引用本文： 陳豪, 潘曉飛, 張好剛, 王夫景, 喬鵬飛. 結直腸癌患者腫瘤類器官生物樣本庫在預測化療效果中的應用研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(2): 167-174. doi: 10.7507/1007-9424.202208018 復制
結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內發病率較高的惡性腫瘤，2020年全球有1 930萬新發病例和93萬死亡病例，總發病率升至新發癌癥的第3位，死亡率升至第2位；我國2020年新發CRC約55萬例，新增死亡人數28萬例，CRC發病率已躍居新發惡性腫瘤的第2位，因CRC死亡的病例數居第5位[1]。在新發CRC患者中，約25%初診時已出現轉移，超過50%的患者最終將會發生轉移[2-3]。據統計，接近90%的轉移性CRC無法手術根治，晚期CRC患者若不予治療，其中位生存期僅5～10個月[4]。目前仍然缺乏晚期CRC全身系統治療方案的有效臨床數據，除CRC肝轉移的治療指南相對完善外，伴有其他器官轉移的晚期CRC仍缺乏高級別的臨床研究數據[5]。
類器官是將具有增殖潛能的細胞加入到特定培養基中，經過獨立擴增、體外自組裝，形成具有器官特異性生理結構和功能特征的細胞團塊[6]。有研究[7]表明，患者的腫瘤類器官（tumoroid）對不同抗腫瘤藥物表現出不同敏感性，腫瘤類器官具有預判患者化療效果的潛能。本研究通過建立CRC患者的腫瘤類器官生物樣本庫，旨在從組織形態學層面驗證腫瘤類器官經過連續傳代后依然與對應的CRC原發灶腫瘤組織形態學保持一致，腫瘤類器官具有作為臨床前實驗模型預判CRC患者化療效果的潛能。
1 材料和方法
1.1 腫瘤類器官的分離培養
CRC腫瘤標本取自2020年4月1日至2020年10月31日期間于哈爾濱醫科大學附屬第二醫院接受手術或消化內鏡鉗夾切除的CRC患者的腫瘤組織共44例。本研究方案取得哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會的批準（批文編號：KY2021-077），所有參與研究的患者均簽署了哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會提供的知情同意書。
用無菌剪刀將CRC腫瘤組織剪碎至直徑約5 mm的組織碎塊，組織碎塊以杜比可磷酸緩沖鹽（Dolbico phosphate buffer salt，D-PBS，Stemcell Technologies，37350）洗滌后加入預冷的細胞解離試劑 ［gentle cell dissociation reagent（GCDR），Stemcell Technologies，07174］ 在冰上孵育30 min。用杜氏改良的Eagle培養基 ［Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM），Stemcell Technologies，36254］ 加1%胎牛血清 ［bovine serum albumin（BSA），GIBCO，10099-141］ 培養基終止反應，震蕩搖勻，將上清液以70 μm濾器濾過，接種到基質膠（Corning，356231）上，培養皿中加入混有DMEM/F-12和15 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸 ［4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid（HEPES），Stemcell Technologies，07200］ 的類器官培養基（IntestiCultTM OGM Human Component A，Stemcell Technologies，06010），置于37 ℃細胞孵箱培養，顯微鏡下觀察腫瘤類器官的形成和生長狀態，2～3 d換液1次，5～7 d傳代。
1.2 腫瘤類器官的凍存和復蘇
將基質膠用細胞回收液溶解并吹散，洗滌后以預冷的細胞凍存液制備腫瘤類器官懸液，置于–80 ℃下冷凍過夜，然后在液氮中長期儲存。將含有腫瘤類器官的凍存管置于37 ℃水浴2 min后，將預冷的培養基（600 μL 25% BSA+14.4 mL DMEM）加入凍存管中，吹打混勻后將細胞懸液轉移到15 mL含2 mL預冷培養基的試管中，290 g離心5 min，棄上清液。加入60 μL基質膠并輕柔混勻，然后將懸液接種至24孔板中，37 ℃細胞孵箱培養10 min后，每孔添加750 μL 腫瘤類器官培養基，置于37 ℃細胞孵箱培養，顯微鏡下觀察腫瘤類器官的生長狀態，2～3 d換液1次，5～7 d傳代。
1.3 腫瘤類器官的蘇木精-伊紅（HE）染色
將生長狀態良好的腫瘤類器官移至離心管內，200 g離心10 min，棄上清，在離心管內加入2 mLBSA，混勻后再加入80%濃度乙醇（約為BSA混合液體積的5倍），混勻后200 g離心10 min，棄上清，加入4%多聚甲醛（Sigma Aldrich，P6148）固定3 h；依次用70%、85%、95%及100%乙醇進行脫水處理，每步驟1～2 h；用與乙醇等體積的二甲苯混合處理1 h，純二甲苯處理1～2 h；以全自動石蠟切片機將石蠟塊制成6 μm厚的切片，對組織切片進行HE染色，采用Zeiss（ZEISS，Imager. M2）顯微鏡觀察并拍照。
