引用本文： 賈一帆, 鄧文宏, 邱振東, 徐勝. 槐耳提取物劑量依賴誘導結直腸癌細胞SW620鐵死亡及抑制其生物學行為. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(2): 185-191. doi: 10.7507/1007-9424.202208064 復制
腫瘤耐藥仍為結直腸癌（colorectal cancer，CRC）臨床治療的難點，研究人員針對腫瘤耐藥或增強腫瘤的藥物敏感性正在研發新藥或探索新的用藥方案，逐漸關注天然提取物的生物學作用及它在腫瘤領域的臨床應用價值。中藥槐耳的主要成分是多糖蛋白，槐耳多糖成分可以增強機體免疫力和具有抗腫瘤的作用[1]，它通過影響腫瘤細胞的增殖[2]、凋亡[3-4]、藥物敏感性[5-6]、自噬[2]等方面達到抗腫瘤效果，已在肺癌[7]、乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、CRC[10]等多種癌癥中得以驗證，具有效果顯著、作用持久、不良反應少的特點。近年來有研究發現，中藥與化學藥物聯合使用可通過誘導鐵死亡治療腫瘤，可降低化學藥物對人體的毒副作用，增強腫瘤的化學藥物治療（簡稱“化療”）的敏感性。鐵死亡是一種由鐵依賴性磷脂過氧化驅動的獨特細胞死亡方式，它受多種途徑調節，包括鐵代謝、氧化還原穩態及脂質代謝。因此，通過誘導和抑制鐵死亡的藥理學調節在治療耐藥性腫瘤方面具有巨大潛力[11]。目前已有諸多證據表明，中藥提取物不僅能通過鐵死亡有效抑制CRC細胞的生物學行為[12]，還能與化學藥物聯合應用增強CRC的化療敏感性[13]。然而槐耳是否通過鐵死亡參與CRC的抗腫瘤作用的相關研究較少。本課題小組成員通過系列研究，探討槐耳能否通過誘導CRC細胞的鐵死亡抑制CRC的生物學行為，初步評估槐耳在CRC鐵死亡機制中的研究價值，旨在為CRC治療提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 主要材料
SW620細胞系，獲贈于武漢大學人民醫院胃腸外科2科，購買于中國典型培養物保藏中心。槐耳顆粒，江蘇啟東蓋天力藥業有限公司。高糖Dulbecco’s改良Eagle培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）基礎培養基，貨號G4510，武漢塞維爾生物科技有限公司。完全培養基成分為高糖DMEM基礎培養基、10%胎牛血清（貨號mu001SR，武漢青木生物技術有限公司）、1%三抗（貨號BL142A，武漢愛博泰克生物科技有限公司）。基質膠，貨號356234，美國BD Biosciences。抗體：谷胱甘肽過氧化酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），貨號A1933，武漢愛博泰克生物科技有限公司；核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2），貨號16396-1-AP，美國Proteintech；高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB1），貨號GB11103，武漢塞維爾生物科技有限公司。辣根過氧化物酶二抗兔抗，貨號G1213，武漢塞維爾生物科技有限公司。化學發光底物超敏顯影液，貨號SQ201，上海雅酶生物醫藥科技有限公司。放射免疫沉淀法緩沖液裂解液提取蛋白，貨號G2002，武漢塞維爾生物科技有限公司。丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒，貨號BC0025，北京索萊寶科技有限公司；細胞計數試劑8（cell counting kit 8，CCK8），貨號BS350B，武漢愛博泰克生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒，貨號S0033S，武漢碧云天生物技術有限公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒，貨號A006-2-1，南京建成科技有限公司。
1.2 細胞選擇
在CRC的研究[14-15]中，SW620被認為是高度惡性的CRC細胞系，因此本研究選擇SW620細胞系進行體外實驗。
1.3 槐耳濃度選擇
