引用本文： 王娜娜, 馮春林. 肝細胞癌動物模型的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(10): 1376-1382. doi: 10.7507/1007-9424.202204007 復制
肝細胞癌（簡稱“肝癌”）是最常見的原發性肝癌，是全球第6大常見癌癥和第3大癌癥死亡原因[1]。肝癌的主要危險因素包括乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、進食黃曲霉毒素污染的食物、長期大量飲酒、2型糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝病、吸煙等[2]，其發病機制目前仍不明確。肝癌動物模型的建立對于該病的基礎研究和臨床轉化研究都至關重要，可提高對肝癌的病理生理學的理解并探索這種疾病的分子驅動因素。此外，動物模型是研究肝癌發生發展及臨床前藥物試驗的重要載體，因此，建立接近人類肝癌臨床特征的動物模型對于研究肝癌復發轉移機制及發掘新的治療方法具有重要現實意義。
肝癌動物模型可分為自發型動物模型、誘發型動物模型、基因修飾型動物模型、移植型動物模型和人源化動物模型[3-4]。 不同肝癌動物模型的病因、發病機制以及病理生理學變化各不相同，具體取決于研究的類型及目的。了解每種肝癌動物模型的優缺點對于研究肝癌發病機制、治療、臨床前藥物篩選等方面具有重要的意義，下面將分別闡述不同肝癌動物模型的優缺點。
1 自發型動物模型
自發型動物模型是指無人工干預的情況下自然發病形成的疾病模型，疾病的發生發展與人類肝癌相似，適合用于研究肝癌的病因及發病機制。自發型肝癌模型最大的優勢是排除了人為因素的干擾，在發生肝癌的動物中可更真實地反映自然條件下肝癌的易感性程度、致癌環境因素及促癌物質的積累程度，類似于臨床上的人類肝癌；然而自發模型也存在一些缺點，如該模型建模成功率低且不穩定，時間長，荷瘤動物個體差異大（性別、體質量、腫瘤發生時間、腫瘤大小、腫瘤部位等），實驗數量少、實驗設計困難，導致實驗重復性差，結果難以預測，實際應用價值不大，所以一般很少采用[4]。
2 誘發型動物模型
誘發型肝癌動物模型通常是利用單一或聯合應用多種化學藥物、生物毒素等直接或間接作用于動物的肝臟，產生慢性炎癥反應，使之在數月內發生肝癌。常用的誘導方法有飲食、灌胃、吸入氣體、腹腔注射或皮下注射等，常用于建模的動物包括小鼠、大鼠等。該模型的優點是操作簡單，癌變率高且易于操控，可模擬人類肝癌的發生發展過程，即由肝纖維化、脂肪變性、肝炎、肝硬化到肝癌的過程。 Uehara等[5]用二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）聯合四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導方案模仿人類肝癌的病理生理過程，使小鼠發生肝臟遺傳毒性損傷和慢性纖維化，為研究炎癥和纖維化對肝癌的作用機制提供了有用的實驗方法，這對于模擬人類腫瘤微環境至關重要，是構建肝癌動物模型的理想方法之一。但是目前常規的誘發型動物模型的缺點是誘發過程中肝癌起病隱匿，建模周期長，病死率高，肝癌出現的時間、部位、病灶數等在個體之間表現不均一，腫瘤遺傳背景未知等[6]。所以為了加劇肝損傷和縮短建模時間，有研究者[7]認為，肝臟多種損傷誘導的協同作用不僅可以加速實驗動物肝癌的發生，而且可能更適合臨床前治療或預防研究；另有實驗研究[8]證實，在DEN/硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導的小鼠中加入高脂飲食與單獨使用DEN/TAA誘導劑相比，前者可導致小鼠在24周齡時產生更多的肝癌病灶以及發生更多的肝內炎癥和纖維化。目前的聯合誘導肝癌動物模型包括代謝紊亂聯合化學毒物誘導模型[8]、乙醇聯合化學毒物誘導模型[9]、基因突變聯合化學毒物誘導模型[10]等。化學誘導模型在揭示潛在的致癌機制方面是可靠的，許多誘導劑與肝癌的發生有關，根據其作用機制分為遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性致癌物，以下介紹幾種常見的誘導劑。
