在肝癌中的臨床應用較少。相信在技術持續改進下，許多問題將會逐一解決，有望使CTC檢測能真正應用于臨床且與其他技術聯合，為肝癌患者提供更高效的診斷與治療方法指日可待。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：霍晨鈺查閱參考文獻與撰寫文稿；蔣利指導論文撰寫及控制文章質量。
原發性肝癌是世界上第七大最常見的癌癥，也是導致癌癥死亡的第二大常見原因[1]，其病理學類型主要包括肝細胞癌、肝內膽管細胞癌和混合型肝細胞癌-膽管癌，其中肝細胞癌約占原發性肝癌的90%[2]，因此后文中出現的“肝癌”指“肝細胞癌”。我國肝癌發病率和病死率均高于世界平均水平，2013年新發36.2萬例，占全國癌癥發病總數的9.8%，居第4位；死亡31.6萬例，占全國癌癥死亡總數的14.2%，居第2位[3]。雖然我國對肝癌診斷和治療水平已逐漸提高，但其預后效果仍不理想，其原因可能是早期確診困難且極易轉移和復發。因此，探究可用于肝癌早期診斷及監測的新型腫瘤檢測指標有重要意義。甲胎蛋白是目前廣泛應用于診斷肝癌的血清學指標，但其靈敏度和特異度不穩定且對腫瘤轉移和復發的預測效能尚不足。近年來，循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）已成為研究熱點。原發性或轉移性腫瘤病灶中CTC進入血液循環而引發血源性轉移[4]，它與腫瘤轉移及復發密切相關。因此，檢測肝癌患者外周血中CTC在肝癌早期診斷、動態監測、個體化治療、預后評估等方面均有較好的發展前景。但是由于CTC在外周血中數量少且異質性高，因而準確且高效富集CTC是臨床應用的重要前提，因此，筆者對目前CTC的富集方法進行綜述。
1 CTC的臨床意義及富集技術難點
1.1 CTC的臨床意義
CTC最初是由澳大利亞醫生Thomas Ashworth于1869年在乳腺癌患者血液中發現，是自發或因診療操作從原發病灶轉移到外周循環或淋巴系統，并最終在骨髓、淋巴結或被轉移的器官中生長的腫瘤細胞[5]。現有研究[6]表明，CTC參與了腫瘤的遠處轉移及術后復發，并能較好地反映腫瘤在患者體內的動態變化；此外發現，不同患者、同一患者不同部位、不同腫瘤細胞之間均存在明顯的異質性，其中肝癌、乳腺癌等均有較高的陽性CTC檢出率。穆洪等[7]研究顯示，肝癌患者手術前外周血中CTC經納米磁珠富集檢出率為96%；齊魯楠等[8]研究顯示，112例肝癌患者術前1～2 d檢測出CTC者101例（90.18%），20名健康自愿者外周血中未檢測到CTC；Liu等[9]用CellSearch系統檢測發現肝癌患者外周血CTC數量與肝癌預后密切相關。因此，進一步發展CTC獲得及檢測技術以實現對CTC分類后進一步精細研究，有助于對肝癌患者進行CTC實時監測并進行后續個體化治療。
1.2 CTC富集技術難點
采用高效的分離與富集方法來捕獲外周血液循環系統中數量極少的CTC，是對獲取的CTC進行分析鑒定并為臨床精準診療提供重要參考依據的基礎。一般來說，理想的CTC富集方法應至少具備以下特征[10]：① 高靈敏度，能夠在上億個正常細胞中發現至少1個CTC；② 高特異性，要求檢測結果準確無誤，避免出現假陽性和假陰性結果；③ 高純度，要求CTC不能被污染；④ 可重復性，回收率高；⑤ 保持細胞的活性和完整性，允許進一步分子特征鑒定和培養；⑥ 價廉，成本低，適于臨床應用。然而CTC從原發病灶脫落后，會被宿主免疫系統識別并攻擊，只有極少數高活力、高侵襲性的CTC可以存活，并在一定條件下發展為轉移病灶。