1.4 藥物處理腫瘤類器官
將腫瘤類器官以（2～5）×104個細胞/50 μL基質膠/孔接種于24孔板，培養2～3 d后，更換為含有化療藥物的培養基，具體如下。 CAPEOX方案中奧沙利鉑∶卡培他濱=1∶200，其中卡培他濱的濃度分別為 0、0.1、0.3、1、3及10 μg/mL；CAPEOX 方案處理腫瘤類器官 72 h后，再次加藥，繼續培養72 h后，以CellTiter-GIo 3D細胞活力檢測試劑盒檢測細胞活性。 FOLFOX方案中5-FU∶亞葉酸鈣∶奧沙利鉑=25∶5∶1，其中5-FU濃度分別為 0、0.3、1、5、15及50 μg/mL；FOLFOX方案處理腫瘤類器官 72 h后，再次加藥，繼續培養72 h后，檢測細胞活性。西妥昔單抗（Cetuximab）以 0、1.5、5、15、50和150 μg/mL濃度處理腫瘤類器官72 h后，再次加藥，繼續培養72 h后檢測細胞活性。貝伐珠單抗（Bevacizumab）以 0、1、3、10、40及120 μg/mL 濃度處理腫瘤類器官 72 h后，再次加藥，繼續培養72 h后檢測細胞活性。
1.5 檢測腫瘤類器官細胞活性
采用CellTiter-GIo 3D細胞活力檢測試劑盒檢測腫瘤類器官細胞活性。腫瘤類器官復蘇培養7 d，洗滌后分別加入不同濃度的受試藥物，置于恒溫培養箱內培養5～7 d后每孔中加入與培養基等體積的CellTiter-GIo 3D檢測試劑，震蕩混勻5 min，室溫下孵育25 min；采用多功能熒光酶標儀檢測熒光強度，統計分析不同化療方案藥物的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）以及細胞活性-藥物濃度曲線下面積（area under the curve，AUC）。腫瘤類器官抑制率（inhibitory rate，IR）=（對照孔A值–實驗孔A值）/對照孔A值×100%。根據全國抗癌藥物會議制訂的抗腫瘤藥物通用指標，IR=30%～70%和（或）IC50<25%血漿高峰濃度定義為敏感；IR<30%和（或）IC50>25%血漿高峰濃度定義為耐藥。
1.6 CRC患者臨床信息與腫瘤類器官藥物敏感性的相關性分析
參照RECIST評估接受化療CRC患者的臨床療效，分為化療耐藥組和化療敏感組。CRC患者接受同一方案化療期間病情評估發現病情進展（progressive disease，PD）定義為化療耐藥組；CRC患者接受化療后出現病情部分緩解（partial response，PR）或完全緩解（complete response，CR）定義為化療敏感組。對接受標準劑量化療的CRC患者臨床病理資料進行回顧性分析，查閱病例及電話隨訪患者的生存時間，隨訪終點為無進展生存期（progression-free survival，PFS）。PFS定義為從化療開始至第1次PD、死亡、最后1次隨訪或治療策略改變的時間[8]。進一步分析CRC患者臨床化療效果與腫瘤類器官藥物敏感性的相關性。
1.7 統計學方法
采用SPSS 21.0以及GraphPad Prism 8.0統計軟件進行數據錄入和統計學分析。計量資料以中位數和上下四分位數 ［M（P25，P75）］ 表示；計數資料以例（%）表示，率的比較采用Fisher確切概率法。CRC患者的臨床化療效果與腫瘤類器官藥物敏感性的相關性分析采用秩相關分析，rs>0提示變量之間呈正相關，rs<0提示變量之間呈負相關；rs絕對值 ＜0.2表示弱相關，0.2≤rs 絕對值 ≤0.4表示中等程度相關，rs絕對值 ＞0.4表示高等程度相關。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 建立CRC患者的腫瘤類器官生物樣本庫
本研究根據收集到的44例CRC患者的腫瘤組織成功建立34例腫瘤類器官，其來源涵蓋了全部結腸和直腸，總成功率為77.27%；其中4例腫瘤類器官在培養基中無法增殖分化，6例腫瘤類器官由于細菌污染未能成功建立。腫瘤類器官在培養基中生存周期大于4周，可連續傳代至第5代。腫瘤類器官傳代培養及凍存復蘇均不影響其生長和形態。本研究中CRC病理類型包括腺癌30例，黏液腺癌4例；21例為中分化腫瘤，9例為低分化腫瘤，4例為高分化腫瘤，與目前CRC流行病理學特征相符[9]。在34例CRC腫瘤中，有26例取材前未接受過化療，8例取材前接受過化療。RAS/BRAF 基因狀態：34例患者中KRAS基因野生型13例，KRAS 基因突變17例，NRAS 基因突變3例，BRAF 基因突變1例（也是KRAS野生型）。
2.2 腫瘤類器官的形態學及組織病理學特征
本研究中所有CRC患者的腫瘤類器官與其原發灶腫瘤組織的形態學特征高度一致，第1代（P1）腫瘤類器官的結構特征表現為空泡囊狀結構和無管腔的致密結構，第5代（P5）腫瘤類器官仍然保留了原發灶腫瘤組織的形態學特征，包括細微的細胞學特征、胞質清除和胞質嗜酸性粒細胞增多和突出的細胞核形態。所有腫瘤類器官至少可傳代5代以上并未見明顯形態學改變（圖1a）。HE染色提示腫瘤類器官可見明顯的細胞異型性，與原發腫瘤表現出相同的聚集形態，具有CRC患者腫瘤特異性形態，包括薄壁囊狀結構或實性致密結構（圖1b）。
圖1