2.1 遺傳毒性致癌物
遺傳毒性致癌物通過形成共價鍵直接與DNA相互作用，形成DNA-致癌物復合物，引起基因突變或DNA損傷，從而導致癌變[11]。 常用的遺傳毒性致癌物包括DEN、2-乙酰氨基芴、黃曲霉毒素B1等[12]，其中DEN是目前臨床前研究中用于誘導肝癌動物模型最廣泛的遺傳毒性致癌物，對肝臟作用專一，有較強的親和力，操作簡單，成功率高，價格相對便宜，故在肝癌的研究中，優于其他化學誘癌劑，是迄今應用最廣泛的一種誘發肝癌的化學誘導劑。DEN誘導的肝癌模型所需的時間依賴的因素包括給藥劑量、給藥頻率、性別、年齡、小鼠品系、腫瘤微環境、免疫狀態等。 DEN誘導肝癌的經典小鼠模型是對2周齡的小鼠給予單次腹腔內注射DEN（1.25～25 mg/kg體質量），可導致小鼠在8～12個月左右發生肝癌[12]，但是單次注射DEN誘導的小鼠肝癌模型沒有出現大多數肝癌患者中發生的纖維化和肝硬化特征，所以為了實現發生肝纖維化和肝硬化的背景特征，其一，可以使用單次注射DEN聯合CCl4重復給藥的方式可促進肝臟發生纖維化[5, 13]；其二，可使用DEN長期注射的方法促進小鼠肝臟的炎癥和纖維化改變，從而模擬人類肝癌的病理生理學變化[14]。此外，基因組學分析表明，DEN誘導的小鼠肝癌中的基因表達模式與人類肝癌預后較差亞型的基因表達模式最相似[15]，但Dow等[16]的研究結果卻認為DEN誘導的動物模型應該避免作為人類肝癌的模型，因為DEN誘導腫瘤產生的基因組改變與人類肝癌基因組改變差異極大，并且DEN誘導的腫瘤具有在基因、遺傳途徑和轉錄組水平上明顯不同的分子譜；在一項關于DEN誘導小鼠肝癌的研究[17]中報道，Braf突變是C57BL/6小鼠發生肝臟組織癌變的主要驅動因素，人類肝癌中最常改變的基因是TP53和CTNNB1，但是在DEN誘導的動物模型中未發現TP53和CTNNB1突變。因此，DEN誘導的動物模型是否應用于研究人類肝癌的發病機制仍然具有爭議。
2.2 非遺傳毒性致癌物
CCl4、TAA、苯巴比妥等非遺傳毒性致癌物與DNA沒有直接的相互作用，它們通過破壞細胞結構和改變細胞增殖來引起肝臟組織損傷，從而導致炎癥、肝纖維化和肝癌的發生[3]。 對于單獨DEN給藥方案，隨著小鼠年齡的增長，小鼠的肝癌發病率逐漸降低，而且對新出生小鼠給予DEN后肝癌發展的潛伏期仍然很長，所以就需要使用不同類型的“啟動子”（即非遺傳毒性致癌物、高脂飲食等）和多階段聯合方案[18]，DEN和CCl4的組合通常用于誘導肝癌，在纖維化的背景下建立肝癌的可重復小鼠模型[19]，可更能模擬真實世界人類肝癌的發病過程，更有利于研究肝癌的腫瘤微環境及免疫藥物的篩選。
總之，化學誘導模型模擬了人肝癌的遺傳、免疫和環境特征，包括DNA損傷、基因改變、炎癥反應、纖維化、腫瘤微環境等；人類肝癌的發生大多數是肝炎–肝硬化–肝癌三部曲的發展過程，為了建立與人類肝癌發生發展和腫瘤微環境更為相似的動物模型，需要使用聯合誘導的方法建立慢性肝炎、肝纖維化的背景，但是，盡管已經使用了各種致癌物質的組合來縮短腫瘤誘導的時間，但肝癌的發生仍需要數月才能建立，所以一定程度上限制了研究人員的使用。
3 轉基因型動物模型