有研究[11]結果顯示，每107個血液細胞中僅有≤1個CTC，并且血液中還存在大量蛋白質、核酸、糖類等物質，而用于識別CTC的生物標志物特異性較差，給CTC的分離與富集帶來極大困難；此外，血液樣本的處理包括對靶細胞進行預標記、固定細胞、裂解紅細胞、預過濾、樣本稀釋等過程，其目的是通過放大靶細胞和非靶細胞之間的差異來輔助富集過程，但是這些處理往往會干擾下游基因的檢測、造成細胞損失，從而影響富集技術在臨床應用中的實際效能[12]。因此，發展高效的CTC富集技術是CTC檢測的關鍵步驟和重要前提。
2 CTC主要富集技術
CTC富集可依據CTC與其他細胞在物理或生化特性方面的差異，前者主要根據細胞密度、體積等的差異進行分離；后者主要將親和配體（抗體或適配體）固載于微通道或磁珠上，通過抗原抗體、配體適配體之間的特異性結合實現CTC的分離富集。
2.1 根據物理特性的富集方法
基于CTC與其他血液細胞在物理特性方面差異不同的富集方法，不需要對細胞進行免疫組織化學染色或抗體標記，操作簡單，成本較低，縮短了樣品的制備時間，降低了細胞損傷的風險，而且根據物理特性分離方法可以實現高通量；但由于白細胞與CTC的某些物理特性有重疊，物理分離的特異性較差，分離純度較低。
2.1.1 密度梯度離心法
此法是根據血流中不同細胞沉降系數差異，離心后在細胞分離液中獲得呈梯度分布的不同細胞層，懸浮液中顆粒的沉降速率取決于顆粒的大小以及顆粒與周圍溶液之間的密度差[13-14]。目前常用的細胞密度梯度介質為Ficoll和OncoQuick，前者分離范圍較窄，多用于分離外周血單個核細胞；后者帶有多孔篩，可有效減少白細胞污染。Ficoll和OncoQuick的回收率均約為70%～90%，而OncoQuick減少了捕獲過程中平均紅細胞血紅蛋白含量的消耗[15]，CTC純度較高[16]。此方法操作簡單、成本低，但靈敏度和特異度較低，易混雜其他細胞，也容易造成CTC丟失，出現假陰性，因此一般作為預富集方法。
2.1.2 濾過分離法
此法是基于CTC體積一般大于其他血細胞，CTC的大小為14～26 μm，白細胞為7～20 μm，紅細胞為7～8 μm[17]。濾膜濾法分離上皮源性腫瘤細胞技術是最早的濾過分離技術之一，該技術是使用乙二胺四乙酸緩沖液稀釋過的血液樣本，然后用8 μm孔徑過濾器過濾[18]。CTC由于體積較大保留在過濾器，而紅細胞和白細胞由于體積小于過濾器孔徑可以通過隨機分布的孔。通過細胞體積大小分離原理的濾膜濾法分離上皮源性腫瘤細胞技術和ScreenCell分選系統現已被應用于黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的臨床試驗[19-20]。現有技術將濾膜濾法與微流控芯片結合，可回收細胞或直接在芯片內進行分析研究，提高CTC捕獲率與通量。Clinomics公司開發的FAST[21]允許從全血中快速分離出純度較高的CTC，該裝置由一個帶有8 μm孔的軌跡蝕刻聚碳酸酯膜組成，選擇性地根據細胞大小分離CTC，并且在整個過濾過程中，膜孔填充穩定的液體，以減少堵塞和分離時間（圖1a）。全血樣本可以通過旋轉圓盤在過濾器上分離，從3 mL全血中分離CTC所需的總過濾時間少于1 min。此方法操作簡單，成本低，速度快，不易破壞細胞，然而與密度梯度離心法類似，CTC不易與體積較大的血細胞分離，體積較小的CTC容易被濾過掉，且其通量較低，易發生膜孔堵塞，因此也只作為其他方法的富集前準備方法。
圖1
示CTC分離技術