示病例5和病例21的傳代培養腫瘤類器官的組織形態學特征
a：P1為第1代腫瘤類器官，鏡下呈空泡囊狀結構和無管腔的致密球型結構，P5為第5代腫瘤類器官，鏡下仍然保留原發灶腫瘤組織的形態學特征，包括細微的細胞學特征、胞質清除和胞質嗜酸性粒細胞增多、突出的細胞核形態；b：HE染色結果表明腫瘤類器官具有明顯的細胞異型性，與原發腫瘤表現出一致的特異性聚集形態，包括薄壁囊狀結構或實性致密結構（HE）
2.3 腫瘤類器官可反映CRC患者對靶向藥物治療的療效
CRC治療過程中常用的靶向藥物包括抗表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單克隆抗體—西妥昔單抗和抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體—貝伐珠單抗[10]。本研究觀察了RAS和BRAF突變型腫瘤類器官對西妥昔單抗的敏感性，以評估CRC患者腫瘤類器官對化療藥物療效的預判價值，結果見圖2。由圖2可見，17例KRAS基因突變型腫瘤類器官、3例NRAS基因突變型腫瘤類器官以及1例BRAF基因突變型腫瘤類器官對西妥昔單抗治療耐藥，而13例KRAS基因野生型腫瘤類器官對西妥昔單抗治療敏感，提示腫瘤類器官可預判CRC患者對靶向藥物治療的療效。
圖2
示腫瘤類器官反映CRC患者對靶向藥物治療的療效
藍色曲線：RAS突變型腫瘤類器官；紅色曲線：KRAS野生型腫瘤類器官；黃色曲線：BRAF突變型腫瘤類器官
2.4 腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者臨床療效的一致性結果
根據RAS/BRAF基因狀態，本研究將化療方案中應用的藥物作用于對應的腫瘤類器官并檢測細胞活性以評估藥物敏感性。本研究中34例接受化療的CRC患者中，15例對化療敏感，19例耐藥；對應的腫瘤類器官藥物敏感性評估結果為化療敏感12例，耐藥22例（表1）。將腫瘤類器官藥敏數據與患者臨床結果進行匹配，發現12例腫瘤類器官對藥物處理敏感并與對應患者的臨床療效一致（圖3a）；19例臨床療效不理想的CRC患者來源的腫瘤類器官同樣對藥物處理表現為耐藥（圖3b）；另有3例CRC患者取得了良好的臨床療效，但其來源的腫瘤類器官對藥物處理表現為耐藥（圖3c）。在本研究中，采用CAPEOX方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為94.12%（16/17），采用FOLFOX方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為85.71%（6/7），采用CAPEOX+貝伐珠單抗方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為50.00%（1/2），采用FOLFOX+貝伐珠單抗方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為100%（6/6），采用FOLFOX+西妥昔單抗方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為100%（2/2）。總一致性為91.18%（31/34；rs=0.827，P<0.001），見表2。該結果提示腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者的臨床療效高度一致。
表1
不同化療方案作用于對應的腫瘤類器官的藥物敏感性評估結果
圖3
示腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者的臨床療效的一致性結果
a：為腫瘤類器官及其對應的病例3藥物處理前后的肝臟CT掃描結果和劑量-效應曲線，二者的療效一致，均對藥物處理敏感，黑箭所指為肝轉移瘤；b：為腫瘤類器官及其對應的病例14藥物處理前后的肝臟CT掃描結果和劑量-效應曲線，二者的療效一致，均對藥物處理耐藥，黑箭所指為肝轉移瘤；c：為腫瘤類器官及其對應的病例11藥物處理前后的肺部CT掃描結果和劑量-效應曲線，二者的療效不一致，獲得良好臨床療效的CRC患者來源的腫瘤類器官對藥物處理表現為耐藥，白箭所指為肺轉移瘤
表2
腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者臨床療效的一致性結果
2.5 腫瘤類器官化療藥物敏感性與CRC患者臨床預后的關系
本研究將34例腫瘤類器官分為化療敏感組12例和耐藥組22例，分析腫瘤類器官藥物敏感性與CRC患者臨床病理特征之間的關系。結果34例腫瘤類器官的藥物敏感性與患者臨床病理特征之間的關系無統計學意義（P>0.05），見表3，提示本研究中腫瘤類器官的藥物敏感性不受患者臨床病理特征的影響。 本研究的CRC患者均獲隨訪，隨訪時間1～14個月，中位隨訪時間6.5個月，PFS為1～13個月，中位數為4個月。對PFS進行相關分析，發現腫瘤類器官的藥物抑制率與CRC患者的PFS呈正相關趨勢（圖4a，rs=0.412，P=0.016），不同化療方案中腫瘤類器官的藥物劑量-效應的AUC與CRC患者的PFS呈負相關趨勢（圖4b，rs=–0.479，P=0.004）。該結果提示腫瘤類器官對化療藥物的敏感性與CRC患者的臨床預后一致。