在過去幾十年中，轉基因和基因靶向技術的發展促進了研究腫瘤生物學的轉基因模型的產生，它在闡明腫瘤發生、進展、治療反應和先天耐藥性的機制方面發揮了關鍵作用。轉基因模型最常見的方法是通過基因編輯技術激活/過表達癌基因或滅活/去除抑癌基因，從而誘導腫瘤形成。其中過表達癌基因可以使用SB轉座子系統與流體動力學尾靜脈注射系統（hydrodynamic tail vein injection，HTVI）一起將癌基因整合到小鼠基因組中，以使其構成過表達并隨后誘導肝癌的發生[20]。而規律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和其相關蛋白9（associated protein 9，Cas9）共同組成了一套系統，即CRISPR-Cas9系統，是最新出現的一種由RNA指導的Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術，可用于特異性基因的敲除，通過HTVI能夠將CRISPR-Cas9系統編碼的DNA質粒遞送到小鼠肝臟，以精確地敲除腫瘤抑制基因并誘導肝癌的形成。特定位點的重組酶系統（causes recombination-locus of X-over P1，Cre-loxP）是一種強大的特異性基因敲除工具，Cre重組酶與限制酶相似，能夠特異性識別loxP位點，可使某一基因在特定器官或組織以及特定的時段中被剔除，可減輕由于在全體細胞中敲除產生的副作用[21]，利用HTVI傳遞Cre重組酶，可以在小鼠肝臟中實現Cre-loxP介導的條件性敲除。用于構建肝癌轉基因模型的動物通常包括小鼠、斑馬魚等。
3.1 斑馬魚轉基因模型
斑馬魚模型的優點包括生命周期短、成本低、體積小、后代繁殖數量多、肝臟再生能力強、基因序列與人類基因序列高度相似等[22]，允許進行大樣本的實驗研究，可以方便快捷地建立轉基因動物模型。有研究[23]顯示，80%的Twist1a-ERT2/xmrk雙轉基因斑馬魚模型 ［一種他莫昔芬誘導的Twist1a-ERT2轉基因斑馬魚系，通過將Twist1a-ERT2與xmrk（酪氨酸激酶型受體）轉基因斑馬魚雜交，可發展為肝細胞癌］ 在Twist1a-ERT2激活后5 d內，紅色熒光蛋白mCherry標記的肝細胞從肝臟自發擴散到整個腹部區域和尾部區域。此外，透明的斑馬魚攜帶熒光蛋白，可以進行實時可視化研究，直接觀察腫瘤的發生、發展和消退過程，研究人員能夠觀察和追蹤特定細胞，并對基因表達進行分析[24]；與嚙齒動物相比，斑馬魚模型的另一個巨大優勢是能夠進行高通量的體內化學藥物的篩選，例如用于新藥發現或臨床前藥物篩選，因此，這些屬性使斑馬魚轉基因動物模型成為研究肝癌藥物篩選的有效工具[25]。斑馬魚模型的缺點是其肝臟非常小，這導致在轉錄組學或蛋白質印跡進行分析的組織量較少，可能導致某些蛋白檢測不足[26]。
3.2 小鼠轉基因模型
人類和小鼠肝癌的遺傳特征是不同的，一部分轉基因小鼠模型密切再現了人類肝癌的基因表達譜，而另一部分轉基因模型則沒有，通過比較人類和小鼠肝癌的基因表達譜可以有效地確定合適的轉基因模型來研究人類肝癌的某些亞型，例如c-Myc原癌基因/轉化生長因子轉基因小鼠模型的基因表達譜與人類肝癌低分化亞型的基因表達譜極為相似[15]。 Cigliano等[27]通過SB轉座子系統結合通過流體動力學的方式將質粒pT3EF1a-c-Myc注射到6～8周齡小鼠的側尾靜脈中構建小鼠轉基因模型，在6周時建模成功。Liu等[28]使用流體動力學注射和轉座子系統建立了一種Akt蛋白激酶/N-Ras癌基因誘導的新型肝癌小鼠模型，發現該肝癌模型中的腫瘤進展比大多數化學誘導和轉基因模型中的腫瘤進展更快，而且能夠在模型中觀察到CD8 T細胞和免疫抑制細胞群的耗盡狀態，可以作為評估肝癌免疫治療的臨床前模型。