a：FAST濾過分離法；b：DLD技術；c：渦流捕獲技術；d：超聲波分離法；e：介電泳分離法；f：DPPB方案
2.1.3 流體力學方法
此法主要根據微流控芯片中流體內微粒運動的不同特性來分離細胞，主要有確定性側向位移（deterministic lateral displacement，DLD）、慣性聚焦和渦流捕獲技術3種方法。
2.1.3.1 DLD 技術
此技術是利用微流控通道的層流特性，是基于微流體尺寸差異的分離方法。基于DLD設計的芯片內具有相對于流體流動方向呈一定角度的微柱陣列，尺寸不同的顆粒在流動過程中有不同的運動軌跡[22]（圖1b）。DLD技術可直接用全血樣本在多種條件下有效分離微粒，操作簡單且對細胞存活率影響較小[21-22]。Loutherback等[23]應用呈矩陣排列的三角柱可以從血液中分離CTC，在體積流速高達10 mL/min時捕獲效率>85%，且對細胞活力無影響。DLD技術采用的芯片和材料存在不足，芯片結構為高深寬比，玻璃材料加工難達設計要求，需采用聚二甲基硅氧烷材料，但此是軟性材料，微柱間間隙小，生產時脫模易出錯，芯片成品率低，導致成本高且全血樣本堵塞風險大[24]。
2.1.3.2 慣性聚焦技術
此技術是利用慣性升力和Dean渦流原理實現CTC分離。流體在微通道內運動時產生的慣性升力使懸浮顆粒位移，通道形狀很多，其中螺旋型應用較廣[22]。流體在通道中會產生Dean旋渦，粒子在迪恩力的作用下與慣性升力相互作用，使不同大小的粒子達到不同的平衡位置從而進行分離。Altay等[25]利用了Dean渦流和慣性升力的優點，在特定的彎曲蛇形微通道中開發了一種連續、高通量和可并行的基于尺寸的粒子聚焦技術；還有研究者[26]依據微尺度下的慣性效應設計了一種方形通道芯片，細胞在方形管道中由于Dean渦流與慣性升力共同作用，在管道長邊中點附近產生平衡位點，由于高度依賴于尺寸的慣性升力控制著細胞運動，較大的CTC更快地遷移到其平衡位置，使其他較小的細胞不聚焦并在整個通道橫截面上隨機分布。此技術能連續分離細胞，富集率高且成本低，操作簡單，對細胞損傷小。但若細胞濃度過高時細胞易受相互作用影響，影響細胞聚焦到平衡位置，降低富集純度。因此，需預先去除樣本中紅細胞，且該法對實驗流速敏感，需精確控制流速。
2.1.3.3 渦流捕獲技術
此技術是根據細胞的特性，流體在微尺度通道中膨脹時發生層流旋渦，較大細胞在慣性升力作用下易形成穩定旋渦軌道，較小細胞不能保持穩定軌道而流出芯片（圖1c）。如Vortex HT芯片將血細胞驅動至芯片中連續的長方形室，流體在流室內產生旋渦，大細胞隨著旋渦一直旋轉，小細胞則隨著液體流出；進樣結束后更換緩沖液清洗，CTC仍維持在旋渦中，然后改變流速將CTC釋放出來[27]。該方法富集的CTC純度較高，白細胞污染極少，通量大，可直接對全血處理；但該方法富集率較低（50%左右），且在更換緩沖液過程中芯片內旋渦可能消失而致CTC釋放出來，降低捕獲率。
2.1.4 基于超聲波的富集技術
此技術主要基于懸浮在流體中的粒子在暴露于超聲波中時會受到聲波力作用，通過產生的震蕩壓力分離CTC。細胞受到的震蕩壓力與細胞密度、大小及可壓縮性成正比，它以不同速度和方向流向相應通道[12]（圖1d）。有研究者[28]根據CTC和白細胞體積大小不同，采用微流控電泳芯片富集CTC，在高頻聲波作用下，CTC移向壓力通道中央，而白細胞則移向通道壁側。此方法的優點是對細胞損傷小，靈活性強；但是其缺點是，不能對全血直接處理，需預先去除紅細胞；要提前準備設備，并且要求聲波發射和放大設備的性能穩定，若聲波功率太大產生的熱會損傷細胞。