表3
腫瘤類器官的化療敏感性與CRC患者臨床病理特征的關系［例（%） ］
圖4
示腫瘤類器官對化療藥物敏感性與CRC患者臨床預后一致性分析結果
a：腫瘤類器官的藥物抑制率與CRC患者的PFS呈正相關趨勢（
3 討論
自從 Sato等[11]在基質膠中培養LGR5+小鼠腸道干細胞的單細胞懸液，并成功建立腸道類器官后，越來越多的研究集中在建立類器官生物樣本庫上。隨后，Sasai團隊建立了包含神經視網膜和視網膜色素上皮空間分離區域的視杯狀器官[12]。后期陸續有研究[13-16]報道了具有多種區域特征的腦類器官的建立。在這些研究的基礎上，內耳[17]、肺[18]、胃[19]、肝[20]、胰腺[21]等器官先后被成功分離培養。隨著類器官技術的發展，患者來源的腫瘤類器官被證實與腫瘤細胞形態高度相似，并具有模擬惡性腫瘤生物學行為的優勢，彌補了動物模型物種間差異的影響。此外，腫瘤類器官可以在體外擴增和凍存，腫瘤類器官生物庫的建立有望成為臨床前研究的有力模型和潛在工具[22-24]。到目前為止，國內外學者已經從結直腸[25-26]、乳腺[27-28]、肝[29] 、肺[30]、胰腺[31]、子宮內膜[32]、胃[23, 33]等癌組織中建立了腫瘤類器官生物樣本庫。
與傳統模型（包括細胞系和患者來源的異種移植模型）相比，腫瘤類器官具有擬合度高、培養周期短、傳代穩定性好等優勢。 van de Wetering 等[34]發現類器官技術可能填補腫瘤遺傳學和臨床試驗之間的空白，并促進個體化醫療的進展。Vlachogiannis等[35]發現，消化系統轉移癌組織類器官可以于體外反映患者的臨床化療效果。另外Yao等[36]建立了局部晚期直腸癌腫瘤組織的類器官生物樣本庫，并證實類器官與其對應的腫瘤組織具有高度一致的分子圖譜，類器官可以反映局部晚期直腸癌患者的臨床實際放化療效果。Ganesh等[8]基于直腸癌腫瘤組織類器官建立了小鼠直腸腔內種植瘤，該模型能更有效地預判直腸癌患者的藥物敏感性。此外，一些綜述也強調了腫瘤類器官技術在腫瘤研究和精準醫學中的轉化應用，討論了與其他模型相比較的優勢和局限性，并展望了類器官技術在未來生命科學諸多領域具備巨大潛力[37-43]。本研究發現CRC的腫瘤類器官可能對患者抗腫瘤治療的反應有重要的預測價值。然而，包括腫瘤的微環境、抗腫瘤藥物代謝或其他器官的化療毒性反應等問題仍有待解決。
盡管其他研究表明體積過小以及接受過抗腫瘤治療的組織不易成功培養類器官[8, 34]，但本研究結果表明，通過外科手術切除和消化內鏡鉗夾切除的活檢組織培養CRC的腫瘤類器官成功率較高。此外，本研究發現凍存并不影響類器官活性。筆者認為，成功建立正常結直腸黏膜組織類器官的關鍵點是組織標本包含足夠數量的腸隱窩，而成功建立CRC來源腫瘤類器官的關鍵點則是組織標本包含足夠數量的存活腫瘤細胞。本研究用不同病理類型的CRC樣本建立的腫瘤類器官生物樣本庫能夠反映與其對應的CRC原發灶腫瘤組織的基本形態，并且腫瘤類器官傳至第5代仍能夠嚴格保留其親代腫瘤的組織學特征。
本研究的另一個目的是為CRC的腫瘤類器官能夠預判CRC患者的化療效果提供更多的理論支持。與以往的研究結果[8,36,44]一致，本研究數據表明，攜帶RAS或BRAF突變的腫瘤類器官對西妥昔單抗表現為耐藥，而RAS或BRAF野生型的腫瘤類器官對西妥昔單抗治療敏感。由此可見，CRC來源的腫瘤類器官在預測臨床療效方面比目前臨床治療指南和大數據分析更加確切，腫瘤類器官比單獨的分子病理學證據或許更能反映CRC的臨床化療結果。本研究進一步將實際化療方案中應用的藥物作用于對應的腫瘤類器官并檢測細胞活性以評估藥物敏感性，結果表明腫瘤類器官可以反映CRC患者對不同化療方案的敏感性，34例CRC患者的腫瘤類器官的藥物敏感性與其臨床病理特征之間沒有顯著關系，腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者臨床療效的一致性達到91.18%，該結果與同行研究[44]結果（85%）相似。本研究進一步通過隨訪患者的PFS，分析CRC患者的臨床預后與腫瘤類器官藥物敏感性的相關性，結果顯示腫瘤類器官對化療藥物的敏感性與CRC患者的臨床預后一致。由于貝伐珠單抗主要是通過抑制血管內皮生長發揮作用，而腫瘤類器官體外培養無法模擬腫瘤微環境中的新生血管滋養環境，因此筆者認為 CAPEOX 或 FOLFOX 方案中的藥物對腫瘤類器官發揮了主要干擾作用。在今后的研究中，我們將繼續擴大類器官標本庫基數，并嘗試通過在Prkdc基因及Il2rg基因敲除突變導致的免疫缺陷型小鼠腸腔內移植腫瘤類器官以建立原位人源腫瘤異種移植模型，于體內實驗，進一步完善研究。
本研究成功分離培養并建立了CRC患者的腫瘤類器官生物標本庫，證實腫瘤類器官與原發灶腫瘤組織在組織形態學層面保持高度一致，并且經過連續傳代后依然保持穩定；通過將臨床實際療效與腫瘤類器官藥物敏感實驗結果進行比對分析，證實將腫瘤類器官作為臨床前實驗模型制定化療方案、預判化療效果具有可行性，為腫瘤類器官作為臨床前實驗模型、制定化療方案奠定了理論基礎，有望實現以腫瘤類器官生物樣本庫為基礎的實驗研究向臨床實踐的轉化。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：喬鵬飛完成實驗設計；張好剛和潘曉飛進行實驗、收集數據并做統計分析；陳豪和王夫景共同完成論文寫作。