轉基因動物模型的主要優勢在于已知的特異性基因突變，通過轉基因模型可以深入了解特定蛋白質和信號通路在肝癌發生中的作用，還可以用于驗證候選癌基因和藥物靶點，所以對于抗肝癌分子靶向藥物的篩選尤為重要。此外，轉基因模型與其他模型相比的另一個主要優點是，肝癌可在免疫功能正常的腫瘤微環境中自然產生，有助于了解動物模型的腫瘤微環境對腫瘤的影響[29]。 然而，轉基因肝癌動物模型的缺點是成本高、耗時長、區域或組織特異性不高，而且沒有纖維化/肝硬化的發展過程[30]；相反，人類肝癌通常是在纖維化的背景下發展起來的，而且人類肝癌具有異質性，具有廣泛的基因和通路改變。因此，盡管肝癌的轉基因動物模型已經在重現人類肝癌方面取得了進步，但由此產生的自發性腫瘤沒有慢性炎癥和纖維化的循序漸進的過程，所以并不能替代人類肝癌[6]。雖然大多數轉基因動物模型是耗時和昂貴的，但是近年來隨著CRISPR-Cas9技術的出現，明顯改善了這一缺點，但CRISPR-Cas9技術應以肝纖維化或肝硬化為背景，才能準確反映人類肝癌的情況[31]。 Chung等[32]在肝臟纖維化的背景下開發了一種肝癌轉基因小鼠模型，將編碼c-Myc癌基因加shp53的轉座子與表達SB轉座酶的質粒混合，采用流體動力學注射法經小鼠尾靜脈注射建立肝癌轉基因模型，然后用CCl4誘發肝臟慢性損傷形成肝臟纖維化的背景，從而模擬出了人類肝癌發展的過程。
在轉基因動物模型中，肝癌通常在特定的肝臟微環境中自發產生，具有完整的免疫系統，其是移植性動物模型的有效替代方案，可用于抗腫瘤免疫反應的研究[33]，但是該模型沒有纖維化和肝硬化的背景，需要結合慢性肝損傷的基礎上建立轉基因動物模型才更加完善。
4 移植型動物模型
移植型肝癌動物模型是指將動物或人體內的肝癌細胞或肝癌組織移植到實驗動物體內而建立的模型，這種模型的優點是：腫瘤細胞的增長速度高度一致，也可以根據實驗目的去控制腫瘤的位置和大小，實驗動物的個體差異很小，接種的存活率高，并且試驗周期通常比較短，試驗條件易于控制，便于對療效進行客觀的判斷[34]。根據移植部位不同可以分為原位移植和異位移植；根據腫瘤來源不同又可以分為同種移植和異種移植。
4.1 原位移植
原位移植是指將肝癌細胞或者肝癌組織直接種植于實驗動物的肝臟內，原位移植模型為腫瘤提供了最適宜的生長環境，特別是肝臟微血管的形成以及免疫細胞和腫瘤的相互作用[35]，能模擬人類肝癌的發生、發展、擴散、侵襲、轉移等過程。但原位移植操作難度大、技術要求高、難以測量腫瘤大小和監測腫瘤進展、監測腫瘤生長需要腹部成像等[36]。隨著成像技術的進步，建立了表達熒光素酶的人肝癌細胞系，通過使用體內生物發光成像跟蹤原位模型中的腫瘤生長[37]；磁共振成像或正電子發射斷層掃描等成像方法也經常被用于評估原位移植模型中腫瘤的演變。原位移植模型主要用于研究肝癌遠處轉移的機制、腫瘤與宿主的相互作用、免疫治療的效果等。
4.2 異位移植
異位移植又分為皮下移植、靜脈移植、脾臟移植、腹腔移植等，其中皮下移植具有操作簡單、成功率高、術中死亡率低、可重復性高、便于觀察腫瘤的生長情況、準確測量腫瘤大小的優點，可以用于抗癌藥物的篩選。例如在免疫功能正常的小鼠側腹壁皮下注射小鼠肝癌細胞系HCa-1成功構建肝癌動物模型，并證明了放射治療和免疫檢查點阻斷劑之間的協同抗腫瘤作用[38]；但是腫瘤在皮下生長不能模擬腫瘤原位生長的微環境[39]。靜脈移植主要是通過小鼠尾靜脈注射腫瘤細胞，可模擬腫瘤的血行轉移過程，可觀察腫瘤的侵襲轉移能力，但是操作困難、成功率低[40]，所以很少有研究者采用。一般小鼠肝癌細胞皮下移植模型主要用于評價新藥的抗腫瘤作用。
4.3 同種移植動物模型