每次稱取1 g槐耳顆粒溶解于無菌的5 mL高糖DMEM基礎培養基，于37 ℃水浴鍋中充分溶解后3 000 r/min離心10 min，離心后取上清，于0.22 μm的針式濾器過濾2次，濾過的透明溶液作為初始槐耳貯存液（200 mg/mL），于4 ℃避光保存，7 d內使用。參考既往文獻[16-17]，槐耳提取物實驗常用濃度為5和10 mg/mL，于是本課題在藥物毒性實驗中以這2個濃度為基準，采用CCK8檢測不同濃度梯度下的CRC細胞增殖情況，以進行實驗劑量探討。于96孔板，每孔接種約5 000個細胞，次日觀察細胞融合度為60%～70%后分別加入0、5、10、20及50 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液干預24 h后孔板換液，每孔加入10 μL CCK8與100 mL高糖DMEM基礎培養基，輕微振蕩混勻后避光孵育1～2 h，于酶標儀450 mm波長檢測不同濃度槐耳提取物溶液下的CRC細胞增殖情況，在5、10 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液干預24 h時檢測發現CRC的增殖抑制效果有限（圖1a），于是延長時間以及調整給藥濃度，設置0、10及20 mg/mL 3個濃度的槐耳提取物溶液，分別于干預24 h和48 h時檢測CRC的增殖情況，24 h時10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液能小幅度抑制CRC細胞增殖，且10 mg/mL濃度時對細胞抑制率相較于0 mg/mL未見差異有統計學意義（圖1b）；在48 h時10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液均能明顯抑制CRC細胞增殖，在40倍倒置顯微鏡下見加藥后細胞融合度明顯下降、胞內空泡增加、細胞邊緣明顯變亮（圖1c）。因此，后續實驗的用藥方案為10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞后48 h，觀察各實驗結果。
圖1
示槐耳劑量探索及它對CRC細胞形態的影響
a：0、5、10、20及50 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞24 h時CCK8檢測的細胞存活率；b：0、10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞24 h和48 h時CCK8檢測的細胞存活率；c：0、10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞48 h時的細胞明場（ ×40）及其放大圖。各組
1.4 實驗方法
1.4.1 細胞侵襲和遷移實驗
采用Transwell實驗和細胞劃痕實驗檢測。① Transwell實驗。基質膠于冰上解凍，耗材低溫環境操作，基質膠∶高糖DMEM基礎培養基按1∶8稀釋，取70～100 μL基質膠稀釋液均勻滴在小室上層，輕輕晃動，使它分布均勻后于37 ℃培養基固定4 h后種植細胞。上室為200 μL完全培養基重懸的細胞懸液（約50 000個細胞），下室為600 μL的高糖DMEM基礎培養基。48 h后取出小室，4%多聚甲醛固定后用結晶紫染色，于倒置顯微鏡明場下拍照，每個濃度重復3～5個視野，用Image J軟件計數穿過小室的細胞后取平均值。② 細胞劃痕實驗。細胞接種于6孔板，當細胞融合達到95%以上時加入槐耳提取物溶液處理24 h（時間點選取為24 h而不是48 h的原因為，48 h時的對照組即0 mg/mL濃度的劃痕早已被細胞填滿），用10 μL槍頭在孔板的細胞生長面輕輕劃直線。劃痕結果采用面積檢測方法（劃痕距離測量為等效測量），劃痕寬度平均值=劃痕空隙面積/長度，細胞遷移率=（0 h劃痕寬度–培養后劃痕寬度）/ 0 h 劃痕寬度×100%。
1.4.2 氧化應激負荷
① ROS檢測。SW620細胞接種于6孔板，當細胞融合度為60%左右時加入槐耳提取物溶液處理48 h。磷酸鹽緩沖液洗2次后樣本為貼壁細胞，根據ROS試劑盒說明書配制ROS熒光探針2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）工作液，每孔加1 mL DCFH-DA工作液，于37 ℃細胞培養箱孵育40 min，高糖DMEM基礎培養基洗2次后收集細胞于流式細胞儀上機檢測2',7'-二氯熒光素（2',7'-dichlorofluorescein，DCF）的熒光，曲線下面積與細胞數的比值，即每個細胞的平均熒光強度，由流式細胞儀自帶的軟件自動呈現。② GSH檢測。將0、10、20 mg/mL濃度槐耳提取物溶液處理48 h時的細胞收集后以超聲研磨破碎細胞，將破碎后的細胞懸液與試劑一1∶1混合，3 500 r/min離心10 min取上清，根據試劑盒方案配制上樣孔試劑，混勻靜置5 min后于酶標儀405 nm處檢測各孔吸光度值。③ MDA檢測。細胞接種于6孔板，當細胞融合度為60%左右時加入槐耳提取物溶液處理48 h。磷酸鹽緩沖液洗2次后，每孔加入0.5 mL MDA試劑盒中的裂解液收集細胞，裂解細胞取上清。碧云天二奎啉甲酸試劑盒檢測每組樣品的蛋白濃度，根據說明書的反應體系加到1.5 mL離心管中，給離心管打一小孔，100 ℃水浴60 min，然后迅速冰上冷卻，常溫離心（10 000 g）10 min，取上清加入96孔板，于酶標儀檢測450 nm、532 nm、600 nm處吸光度值。