倫理聲明：本研究已通過哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會的批準（批文編號：KY2021-077）。
結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內發病率較高的惡性腫瘤，2020年全球有1 930萬新發病例和93萬死亡病例，總發病率升至新發癌癥的第3位，死亡率升至第2位；我國2020年新發CRC約55萬例，新增死亡人數28萬例，CRC發病率已躍居新發惡性腫瘤的第2位，因CRC死亡的病例數居第5位[1]。在新發CRC患者中，約25%初診時已出現轉移，超過50%的患者最終將會發生轉移[2-3]。據統計，接近90%的轉移性CRC無法手術根治，晚期CRC患者若不予治療，其中位生存期僅5～10個月[4]。目前仍然缺乏晚期CRC全身系統治療方案的有效臨床數據，除CRC肝轉移的治療指南相對完善外，伴有其他器官轉移的晚期CRC仍缺乏高級別的臨床研究數據[5]。
類器官是將具有增殖潛能的細胞加入到特定培養基中，經過獨立擴增、體外自組裝，形成具有器官特異性生理結構和功能特征的細胞團塊[6]。有研究[7]表明，患者的腫瘤類器官（tumoroid）對不同抗腫瘤藥物表現出不同敏感性，腫瘤類器官具有預判患者化療效果的潛能。本研究通過建立CRC患者的腫瘤類器官生物樣本庫，旨在從組織形態學層面驗證腫瘤類器官經過連續傳代后依然與對應的CRC原發灶腫瘤組織形態學保持一致，腫瘤類器官具有作為臨床前實驗模型預判CRC患者化療效果的潛能。
1 材料和方法
1.1 腫瘤類器官的分離培養
CRC腫瘤標本取自2020年4月1日至2020年10月31日期間于哈爾濱醫科大學附屬第二醫院接受手術或消化內鏡鉗夾切除的CRC患者的腫瘤組織共44例。本研究方案取得哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會的批準（批文編號：KY2021-077），所有參與研究的患者均簽署了哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會提供的知情同意書。
用無菌剪刀將CRC腫瘤組織剪碎至直徑約5 mm的組織碎塊，組織碎塊以杜比可磷酸緩沖鹽（Dolbico phosphate buffer salt，D-PBS，Stemcell Technologies，37350）洗滌后加入預冷的細胞解離試劑 ［gentle cell dissociation reagent（GCDR），Stemcell Technologies，07174］ 在冰上孵育30 min。用杜氏改良的Eagle培養基 ［Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM），Stemcell Technologies，36254］ 加1%胎牛血清 ［bovine serum albumin（BSA），GIBCO，10099-141］ 培養基終止反應，震蕩搖勻，將上清液以70 μm濾器濾過，接種到基質膠（Corning，356231）上，培養皿中加入混有DMEM/F-12和15 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸 ［4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid（HEPES），Stemcell Technologies，07200］ 的類器官培養基（IntestiCultTM OGM Human Component A，Stemcell Technologies，06010），置于37 ℃細胞孵箱培養，顯微鏡下觀察腫瘤類器官的形成和生長狀態，2～3 d換液1次，5～7 d傳代。
1.2 腫瘤類器官的凍存和復蘇
將基質膠用細胞回收液溶解并吹散，洗滌后以預冷的細胞凍存液制備腫瘤類器官懸液，置于–80 ℃下冷凍過夜，然后在液氮中長期儲存。將含有腫瘤類器官的凍存管置于37 ℃水浴2 min后，將預冷的培養基（600 μL 25% BSA+14.4 mL DMEM）加入凍存管中，吹打混勻后將細胞懸液轉移到15 mL含2 mL預冷培養基的試管中，290 g離心5 min，棄上清液。加入60 μL基質膠并輕柔混勻，然后將懸液接種至24孔板中，37 ℃細胞孵箱培養10 min后，每孔添加750 μL 腫瘤類器官培養基，置于37 ℃細胞孵箱培養，顯微鏡下觀察腫瘤類器官的生長狀態，2～3 d換液1次，5～7 d傳代。
1.3 腫瘤類器官的蘇木精-伊紅（HE）染色
將生長狀態良好的腫瘤類器官移至離心管內，200 g離心10 min，棄上清，在離心管內加入2 mLBSA，混勻后再加入80%濃度乙醇（約為BSA混合液體積的5倍），混勻后200 g離心10 min，棄上清，加入4%多聚甲醛（Sigma Aldrich，P6148）固定3 h；依次用70%、85%、95%及100%乙醇進行脫水處理，每步驟1～2 h；用與乙醇等體積的二甲苯混合處理1 h，純二甲苯處理1～2 h；以全自動石蠟切片機將石蠟塊制成6 μm厚的切片，對組織切片進行HE染色，采用Zeiss（ZEISS，Imager. M2）顯微鏡觀察并拍照。