通過異位或原位注射的方法將小鼠肝癌細胞系或小鼠肝癌組織移植到近交系具有相同遺傳背景的免疫功能正常的小鼠中，該模型能夠保留宿主的正常免疫功能，是免疫檢查點阻斷劑的臨床前開發、闡明抗腫瘤免疫反應和評價免疫治療的關鍵工具[41]。一項研究[42]將轉染程序性死亡受體-配體1的小鼠肝癌細胞用原位同源移植的方法注射到免疫功能正常的小鼠肝臟中成功建立了肝癌同種移植模型，用于研究抗程序性死亡受體1治療期間T細胞功能的改變。肝癌的同源小鼠原位模型還可用于研究肝癌中復雜的腫瘤-宿主間的相互作用，Zhao等[43]建立同源小鼠原位移植模型研究了肝星狀細胞的免疫抑制特性及其對肝癌發生發展的作用，發現靶向肝星狀細胞可能是免疫治療的新方向。然而，小鼠和人類在基因組、免疫反應和腫瘤微環境方面存在差異，發生在小鼠肝癌中的突變可能與人原發性肝癌中的突變無關，同種移植模型的免疫力和腫瘤微環境來自小鼠而非人類，故而難以將小鼠肝癌的免疫反應及免疫治療藥物運用于臨床[41]。
4.4 異種移植動物模型
通過異位或原位移植的方法將培養的人肝癌細胞系或人肝癌組織植入免疫缺陷的小鼠中來建立，異種移植的一個優點是使用攜帶人類遺傳物質的人類腫瘤組織或腫瘤細胞進行研究，這樣更能代表人類肝癌的遺傳異質性[44]。其中患者來源的腫瘤組織是異種移植模型的首選，因為其保留了人類癌癥的組織學、分子和遺傳特征，這被稱為患者來源的異種移植物模型（patient-derived xenografts，PDX） [45]，PDX模型是臨床前個體化藥物開發的有前途的工具，因為它可以模擬人類原發性肝癌的腫瘤微環境，患者原發性肝癌活檢組織的病理組織學、分子和遺傳學特征在PDX模型中得到了很好地保留，從而能夠預測肝癌患者對治療的反應[46]。Blumer等[47]將穿刺活檢的54例人肝癌組織皮下移植到聯合免疫缺陷的小鼠中建立PDX模型，總體成功率約20%，并證明通過連續傳代可以保留活檢的肝癌的特征。而人類腫瘤細胞系在體外培養過程中可能發生遺傳變異，并且并不總是穩定地表達人類肝癌的基因表型，使其與在患者中觀察到的癌癥有一定差距[29]，如Gao等[48]通過對1 000個PDX腫瘤模型的高通量藥物篩查，揭示了患者對藥物治療產生耐藥的新機制，并表明PDX模型比細胞系移植模型能更準確地評估某些治療方式的臨床效果。異種移植模型的缺點是異種移植的動物存在免疫缺陷，不能反映腫瘤免疫監視的動態過程；免疫功能低下的小鼠缺乏免疫系統的主要成分，不能完全模仿人類肝癌的抗腫瘤免疫反應。為了研究癌癥免疫療法，重現人體免疫系統的復雜性，實現這一目標的一種策略就是使用人源化小鼠模型。
5 人源化動物模型
近年來，開發了具有人源化免疫系統的小鼠，開辟了腫瘤學領域的研究，這是一種既包含人類正常免疫系統又包含人類腫瘤組織的動物模型，該模型再現了復雜的人體免疫系統并模擬更真實的腫瘤微環境，對于評估免疫治療藥物的療效和安全性至關重要[49]。通過將人的CD34+造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSC）、外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）或免疫器官移植到重度免疫缺陷小鼠（NPG小鼠）體內，即把小鼠的免疫系統人源化，獲得具有人源化造血/免疫系統的小鼠，然后將人類腫瘤組織或人類腫瘤細胞移植到該小鼠體內即可獲得人源化小鼠模型[50]，用于研究免疫系統與腫瘤之間的相互作用、免疫療法在抗腫瘤中的作用、揭示免疫治療耐受和副作用的潛在機制等。如Cogels等[51]通過人源化小鼠模型的建立證明了免疫檢查點抑制劑帕博利珠單抗和伊匹單抗的抗腫瘤效果和副作用。然而，人源化動物模型建立和應用仍面臨諸多挑戰，包括免疫細胞與腫瘤之間的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）不相容性、殘留的小鼠先天免疫細胞、特異性細胞因子的缺乏等；此外，PBMC移植模型的免疫細胞對受體小鼠產生免疫攻擊，會發生移植物抗宿主病（graft versus-host disease，GVHD），并在幾周后導致小鼠死亡，因此，PBMC模型僅適用于短期研究[52]。