1.4.3 Western blot法檢測鐵死亡關鍵蛋白GPX4、NRF2、HMGB1的表達
中皿接種60×104個細胞，12 h細胞貼壁后用不同濃度（0、10、20 mg/mL）槐耳提取物溶液處理48 h，放射免疫沉淀法緩沖液裂解液提取蛋白5∶1加入上樣緩沖液（貨號G3011，武漢塞維爾生物科技有限公司）。蛋白樣本220 V電泳40 min后200 mA電轉90 min，脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗GPX4、NRF2、HMGB1孵育過夜，Tubulin-β作為內參。次日辣根過氧化物二抗兔抗孵育1 h后，使用化學發光底物超敏顯影液于伯樂顯影儀觀察結果。
1.5 統計學方法
采用SPSS 26.0統計軟件對實驗數據進行分析，對符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（
±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，多組間與對照組比較采用Dunnett-t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞侵襲遷移實驗結果
Transwell實驗檢測10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液干預 SW620細胞48 h時的結果發現，它能有效抑制 SW620細胞的侵襲能力（F=480.0，P<0.001），見圖2a、2b；細胞劃痕實驗結果中也呈現出相同的趨勢（F=24.3，P=0.001），見圖2c～2e。
圖2
示0、10、20 mg/mL濃度槐耳提取物溶液處理CRC細胞后的細胞侵襲遷移實驗結果
a、b：Transwell實驗檢測不同濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞48 h時的細胞侵襲能力的定性（a，結晶紫染色 ×200）及定量（b）結果；c～e：劃痕實驗檢測不同濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞0 h（c）和24 h（d）時的細胞遷移能力的鏡下觀察結果（ ×40）及定量（e）結果。各組
2.2 氧化應激負荷檢測結果
流式細胞儀檢測結果（圖3a～3d）發現，以10、20 mg/mL濃度槐耳提取物溶液處理細胞48 h時氧化應激水平升高且呈劑量依賴關系（F=806.3，P<0.001）。GSH檢測結果（圖3e）顯示，以10、20 mg/mL濃度槐耳提取物溶液處理細胞48 h時GSH水平降低且呈劑量依賴關系（F=35.0，P=0.005）。但在MDA檢測結果中發現，10 mg/mL濃度組的MDA水平最高（F=22.9，P=0.002），見圖3f。
圖3
示不同濃度（0、10、20 mg/mL）槐耳提取物溶液處理SW620細胞48 h時的氧化應激負荷檢測結果
a～d：ROS水平；e：GSH水平；f：MDA水平。各組
2.3 鐵死亡關鍵蛋白的表達結果
Western blot法檢測鐵死亡關鍵蛋白的定性結果見圖4a，半定量結果見圖4b～4d。實驗濃度（10、20 mg/mL）的槐耳提取物溶液干預48 h均能有效下調GPX4（F=74.2，P<0.001）、NRF2（F=32.8，P=0.001）和HMGB1（F=55.1，P<0.001）蛋白的表達且呈劑量依賴關系。
圖4
示Western blot法檢測槐耳提取物溶液干預后48 h時鐵死亡關鍵蛋白的表達結果
a：定性結果；b～d：GPX4（b）、NRF2（c）、HMGB1（d）蛋白半定量結果，實驗重復 3 次（與0 mg/mL濃度比較，*
3 討論
在抗腫瘤藥物開發領域，天然藥物依舊是研究的熱點，天然藥物特性與合成藥物相比，更具臨床親和性，臨床試驗與推廣的安全性也相對較高。天然藥物如中藥，能增強人體的固有免疫和適應性免疫[18]；多種生物堿如長春堿[19]、紫杉醇[20]、喜樹堿[21]等已在臨床腫瘤用藥中發揮重要作用。中藥槐耳在我國民間是重要藥用真菌，又名為槐栓菌，它在消化系統腫瘤中作用的研究較多，但槐耳與CRC關系的研究較少。Zou等[22]在體外實驗中驗證了槐耳對HCT116、HCT8細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，且在小鼠的結腸炎相關CRC模型中發現槐耳能減輕結腸損傷與腫瘤負荷。2021年一項納入340例患者的隊列研究[23]表明，槐耳顆粒可預防早期肝細胞癌熱消融術后復發。一項較早（2013年）的體外研究[24]報道，槐耳水提物能通過調控CRC細胞的Wnt/β-catenin通路，從而抑制其腫瘤成球能力以及相關腫瘤干細胞標志物的水平。近幾年相繼有槐耳與CRC信號通路的研究，如鄒一豐等[25]發現槐耳清膏可通過Bcl-2/Bax/Cleaved caspase-3凋亡相關信號通路誘導SW480細胞凋亡；謝海娟等[26]發現槐耳浸膏通過調控ROS/核因子-κB信號通路抑制基質金屬蛋白酶-9的表達、阻斷了佛波酯誘導的SW480細胞的侵襲。在腫瘤領域，槐耳與細胞死亡的研究目前以凋亡、自噬為主，也有涉及較新的焦亡研究[27-28]。鐵死亡與自噬、氧化應激相關，因此，通過鐵死亡研究槐耳對CRC的作用機制，是一種對既往槐耳研究的總結，也是一種研究方向的過渡，進而邁向新的研究領域，而且緊跟當前的研究熱點。