2.1.5 介電泳技術
電泳是通過帶電粒子上的凈電荷與施加電場間的作用力使帶電粒子運動。中性粒子本身無凈電荷，可通過中性粒子在非均勻電場中的極化作用產生介電泳力，因此，應用介電電泳力可將CTC分離富集。在基于雙向電泳的富集技術中，不同介電常數的細胞在電場中受到的介電電泳力大小與方向不同，可使細胞向相應方向移動（圖1e）。Gascoyne等[29]研究了介電泳場流分級分離方法從臨床血液樣本中分離CTC，此法可利用固有的腫瘤細胞特性，不需標記，細胞捕獲率超過90%，而且還可提供未經修飾的活腫瘤細胞用于培養或所有類型的分子分析。另有研究者[30]采用ApoStream?技術，此技術需先用Ficoll分離法隔離單核細胞，然后使用設備處理，剩余細胞以層流形式通過介電場，當CTC通過電極時，交變電流頻率將CTC從層流中拉到設備底部，而其他血液成分繼續流過。介電泳分離能在大約60 min內從7.5 mL血液中分離出棕黃色涂層中的CTC，回收率高，得到的細胞純度及活性均高且操作簡單，無需依賴CTC表面標志物，但所需設備復雜，與其他方法相比通量較小，仍需進一步提高其富集效率。
2.2 根據生化特性的富集方法
2.2.1 基于表面抗原差異的富集方法
以抗原為基礎的方法是利用CTC與血細胞表面特異性抗原的差異來分離CTC，主要包括免疫磁珠和固載抗體微通道方法。
2.2.1.1 免疫磁珠技術
此法基本原理為：血液中幾乎所有細胞都有抗磁性或弱磁性[31]，故可將在CTC或血細胞表面表達的相關抗原所對應的抗體包被在具有順磁性的磁珠表面，磁珠在外加磁場中通過“磁珠/抗體-抗原/細胞”的方式與目標細胞結合而分離。根據這一原理，可以將免疫磁珠分離法分為陽性分離法和陰性分離法。陽性分離法是利用磁珠與CTC表面抗原結合而直接分離CTC，陰性分離法是通過磁珠與血細胞表面抗原結合而間接分離CTC，如白細胞通過表面的特異性CD45抗原與包被有相應抗體的磁珠結合而分離得到CTC。① 陽性分離法。此法目前已被應用于多種檢測系統，如Veridex公司的CellSearch系統，該系統選擇以大部分腫瘤細胞表面表達的上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗原作為靶點，不但可實現CTC富集，還可完成后續的固定、染色及熒光分析，該系統已被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床檢測CTC，已成為金標準[32]。但是CTC在進展過程中會發生上皮-間質轉化，并且具有上皮-間質轉化表型的CTC通常侵襲性高[33]，而且發生上皮-間質轉化的CTC表面的EpCAM會低表達甚至不表達，因而會導致結果呈現假陰性[34]，同時細胞在磁場中極易發生聚集，在分離與磁珠結合的細胞過程中可能影響細胞活性，導致無法進行后續檢測分析。因此，尋找CTC特異性抗原以及聯合其他生物標志物是未來CTC分離富集方法的重要研究方向。② 陰性分離法。此方法雖然可以有效解決漏檢的問題，但分離得到的CTC中易混有低表達血細胞抗原的非CTC細胞，富集CTC純度不佳。最常采用的是通過抗CD45抗體與磁珠結合以去除白細胞，如EasySep技術[35]使用磁場來保留白細胞，而生成的上清液保留了不表達CD45的CTC異質群體。該方法可實現不依賴CTC表面標志物。然而由于血液中CTC數量少，負性分離過程可能由于CTC被大量血細胞包裹，從而使它在分離過程中易丟失，導致回收率較低。目前，還有許多可替代的免疫磁性捕獲方法，如磁性細胞分選系統[36]、磁鐵清掃裝置[37]、Strep標記系統[38]、磁細胞離心機平臺[39]、在捕獲或釋放機制方面與CellSearch不同的仿生免疫磁小體[40]等，這些方法的分離純度更高，然而CellSearch平臺仍然是免疫磁性CTC捕獲領域的領導者[41]。