1.4 藥物處理腫瘤類器官
將腫瘤類器官以（2～5）×104個細胞/50 μL基質膠/孔接種于24孔板，培養2～3 d后，更換為含有化療藥物的培養基，具體如下。 CAPEOX方案中奧沙利鉑∶卡培他濱=1∶200，其中卡培他濱的濃度分別為 0、0.1、0.3、1、3及10 μg/mL；CAPEOX 方案處理腫瘤類器官 72 h后，再次加藥，繼續培養72 h后，以CellTiter-GIo 3D細胞活力檢測試劑盒檢測細胞活性。 FOLFOX方案中5-FU∶亞葉酸鈣∶奧沙利鉑=25∶5∶1，其中5-FU濃度分別為 0、0.3、1、5、15及50 μg/mL；FOLFOX方案處理腫瘤類器官 72 h后，再次加藥，繼續培養72 h后，檢測細胞活性。西妥昔單抗（Cetuximab）以 0、1.5、5、15、50和150 μg/mL濃度處理腫瘤類器官72 h后，再次加藥，繼續培養72 h后檢測細胞活性。貝伐珠單抗（Bevacizumab）以 0、1、3、10、40及120 μg/mL 濃度處理腫瘤類器官 72 h后，再次加藥，繼續培養72 h后檢測細胞活性。
1.5 檢測腫瘤類器官細胞活性
采用CellTiter-GIo 3D細胞活力檢測試劑盒檢測腫瘤類器官細胞活性。腫瘤類器官復蘇培養7 d，洗滌后分別加入不同濃度的受試藥物，置于恒溫培養箱內培養5～7 d后每孔中加入與培養基等體積的CellTiter-GIo 3D檢測試劑，震蕩混勻5 min，室溫下孵育25 min；采用多功能熒光酶標儀檢測熒光強度，統計分析不同化療方案藥物的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）以及細胞活性-藥物濃度曲線下面積（area under the curve，AUC）。腫瘤類器官抑制率（inhibitory rate，IR）=（對照孔A值–實驗孔A值）/對照孔A值×100%。根據全國抗癌藥物會議制訂的抗腫瘤藥物通用指標，IR=30%～70%和（或）IC50<25%血漿高峰濃度定義為敏感；IR<30%和（或）IC50>25%血漿高峰濃度定義為耐藥。
1.6 CRC患者臨床信息與腫瘤類器官藥物敏感性的相關性分析
參照RECIST評估接受化療CRC患者的臨床療效，分為化療耐藥組和化療敏感組。CRC患者接受同一方案化療期間病情評估發現病情進展（progressive disease，PD）定義為化療耐藥組；CRC患者接受化療后出現病情部分緩解（partial response，PR）或完全緩解（complete response，CR）定義為化療敏感組。對接受標準劑量化療的CRC患者臨床病理資料進行回顧性分析，查閱病例及電話隨訪患者的生存時間，隨訪終點為無進展生存期（progression-free survival，PFS）。PFS定義為從化療開始至第1次PD、死亡、最后1次隨訪或治療策略改變的時間[8]。進一步分析CRC患者臨床化療效果與腫瘤類器官藥物敏感性的相關性。
1.7 統計學方法
采用SPSS 21.0以及GraphPad Prism 8.0統計軟件進行數據錄入和統計學分析。計量資料以中位數和上下四分位數 ［M（P25，P75）］ 表示；計數資料以例（%）表示，率的比較采用Fisher確切概率法。CRC患者的臨床化療效果與腫瘤類器官藥物敏感性的相關性分析采用秩相關分析，rs>0提示變量之間呈正相關，rs<0提示變量之間呈負相關；rs絕對值 ＜0.2表示弱相關，0.2≤rs 絕對值 ≤0.4表示中等程度相關，rs絕對值 ＞0.4表示高等程度相關。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 建立CRC患者的腫瘤類器官生物樣本庫
本研究根據收集到的44例CRC患者的腫瘤組織成功建立34例腫瘤類器官，其來源涵蓋了全部結腸和直腸，總成功率為77.27%；其中4例腫瘤類器官在培養基中無法增殖分化，6例腫瘤類器官由于細菌污染未能成功建立。腫瘤類器官在培養基中生存周期大于4周，可連續傳代至第5代。腫瘤類器官傳代培養及凍存復蘇均不影響其生長和形態。本研究中CRC病理類型包括腺癌30例，黏液腺癌4例；21例為中分化腫瘤，9例為低分化腫瘤，4例為高分化腫瘤，與目前CRC流行病理學特征相符[9]。在34例CRC腫瘤中，有26例取材前未接受過化療，8例取材前接受過化療。RAS/BRAF 基因狀態：34例患者中KRAS基因野生型13例，KRAS 基因突變17例，NRAS 基因突變3例，BRAF 基因突變1例（也是KRAS野生型）。
2.2 腫瘤類器官的形態學及組織病理學特征
本研究中所有CRC患者的腫瘤類器官與其原發灶腫瘤組織的形態學特征高度一致，第1代（P1）腫瘤類器官的結構特征表現為空泡囊狀結構和無管腔的致密結構，第5代（P5）腫瘤類器官仍然保留了原發灶腫瘤組織的形態學特征，包括細微的細胞學特征、胞質清除和胞質嗜酸性粒細胞增多和突出的細胞核形態。所有腫瘤類器官至少可傳代5代以上并未見明顯形態學改變（圖1a）。HE染色提示腫瘤類器官可見明顯的細胞異型性，與原發腫瘤表現出相同的聚集形態，具有CRC患者腫瘤特異性形態，包括薄壁囊狀結構或實性致密結構（圖1b）。
圖1
示病例5和病例21的傳代培養腫瘤類器官的組織形態學特征