鐵死亡的主要機制為脂質過氧化，本研究初步探究的ROS結果與文獻報道的結果有所出入。腫瘤的藥物治療研究中大多認為槐耳能減輕ROS從而降低藥物的毒副作用[29]，而且在CRC的研究中表明槐耳能減輕SW480細胞的ROS水平[26]。通過對比分析數據，結果的差異可能來源于槐耳的用量及細胞模型的不同，如在研究SW480細胞的研究[26]中，槐耳的劑量濃度為5 mg/mL，而本研究的最小劑量為10 mg/mL，由于ROS在目前的研究中被認為是生理與病理中的雙刃劍，過低或過高都會對機體產生不利影響，保持氧化還原的穩態才是研究ROS的最終目的；再從ROS的流式細胞檢測結果來對比，本研究的槐耳濃度劑量提高了1～2倍，ROS水平卻增加了5～10倍，可見高濃度的槐耳提取物溶液能打破氧化應激的平衡穩態，但這種高濃度對于機體產生的不利影響在體內外研究中均無充分的驗證，本研究發現這種高濃度的槐耳能劑量依賴誘導CRC細胞的鐵死亡，為誘導鐵死亡化學藥物的有效用量提出參考，可作為高濃度槐耳用量的有利證據之一。此外，SW620細胞與SW480細胞為同源的CRC細胞系，但SW620細胞的惡性程度更高，也可能為造成結果有差異的原因之一。因此，槐耳劑量的有效性與安全性仍需進一步的探討。
目前認為鐵死亡主要由三大系統調控，即（半）胱氨酸/GSH/GPX4軸、還原型輔酶Ⅰ（Ⅱ）/鐵死亡抑制蛋白1/泛醌、磷酸環水解酶/四氫生物蝶呤/二氫葉酸還原酶系統，其中（半）胱氨酸/GSH/GPX4軸為最經典的系統。GPX4是一種硒蛋白，其生物合成依賴于硒代半胱氨酸的共翻譯整合機制，為經典系統中的關鍵調控因子。轉錄因子NRF2是細胞抗氧化反應的主要調節因子，其信號通路是癌進展、轉移和治療抗性的驅動因素。有研究[30]發現，NRF2的靶基因二氫二醇脫氫酶1和GPX4以及參與GSH和還原型輔酶Ⅱ合成的基因，參與引發鐵死亡的脂質過氧化，揭示了氧化還原穩態與鐵信號傳導的相互作用。此外，選擇性自噬的過度激活，通過降解鐵蛋白、脂滴、晝夜節律蛋白和GPX4促進鐵死亡，HMGB1為自噬調節劑，也能作為信號傳導因子參與細胞的鐵死亡[31]。本研究采用Western blot法檢測這3種蛋白，為初步驗證槐耳對鐵死亡經典GPX4途徑的影響，結果顯示，10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物能有效誘導SW620細胞的鐵死亡，且對GPX4經典途徑影響較大；此外，研究還發現，高濃度（20 mg/mL）槐耳提取物的MDA水平不增反降，對該現象的原因分析，一方面可能是細胞不可修復的失代償狀態，MDA大量積累對細胞膜造成不可逆損害以致釋放到胞外，細胞自身狀態無法對抗氧化應激而生成MDA，最終導致胞內總MDA水平不高；另一方面也可能是細胞應對外源性過氧化物的一種抗氧化保護機制，因為相較于ROS，MDA含量反映機體潛在的抗氧化能力。此結果提示，槐耳在一定濃度范圍內能誘導SW620細胞的鐵死亡，若濃度超過了該濃度范圍即對鐵死亡的誘導無有效增益，此結果可能對臨床治療有一定的參考價值，如在對CRC患者使用誘導鐵死亡的化療時，可以個性化計算患者用藥的劑量范圍，超過此范圍值就不能通過該途徑產生抗癌作用，及時調整用藥劑量，既能有效節省醫藥成本，又能降低藥物過量的副作用。
本研究仍存在諸多改進的空間，如細胞形態在高倍鏡下的特征，由于SW620細胞增殖較為迅速，而且相較于其他CRC細胞系，其接觸抑制較小以致于容易疊起來生長，因此，應繼續摸索條件，使它在未加藥（0 mg/mL濃度）與加藥狀態下均能區分為單個細胞，以便觀察細胞形態變化的細節；再比如藥物濃度的探究也需細化，在維持鐵死亡劑量依賴這一現象的同時，確保體內外實驗的均一性，而且目前的結果較多停留在現象層面，機制探究也較為表淺，本研究中Western blot檢測GPX4、NRF2、HMGB1這3個指標的證據均指向于經典的GPX4鐵死亡通路，因此，后續的研究將細化其中的機制并探討與其他幾個鐵死亡系統的可能聯系，然后在體內試驗中進一步驗證。與之相比，MDA結果所展現出來的異常趨勢也體現本課題的延續性，今后將完善實驗設計探索其中的可能機制。此外，為驗證槐耳提取物的臨床研究意義，本課題組接下來的實驗將探究槐耳提取物溶液在CRC腫瘤耐藥中的作用，旨在為CRC的中藥提取物與化學藥物的聯合用藥提供新的思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：徐勝為課題提出者、總指導；鄧文宏為經費提供人員并給予技術指導；賈一帆、邱振東負責實驗操作、文章撰寫及修改。