2.2.1.2 固載抗體微通道技術
此法是將細胞表面抗原對應的抗體固載于芯片的通道內壁，檢測樣本流過通道時，可以通過免疫親和作用使目標細胞表面抗原與通道內壁的抗體結合后去除雜質，然后可得到CTC。Stott等[42]通過在一種“人”字形HB芯片通道表面增添“人”字形微導管，當流體通過時可產生側向二次流，引起的渦流增加抗體包被的裝置表面與細胞相互作用次數，提高對CTC的捕獲率，HB芯片在污染白細胞中捕獲的加標癌細胞的純度為（14.0±0.1）%，而CTC芯片為（9.2±0.1）%。該方法的優點是富集過程高度自動化，操作簡單，且能實現對富集CTCs直接染色觀察，但其缺點是微通道易阻塞，不利于高通量檢測。
總之，基于細胞表面抗原的富集方法特異性較高，CTC富集常采用此法，但其局限性為重復性差、保存期短、成本高、靈敏度不佳等，仍需繼續研究并克服這些不足。
2.2.2 基于表面配體差異的富集方法
適配體可以識別并特異性地結合靶細胞。Song等[43]應用多價核酸適配體納米微球修飾的芯片對樣本進行分離，通過核酸適配體多價效應可大大增強CTC與適配體間的親和力，從而顯著提高捕獲效率，其白細胞去除率可高達99.99%，且大多數（95.8%）釋放的CTC仍能存活。與基于抗體的富集方法相似，基于適配體的富集法也可分為陽性和陰性分離法，具有親和力高、可重復、保質期長等優點，但適配體往往價格高且用量大，因而技術成本較高。
2.2.3 基于生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統的富集方法
生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統是自然界已知的最強非共價相互作用之一，現有配體的親和性幾乎都無法超過該系統[44]。基于此，Chen等[45]建立了DNA酶催化近端蛋白生物素化（DNAzyme-catalyzed proximal protein biotinylation，DPPB）方案（圖1f），利用一種工程化的DNA基人工酶，誘導共價沉積在CTC膜上的生物素，此方案通過增加生物素的數量和細胞表面共價與非共價相互作用的比例，使CTC與磁珠的結合增強，通過此方案富集得到的高表達EpCAM和低表達EpCAM的CTC捕獲效率分別為92.2%和81.3%，較傳統方法（分別為69.6%和38.8%）提高，避免了普通免疫磁珠技術造成的低表達EpCAM亞群缺失，且DPPB基濃縮后CTC的純度有所提高，高表達EpCAM細胞的CTC純度提高了769倍，低表達EpCAM細胞的CTC純度提高了270倍。
2.3 多種原理聯合的富集方法