a：P1為第1代腫瘤類器官，鏡下呈空泡囊狀結構和無管腔的致密球型結構，P5為第5代腫瘤類器官，鏡下仍然保留原發灶腫瘤組織的形態學特征，包括細微的細胞學特征、胞質清除和胞質嗜酸性粒細胞增多、突出的細胞核形態；b：HE染色結果表明腫瘤類器官具有明顯的細胞異型性，與原發腫瘤表現出一致的特異性聚集形態，包括薄壁囊狀結構或實性致密結構（HE）
2.3 腫瘤類器官可反映CRC患者對靶向藥物治療的療效
CRC治療過程中常用的靶向藥物包括抗表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單克隆抗體—西妥昔單抗和抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體—貝伐珠單抗[10]。本研究觀察了RAS和BRAF突變型腫瘤類器官對西妥昔單抗的敏感性，以評估CRC患者腫瘤類器官對化療藥物療效的預判價值，結果見圖2。由圖2可見，17例KRAS基因突變型腫瘤類器官、3例NRAS基因突變型腫瘤類器官以及1例BRAF基因突變型腫瘤類器官對西妥昔單抗治療耐藥，而13例KRAS基因野生型腫瘤類器官對西妥昔單抗治療敏感，提示腫瘤類器官可預判CRC患者對靶向藥物治療的療效。
圖2
示腫瘤類器官反映CRC患者對靶向藥物治療的療效
藍色曲線：RAS突變型腫瘤類器官；紅色曲線：KRAS野生型腫瘤類器官；黃色曲線：BRAF突變型腫瘤類器官
2.4 腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者臨床療效的一致性結果
根據RAS/BRAF基因狀態，本研究將化療方案中應用的藥物作用于對應的腫瘤類器官并檢測細胞活性以評估藥物敏感性。本研究中34例接受化療的CRC患者中，15例對化療敏感，19例耐藥；對應的腫瘤類器官藥物敏感性評估結果為化療敏感12例，耐藥22例（表1）。將腫瘤類器官藥敏數據與患者臨床結果進行匹配，發現12例腫瘤類器官對藥物處理敏感并與對應患者的臨床療效一致（圖3a）；19例臨床療效不理想的CRC患者來源的腫瘤類器官同樣對藥物處理表現為耐藥（圖3b）；另有3例CRC患者取得了良好的臨床療效，但其來源的腫瘤類器官對藥物處理表現為耐藥（圖3c）。在本研究中，采用CAPEOX方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為94.12%（16/17），采用FOLFOX方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為85.71%（6/7），采用CAPEOX+貝伐珠單抗方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為50.00%（1/2），采用FOLFOX+貝伐珠單抗方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為100%（6/6），采用FOLFOX+西妥昔單抗方案治療的CRC患者臨床療效與其來源的腫瘤類器官敏感性的一致性為100%（2/2）。總一致性為91.18%（31/34；rs=0.827，P<0.001），見表2。該結果提示腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者的臨床療效高度一致。
表1
不同化療方案作用于對應的腫瘤類器官的藥物敏感性評估結果
圖3
示腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者的臨床療效的一致性結果
a：為腫瘤類器官及其對應的病例3藥物處理前后的肝臟CT掃描結果和劑量-效應曲線，二者的療效一致，均對藥物處理敏感，黑箭所指為肝轉移瘤；b：為腫瘤類器官及其對應的病例14藥物處理前后的肝臟CT掃描結果和劑量-效應曲線，二者的療效一致，均對藥物處理耐藥，黑箭所指為肝轉移瘤；c：為腫瘤類器官及其對應的病例11藥物處理前后的肺部CT掃描結果和劑量-效應曲線，二者的療效不一致，獲得良好臨床療效的CRC患者來源的腫瘤類器官對藥物處理表現為耐藥，白箭所指為肺轉移瘤
表2
腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者臨床療效的一致性結果
2.5 腫瘤類器官化療藥物敏感性與CRC患者臨床預后的關系
本研究將34例腫瘤類器官分為化療敏感組12例和耐藥組22例，分析腫瘤類器官藥物敏感性與CRC患者臨床病理特征之間的關系。結果34例腫瘤類器官的藥物敏感性與患者臨床病理特征之間的關系無統計學意義（P>0.05），見表3，提示本研究中腫瘤類器官的藥物敏感性不受患者臨床病理特征的影響。 本研究的CRC患者均獲隨訪，隨訪時間1～14個月，中位隨訪時間6.5個月，PFS為1～13個月，中位數為4個月。對PFS進行相關分析，發現腫瘤類器官的藥物抑制率與CRC患者的PFS呈正相關趨勢（圖4a，rs=0.412，P=0.016），不同化療方案中腫瘤類器官的藥物劑量-效應的AUC與CRC患者的PFS呈負相關趨勢（圖4b，rs=–0.479，P=0.004）。該結果提示腫瘤類器官對化療藥物的敏感性與CRC患者的臨床預后一致。
表3
腫瘤類器官的化療敏感性與CRC患者臨床病理特征的關系［例（%） ］
圖4
示腫瘤類器官對化療藥物敏感性與CRC患者臨床預后一致性分析結果