腫瘤耐藥仍為結直腸癌（colorectal cancer，CRC）臨床治療的難點，研究人員針對腫瘤耐藥或增強腫瘤的藥物敏感性正在研發新藥或探索新的用藥方案，逐漸關注天然提取物的生物學作用及它在腫瘤領域的臨床應用價值。中藥槐耳的主要成分是多糖蛋白，槐耳多糖成分可以增強機體免疫力和具有抗腫瘤的作用[1]，它通過影響腫瘤細胞的增殖[2]、凋亡[3-4]、藥物敏感性[5-6]、自噬[2]等方面達到抗腫瘤效果，已在肺癌[7]、乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、CRC[10]等多種癌癥中得以驗證，具有效果顯著、作用持久、不良反應少的特點。近年來有研究發現，中藥與化學藥物聯合使用可通過誘導鐵死亡治療腫瘤，可降低化學藥物對人體的毒副作用，增強腫瘤的化學藥物治療（簡稱“化療”）的敏感性。鐵死亡是一種由鐵依賴性磷脂過氧化驅動的獨特細胞死亡方式，它受多種途徑調節，包括鐵代謝、氧化還原穩態及脂質代謝。因此，通過誘導和抑制鐵死亡的藥理學調節在治療耐藥性腫瘤方面具有巨大潛力[11]。目前已有諸多證據表明，中藥提取物不僅能通過鐵死亡有效抑制CRC細胞的生物學行為[12]，還能與化學藥物聯合應用增強CRC的化療敏感性[13]。然而槐耳是否通過鐵死亡參與CRC的抗腫瘤作用的相關研究較少。本課題小組成員通過系列研究，探討槐耳能否通過誘導CRC細胞的鐵死亡抑制CRC的生物學行為，初步評估槐耳在CRC鐵死亡機制中的研究價值，旨在為CRC治療提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 主要材料
SW620細胞系，獲贈于武漢大學人民醫院胃腸外科2科，購買于中國典型培養物保藏中心。槐耳顆粒，江蘇啟東蓋天力藥業有限公司。高糖Dulbecco’s改良Eagle培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）基礎培養基，貨號G4510，武漢塞維爾生物科技有限公司。完全培養基成分為高糖DMEM基礎培養基、10%胎牛血清（貨號mu001SR，武漢青木生物技術有限公司）、1%三抗（貨號BL142A，武漢愛博泰克生物科技有限公司）。基質膠，貨號356234，美國BD Biosciences。抗體：谷胱甘肽過氧化酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），貨號A1933，武漢愛博泰克生物科技有限公司；核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2），貨號16396-1-AP，美國Proteintech；高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB1），貨號GB11103，武漢塞維爾生物科技有限公司。辣根過氧化物酶二抗兔抗，貨號G1213，武漢塞維爾生物科技有限公司。化學發光底物超敏顯影液，貨號SQ201，上海雅酶生物醫藥科技有限公司。放射免疫沉淀法緩沖液裂解液提取蛋白，貨號G2002，武漢塞維爾生物科技有限公司。丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒，貨號BC0025，北京索萊寶科技有限公司；細胞計數試劑8（cell counting kit 8，CCK8），貨號BS350B，武漢愛博泰克生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒，貨號S0033S，武漢碧云天生物技術有限公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒，貨號A006-2-1，南京建成科技有限公司。
1.2 細胞選擇
在CRC的研究[14-15]中，SW620被認為是高度惡性的CRC細胞系，因此本研究選擇SW620細胞系進行體外實驗。
1.3 槐耳濃度選擇