前面介紹的根據物理特性和生化特性的富集方法各有利弊（表1）。因此，探討將多種方法在同一設備中組合應用，從而提高CTC分離富集的純度與效率，以彌補單一方法的局限性。近年來，對微流控芯片的研究進展迅速，其原理可分為生物親和法與物理篩選法，生物親和法主要依賴抗原抗體或配體與適配體的特異性結合，選擇性高但捕獲率低，往往影響細胞活性；物理篩選法主要依賴細胞間物理性質差異，通過外加物理場誘導分離，操作簡單，不破壞細胞，但分離純度較低。利用微流控芯片的集成優勢，可將這兩種方法結合或與其他方法聯合使用，可以達到更好的分離富集效果。例如，為解決CTC低表達EpCAM抗原導致捕獲率低的問題，Wu等[46]在聚乳酸-羥基乙酸共聚物纖維化基底上同時修飾EpCAM和N-鈣黏蛋白適配體，實驗表明，可在確保捕獲到EpCAM正常表達的CTC的同時，減少對EpCAM低表達CTC的遺漏，減少了假陰性結果。Chen等[47]開發了一種橫向過濾陣列微流體設備，利用側向微柱陣列結構的芯片，在微柱上修飾EpCAM抗體，將基于尺寸的分離與基于免疫親和性的CTC分離相結合，CTC的捕獲效率可達（98.7±1.2）%，同時可保證較大通量。CTC-iChip[48]是使用了多種方法組合的新型芯片，首先將血液樣本用免疫磁珠技術陽性或陰性分離，其次利用DLD將有核細胞與紅細胞和血小板分離，然后細胞通過一個應用慣性聚焦方法排列在一條接近單一的管線中的微流控通道，細胞通過磁場進行最終富集。CTC-iChip的富集靈敏度較高，分離時需要磁力較低，從而提高了細胞收集量和細胞純度回收率[49]，具有高通量（每小時可處理8 mL血液）、高回收率的特點，而且富集得到的細胞活力較高，有利于進一步分析培養。我國歐洋等[50]報道根據“物理方法捕獲，形態方法鑒定，免疫方法識別”的方案研發出具有自主知識產權的CTC檢測設備——CTC-Biopsy檢測系統及其配套診斷試劑，已應用于肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、結直腸癌和腎癌的臨床研究，在此６種癌中對肝癌的靈敏度最高（77.8%），食管癌的靈敏度最低（42.86%）。
表1
示不同CTC富集方法的對比
3 總結與展望
CTC用于惡性腫瘤及肝癌患者早期診斷、分期、分層診療依據及療效監控的意義已得到醫學界的肯定。利用CTC檢測進行肝癌診斷及預后判斷往往需要兩步：即CTC分離富集和分析檢測。目前正在研究開發的CTC分離富集技術繁多，但各種技術均存在一定缺陷，仍有問題亟需解決，如：① 物理篩選法雖然通量高、不依賴生物標志物、細胞活力影響小，但捕獲率低；生物親和法純度和捕獲率較高但通量小且易損傷細胞。因此，如何通過將多種方法結合以實現高效的CTC富集仍需深入研究。② 生物親和法中靈敏度和特異度均較高的靶點選擇仍存在較大問題，尚需大量研究驗證現有靶點的有效性。③ 由于CTC本身的異質性及它在血行播散過程中發生上皮-間質轉換，現有技術尚不足以篩選出外周血中所有類型CTC，因此，在進行技術改進的同時進一步對CTC多種亞型深入認識十分重要。④ CTC易脫落并進入外周血液循環系統且在循環系統中半衰期較短，目前對CTC轉移規律研究不足，缺少證據表明最佳CTC檢測時間及檢測周期。⑤ 對于不同類型癌使用不同分離富集方法的結果不同，難以對各種方法進行系統評估和比較。⑥ 目前尚無對富集方法選擇及檢測結果解讀的統一標準，還需進行大量臨床研究以實現現有檢測方法的標準化。雖然還有許多問題要解決，但已有大量研究正在進行且已取得一些成果。因各種方法尚有其局限性而在肝癌中的臨床應用較少。相信在技術持續改進下，許多問題將會逐一解決，有望使CTC檢測能真正應用于臨床且與其他技術聯合，為肝癌患者提供更高效的診斷與治療方法指日可待。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：霍晨鈺查閱參考文獻與撰寫文稿；蔣利指導論文撰寫及控制文章質量。