a：腫瘤類器官的藥物抑制率與CRC患者的PFS呈正相關趨勢（
3 討論
自從 Sato等[11]在基質膠中培養LGR5+小鼠腸道干細胞的單細胞懸液，并成功建立腸道類器官后，越來越多的研究集中在建立類器官生物樣本庫上。隨后，Sasai團隊建立了包含神經視網膜和視網膜色素上皮空間分離區域的視杯狀器官[12]。后期陸續有研究[13-16]報道了具有多種區域特征的腦類器官的建立。在這些研究的基礎上，內耳[17]、肺[18]、胃[19]、肝[20]、胰腺[21]等器官先后被成功分離培養。隨著類器官技術的發展，患者來源的腫瘤類器官被證實與腫瘤細胞形態高度相似，并具有模擬惡性腫瘤生物學行為的優勢，彌補了動物模型物種間差異的影響。此外，腫瘤類器官可以在體外擴增和凍存，腫瘤類器官生物庫的建立有望成為臨床前研究的有力模型和潛在工具[22-24]。到目前為止，國內外學者已經從結直腸[25-26]、乳腺[27-28]、肝[29] 、肺[30]、胰腺[31]、子宮內膜[32]、胃[23, 33]等癌組織中建立了腫瘤類器官生物樣本庫。
與傳統模型（包括細胞系和患者來源的異種移植模型）相比，腫瘤類器官具有擬合度高、培養周期短、傳代穩定性好等優勢。 van de Wetering 等[34]發現類器官技術可能填補腫瘤遺傳學和臨床試驗之間的空白，并促進個體化醫療的進展。Vlachogiannis等[35]發現，消化系統轉移癌組織類器官可以于體外反映患者的臨床化療效果。另外Yao等[36]建立了局部晚期直腸癌腫瘤組織的類器官生物樣本庫，并證實類器官與其對應的腫瘤組織具有高度一致的分子圖譜，類器官可以反映局部晚期直腸癌患者的臨床實際放化療效果。Ganesh等[8]基于直腸癌腫瘤組織類器官建立了小鼠直腸腔內種植瘤，該模型能更有效地預判直腸癌患者的藥物敏感性。此外，一些綜述也強調了腫瘤類器官技術在腫瘤研究和精準醫學中的轉化應用，討論了與其他模型相比較的優勢和局限性，并展望了類器官技術在未來生命科學諸多領域具備巨大潛力[37-43]。本研究發現CRC的腫瘤類器官可能對患者抗腫瘤治療的反應有重要的預測價值。然而，包括腫瘤的微環境、抗腫瘤藥物代謝或其他器官的化療毒性反應等問題仍有待解決。
盡管其他研究表明體積過小以及接受過抗腫瘤治療的組織不易成功培養類器官[8, 34]，但本研究結果表明，通過外科手術切除和消化內鏡鉗夾切除的活檢組織培養CRC的腫瘤類器官成功率較高。此外，本研究發現凍存并不影響類器官活性。筆者認為，成功建立正常結直腸黏膜組織類器官的關鍵點是組織標本包含足夠數量的腸隱窩，而成功建立CRC來源腫瘤類器官的關鍵點則是組織標本包含足夠數量的存活腫瘤細胞。本研究用不同病理類型的CRC樣本建立的腫瘤類器官生物樣本庫能夠反映與其對應的CRC原發灶腫瘤組織的基本形態，并且腫瘤類器官傳至第5代仍能夠嚴格保留其親代腫瘤的組織學特征。
本研究的另一個目的是為CRC的腫瘤類器官能夠預判CRC患者的化療效果提供更多的理論支持。與以往的研究結果[8,36,44]一致，本研究數據表明，攜帶RAS或BRAF突變的腫瘤類器官對西妥昔單抗表現為耐藥，而RAS或BRAF野生型的腫瘤類器官對西妥昔單抗治療敏感。由此可見，CRC來源的腫瘤類器官在預測臨床療效方面比目前臨床治療指南和大數據分析更加確切，腫瘤類器官比單獨的分子病理學證據或許更能反映CRC的臨床化療結果。本研究進一步將實際化療方案中應用的藥物作用于對應的腫瘤類器官并檢測細胞活性以評估藥物敏感性，結果表明腫瘤類器官可以反映CRC患者對不同化療方案的敏感性，34例CRC患者的腫瘤類器官的藥物敏感性與其臨床病理特征之間沒有顯著關系，腫瘤類器官藥物敏感性與對應的CRC患者臨床療效的一致性達到91.18%，該結果與同行研究[44]結果（85%）相似。本研究進一步通過隨訪患者的PFS，分析CRC患者的臨床預后與腫瘤類器官藥物敏感性的相關性，結果顯示腫瘤類器官對化療藥物的敏感性與CRC患者的臨床預后一致。由于貝伐珠單抗主要是通過抑制血管內皮生長發揮作用，而腫瘤類器官體外培養無法模擬腫瘤微環境中的新生血管滋養環境，因此筆者認為 CAPEOX 或 FOLFOX 方案中的藥物對腫瘤類器官發揮了主要干擾作用。在今后的研究中，我們將繼續擴大類器官標本庫基數，并嘗試通過在Prkdc基因及Il2rg基因敲除突變導致的免疫缺陷型小鼠腸腔內移植腫瘤類器官以建立原位人源腫瘤異種移植模型，于體內實驗，進一步完善研究。
本研究成功分離培養并建立了CRC患者的腫瘤類器官生物標本庫，證實腫瘤類器官與原發灶腫瘤組織在組織形態學層面保持高度一致，并且經過連續傳代后依然保持穩定；通過將臨床實際療效與腫瘤類器官藥物敏感實驗結果進行比對分析，證實將腫瘤類器官作為臨床前實驗模型制定化療方案、預判化療效果具有可行性，為腫瘤類器官作為臨床前實驗模型、制定化療方案奠定了理論基礎，有望實現以腫瘤類器官生物樣本庫為基礎的實驗研究向臨床實踐的轉化。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：喬鵬飛完成實驗設計；張好剛和潘曉飛進行實驗、收集數據并做統計分析；陳豪和王夫景共同完成論文寫作。
倫理聲明：本研究已通過哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會的批準（批文編號：KY2021-077）。