每次稱取1 g槐耳顆粒溶解于無菌的5 mL高糖DMEM基礎培養基，于37 ℃水浴鍋中充分溶解后3 000 r/min離心10 min，離心后取上清，于0.22 μm的針式濾器過濾2次，濾過的透明溶液作為初始槐耳貯存液（200 mg/mL），于4 ℃避光保存，7 d內使用。參考既往文獻[16-17]，槐耳提取物實驗常用濃度為5和10 mg/mL，于是本課題在藥物毒性實驗中以這2個濃度為基準，采用CCK8檢測不同濃度梯度下的CRC細胞增殖情況，以進行實驗劑量探討。于96孔板，每孔接種約5 000個細胞，次日觀察細胞融合度為60%～70%后分別加入0、5、10、20及50 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液干預24 h后孔板換液，每孔加入10 μL CCK8與100 mL高糖DMEM基礎培養基，輕微振蕩混勻后避光孵育1～2 h，于酶標儀450 mm波長檢測不同濃度槐耳提取物溶液下的CRC細胞增殖情況，在5、10 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液干預24 h時檢測發現CRC的增殖抑制效果有限（圖1a），于是延長時間以及調整給藥濃度，設置0、10及20 mg/mL 3個濃度的槐耳提取物溶液，分別于干預24 h和48 h時檢測CRC的增殖情況，24 h時10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液能小幅度抑制CRC細胞增殖，且10 mg/mL濃度時對細胞抑制率相較于0 mg/mL未見差異有統計學意義（圖1b）；在48 h時10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液均能明顯抑制CRC細胞增殖，在40倍倒置顯微鏡下見加藥后細胞融合度明顯下降、胞內空泡增加、細胞邊緣明顯變亮（圖1c）。因此，后續實驗的用藥方案為10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞后48 h，觀察各實驗結果。
圖1
示槐耳劑量探索及它對CRC細胞形態的影響
a：0、5、10、20及50 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞24 h時CCK8檢測的細胞存活率；b：0、10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞24 h和48 h時CCK8檢測的細胞存活率；c：0、10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞48 h時的細胞明場（ ×40）及其放大圖。各組
1.4 實驗方法
1.4.1 細胞侵襲和遷移實驗
采用Transwell實驗和細胞劃痕實驗檢測。① Transwell實驗。基質膠于冰上解凍，耗材低溫環境操作，基質膠∶高糖DMEM基礎培養基按1∶8稀釋，取70～100 μL基質膠稀釋液均勻滴在小室上層，輕輕晃動，使它分布均勻后于37 ℃培養基固定4 h后種植細胞。上室為200 μL完全培養基重懸的細胞懸液（約50 000個細胞），下室為600 μL的高糖DMEM基礎培養基。48 h后取出小室，4%多聚甲醛固定后用結晶紫染色，于倒置顯微鏡明場下拍照，每個濃度重復3～5個視野，用Image J軟件計數穿過小室的細胞后取平均值。② 細胞劃痕實驗。細胞接種于6孔板，當細胞融合達到95%以上時加入槐耳提取物溶液處理24 h（時間點選取為24 h而不是48 h的原因為，48 h時的對照組即0 mg/mL濃度的劃痕早已被細胞填滿），用10 μL槍頭在孔板的細胞生長面輕輕劃直線。劃痕結果采用面積檢測方法（劃痕距離測量為等效測量），劃痕寬度平均值=劃痕空隙面積/長度，細胞遷移率=（0 h劃痕寬度–培養后劃痕寬度）/ 0 h 劃痕寬度×100%。
1.4.2 氧化應激負荷
① ROS檢測。SW620細胞接種于6孔板，當細胞融合度為60%左右時加入槐耳提取物溶液處理48 h。磷酸鹽緩沖液洗2次后樣本為貼壁細胞，根據ROS試劑盒說明書配制ROS熒光探針2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）工作液，每孔加1 mL DCFH-DA工作液，于37 ℃細胞培養箱孵育40 min，高糖DMEM基礎培養基洗2次后收集細胞于流式細胞儀上機檢測2',7'-二氯熒光素（2',7'-dichlorofluorescein，DCF）的熒光，曲線下面積與細胞數的比值，即每個細胞的平均熒光強度，由流式細胞儀自帶的軟件自動呈現。② GSH檢測。將0、10、20 mg/mL濃度槐耳提取物溶液處理48 h時的細胞收集后以超聲研磨破碎細胞，將破碎后的細胞懸液與試劑一1∶1混合，3 500 r/min離心10 min取上清，根據試劑盒方案配制上樣孔試劑，混勻靜置5 min后于酶標儀405 nm處檢測各孔吸光度值。③ MDA檢測。細胞接種于6孔板，當細胞融合度為60%左右時加入槐耳提取物溶液處理48 h。磷酸鹽緩沖液洗2次后，每孔加入0.5 mL MDA試劑盒中的裂解液收集細胞，裂解細胞取上清。碧云天二奎啉甲酸試劑盒檢測每組樣品的蛋白濃度，根據說明書的反應體系加到1.5 mL離心管中，給離心管打一小孔，100 ℃水浴60 min，然后迅速冰上冷卻，常溫離心（10 000 g）10 min，取上清加入96孔板，于酶標儀檢測450 nm、532 nm、600 nm處吸光度值。
1.4.3 Western blot法檢測鐵死亡關鍵蛋白GPX4、NRF2、HMGB1的表達
中皿接種60×104個細胞，12 h細胞貼壁后用不同濃度（0、10、20 mg/mL）槐耳提取物溶液處理48 h，放射免疫沉淀法緩沖液裂解液提取蛋白5∶1加入上樣緩沖液（貨號G3011，武漢塞維爾生物科技有限公司）。蛋白樣本220 V電泳40 min后200 mA電轉90 min，脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗GPX4、NRF2、HMGB1孵育過夜，Tubulin-β作為內參。次日辣根過氧化物二抗兔抗孵育1 h后，使用化學發光底物超敏顯影液于伯樂顯影儀觀察結果。
1.5 統計學方法
采用SPSS 26.0統計軟件對實驗數據進行分析，對符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，多組間與對照組比較采用Dunnett-t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞侵襲遷移實驗結果
Transwell實驗檢測10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物溶液干預 SW620細胞48 h時的結果發現，它能有效抑制 SW620細胞的侵襲能力（F=480.0，P<0.001），見圖2a、2b；細胞劃痕實驗結果中也呈現出相同的趨勢（F=24.3，P=0.001），見圖2c～2e。
圖2
示0、10、20 mg/mL濃度槐耳提取物溶液處理CRC細胞后的細胞侵襲遷移實驗結果
a、b：Transwell實驗檢測不同濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞48 h時的細胞侵襲能力的定性（a，結晶紫染色 ×200）及定量（b）結果；c～e：劃痕實驗檢測不同濃度的槐耳提取物溶液處理SW620細胞0 h（c）和24 h（d）時的細胞遷移能力的鏡下觀察結果（ ×40）及定量（e）結果。各組
2.2 氧化應激負荷檢測結果
流式細胞儀檢測結果（圖3a～3d）發現，以10、20 mg/mL濃度槐耳提取物溶液處理細胞48 h時氧化應激水平升高且呈劑量依賴關系（F=806.3，P<0.001）。GSH檢測結果（圖3e）顯示，以10、20 mg/mL濃度槐耳提取物溶液處理細胞48 h時GSH水平降低且呈劑量依賴關系（F=35.0，P=0.005）。但在MDA檢測結果中發現，10 mg/mL濃度組的MDA水平最高（F=22.9，P=0.002），見圖3f。
圖3
示不同濃度（0、10、20 mg/mL）槐耳提取物溶液處理SW620細胞48 h時的氧化應激負荷檢測結果
a～d：ROS水平；e：GSH水平；f：MDA水平。各組
2.3 鐵死亡關鍵蛋白的表達結果
Western blot法檢測鐵死亡關鍵蛋白的定性結果見圖4a，半定量結果見圖4b～4d。實驗濃度（10、20 mg/mL）的槐耳提取物溶液干預48 h均能有效下調GPX4（F=74.2，P<0.001）、NRF2（F=32.8，P=0.001）和HMGB1（F=55.1，P<0.001）蛋白的表達且呈劑量依賴關系。
圖4
示Western blot法檢測槐耳提取物溶液干預后48 h時鐵死亡關鍵蛋白的表達結果
a：定性結果；b～d：GPX4（b）、NRF2（c）、HMGB1（d）蛋白半定量結果，實驗重復 3 次（與0 mg/mL濃度比較，*
3 討論
在抗腫瘤藥物開發領域，天然藥物依舊是研究的熱點，天然藥物特性與合成藥物相比，更具臨床親和性，臨床試驗與推廣的安全性也相對較高。天然藥物如中藥，能增強人體的固有免疫和適應性免疫[18]；多種生物堿如長春堿[19]、紫杉醇[20]、喜樹堿[21]等已在臨床腫瘤用藥中發揮重要作用。中藥槐耳在我國民間是重要藥用真菌，又名為槐栓菌，它在消化系統腫瘤中作用的研究較多，但槐耳與CRC關系的研究較少。Zou等[22]在體外實驗中驗證了槐耳對HCT116、HCT8細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，且在小鼠的結腸炎相關CRC模型中發現槐耳能減輕結腸損傷與腫瘤負荷。2021年一項納入340例患者的隊列研究[23]表明，槐耳顆粒可預防早期肝細胞癌熱消融術后復發。一項較早（2013年）的體外研究[24]報道，槐耳水提物能通過調控CRC細胞的Wnt/β-catenin通路，從而抑制其腫瘤成球能力以及相關腫瘤干細胞標志物的水平。近幾年相繼有槐耳與CRC信號通路的研究，如鄒一豐等[25]發現槐耳清膏可通過Bcl-2/Bax/Cleaved caspase-3凋亡相關信號通路誘導SW480細胞凋亡；謝海娟等[26]發現槐耳浸膏通過調控ROS/核因子-κB信號通路抑制基質金屬蛋白酶-9的表達、阻斷了佛波酯誘導的SW480細胞的侵襲。在腫瘤領域，槐耳與細胞死亡的研究目前以凋亡、自噬為主，也有涉及較新的焦亡研究[27-28]。鐵死亡與自噬、氧化應激相關，因此，通過鐵死亡研究槐耳對CRC的作用機制，是一種對既往槐耳研究的總結，也是一種研究方向的過渡，進而邁向新的研究領域，而且緊跟當前的研究熱點。
鐵死亡的主要機制為脂質過氧化，本研究初步探究的ROS結果與文獻報道的結果有所出入。腫瘤的藥物治療研究中大多認為槐耳能減輕ROS從而降低藥物的毒副作用[29]，而且在CRC的研究中表明槐耳能減輕SW480細胞的ROS水平[26]。通過對比分析數據，結果的差異可能來源于槐耳的用量及細胞模型的不同，如在研究SW480細胞的研究[26]中，槐耳的劑量濃度為5 mg/mL，而本研究的最小劑量為10 mg/mL，由于ROS在目前的研究中被認為是生理與病理中的雙刃劍，過低或過高都會對機體產生不利影響，保持氧化還原的穩態才是研究ROS的最終目的；再從ROS的流式細胞檢測結果來對比，本研究的槐耳濃度劑量提高了1～2倍，ROS水平卻增加了5～10倍，可見高濃度的槐耳提取物溶液能打破氧化應激的平衡穩態，但這種高濃度對于機體產生的不利影響在體內外研究中均無充分的驗證，本研究發現這種高濃度的槐耳能劑量依賴誘導CRC細胞的鐵死亡，為誘導鐵死亡化學藥物的有效用量提出參考，可作為高濃度槐耳用量的有利證據之一。此外，SW620細胞與SW480細胞為同源的CRC細胞系，但SW620細胞的惡性程度更高，也可能為造成結果有差異的原因之一。因此，槐耳劑量的有效性與安全性仍需進一步的探討。
目前認為鐵死亡主要由三大系統調控，即（半）胱氨酸/GSH/GPX4軸、還原型輔酶Ⅰ（Ⅱ）/鐵死亡抑制蛋白1/泛醌、磷酸環水解酶/四氫生物蝶呤/二氫葉酸還原酶系統，其中（半）胱氨酸/GSH/GPX4軸為最經典的系統。GPX4是一種硒蛋白，其生物合成依賴于硒代半胱氨酸的共翻譯整合機制，為經典系統中的關鍵調控因子。轉錄因子NRF2是細胞抗氧化反應的主要調節因子，其信號通路是癌進展、轉移和治療抗性的驅動因素。有研究[30]發現，NRF2的靶基因二氫二醇脫氫酶1和GPX4以及參與GSH和還原型輔酶Ⅱ合成的基因，參與引發鐵死亡的脂質過氧化，揭示了氧化還原穩態與鐵信號傳導的相互作用。此外，選擇性自噬的過度激活，通過降解鐵蛋白、脂滴、晝夜節律蛋白和GPX4促進鐵死亡，HMGB1為自噬調節劑，也能作為信號傳導因子參與細胞的鐵死亡[31]。本研究采用Western blot法檢測這3種蛋白，為初步驗證槐耳對鐵死亡經典GPX4途徑的影響，結果顯示，10、20 mg/mL濃度的槐耳提取物能有效誘導SW620細胞的鐵死亡，且對GPX4經典途徑影響較大；此外，研究還發現，高濃度（20 mg/mL）槐耳提取物的MDA水平不增反降，對該現象的原因分析，一方面可能是細胞不可修復的失代償狀態，MDA大量積累對細胞膜造成不可逆損害以致釋放到胞外，細胞自身狀態無法對抗氧化應激而生成MDA，最終導致胞內總MDA水平不高；另一方面也可能是細胞應對外源性過氧化物的一種抗氧化保護機制，因為相較于ROS，MDA含量反映機體潛在的抗氧化能力。此結果提示，槐耳在一定濃度范圍內能誘導SW620細胞的鐵死亡，若濃度超過了該濃度范圍即對鐵死亡的誘導無有效增益，此結果可能對臨床治療有一定的參考價值，如在對CRC患者使用誘導鐵死亡的化療時，可以個性化計算患者用藥的劑量范圍，超過此范圍值就不能通過該途徑產生抗癌作用，及時調整用藥劑量，既能有效節省醫藥成本，又能降低藥物過量的副作用。
本研究仍存在諸多改進的空間，如細胞形態在高倍鏡下的特征，由于SW620細胞增殖較為迅速，而且相較于其他CRC細胞系，其接觸抑制較小以致于容易疊起來生長，因此，應繼續摸索條件，使它在未加藥（0 mg/mL濃度）與加藥狀態下均能區分為單個細胞，以便觀察細胞形態變化的細節；再比如藥物濃度的探究也需細化，在維持鐵死亡劑量依賴這一現象的同時，確保體內外實驗的均一性，而且目前的結果較多停留在現象層面，機制探究也較為表淺，本研究中Western blot檢測GPX4、NRF2、HMGB1這3個指標的證據均指向于經典的GPX4鐵死亡通路，因此，后續的研究將細化其中的機制并探討與其他幾個鐵死亡系統的可能聯系，然后在體內試驗中進一步驗證。與之相比，MDA結果所展現出來的異常趨勢也體現本課題的延續性，今后將完善實驗設計探索其中的可能機制。此外，為驗證槐耳提取物的臨床研究意義，本課題組接下來的實驗將探究槐耳提取物溶液在CRC腫瘤耐藥中的作用，旨在為CRC的中藥提取物與化學藥物的聯合用藥提供新的思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：徐勝為課題提出者、總指導；鄧文宏為經費提供人員并給予技術指導；賈一帆、邱振東負責實驗操作、文章撰寫及修改。