目前正在評估是否能克服GVHD反應來改進該模型。有文獻[53]報道，MHCⅠ類和MHCⅡ類缺陷NOG小鼠已被證明可以降低這種移植物抗宿主的反應。人類CD34+ HSC移植模型的局限性是B細胞成熟通路發育受阻，將會產生不完全成熟的B細胞進而B細胞不能產生足夠的抗體，人源T細胞在小鼠胸腺上發育受到小鼠MHC的限制，T細胞無法針對某些腫瘤特異性抗原進行反應。
總的來說，人源化小鼠模型作為一種有效的免疫治療評價工具，可以模擬腫瘤的發生、發展和轉移過程，模擬人類免疫微環境，是免疫腫瘤學領域一種有前途的臨床前模型，它的使用不僅將有利于腫瘤免疫療法的開發，而且可能增加對腫瘤機制的理解，為開發新的治療靶點和克服免疫治療耐藥性打開新的大門。
6 結論
動物模型是用于了解疾病發病機制，確定治療靶點和篩選有效藥物的成熟工具。由于肝癌的病因復雜且存在腫瘤異質性，構建與人類疾病環境相似的肝癌動物模型是一項挑戰。目前，沒有一種動物模型能夠完全概括人類腫瘤的遺傳學和病理生理學特征，肝癌的動物模型各有其優勢和局限性，研究者應根據自身研究目的選擇不同的動物模型，了解現有動物模型的局限性和優勢將有利于探索其在人類腫瘤的早期診斷和治療中的作用，最終將動物模型的研究成果應用于臨床，從而降低醫療保健費用并提高患者生活質量。肝癌研究的未來趨勢與基于腫瘤異質性的個體化治療有關，這些治療能夠對肝癌發生的關鍵分子途徑和基因突變提供準確的干預。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益沖突。
作者貢獻聲明：王娜娜負責文獻檢索、文章撰寫及投稿；馮春林負責文章質量控制、指導文章撰寫和修改。
肝細胞癌（簡稱“肝癌”）是最常見的原發性肝癌，是全球第6大常見癌癥和第3大癌癥死亡原因[1]。肝癌的主要危險因素包括乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、進食黃曲霉毒素污染的食物、長期大量飲酒、2型糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝病、吸煙等[2]，其發病機制目前仍不明確。肝癌動物模型的建立對于該病的基礎研究和臨床轉化研究都至關重要，可提高對肝癌的病理生理學的理解并探索這種疾病的分子驅動因素。此外，動物模型是研究肝癌發生發展及臨床前藥物試驗的重要載體，因此，建立接近人類肝癌臨床特征的動物模型對于研究肝癌復發轉移機制及發掘新的治療方法具有重要現實意義。
肝癌動物模型可分為自發型動物模型、誘發型動物模型、基因修飾型動物模型、移植型動物模型和人源化動物模型[3-4]。 不同肝癌動物模型的病因、發病機制以及病理生理學變化各不相同，具體取決于研究的類型及目的。了解每種肝癌動物模型的優缺點對于研究肝癌發病機制、治療、臨床前藥物篩選等方面具有重要的意義，下面將分別闡述不同肝癌動物模型的優缺點。
1 自發型動物模型
自發型動物模型是指無人工干預的情況下自然發病形成的疾病模型，疾病的發生發展與人類肝癌相似，適合用于研究肝癌的病因及發病機制。自發型肝癌模型最大的優勢是排除了人為因素的干擾，在發生肝癌的動物中可更真實地反映自然條件下肝癌的易感性程度、致癌環境因素及促癌物質的積累程度，類似于臨床上的人類肝癌；然而自發模型也存在一些缺點，如該模型建模成功率低且不穩定，時間長，荷瘤動物個體差異大（性別、體質量、腫瘤發生時間、腫瘤大小、腫瘤部位等），實驗數量少、實驗設計困難，導致實驗重復性差，結果難以預測，實際應用價值不大，所以一般很少采用[4]。
2 誘發型動物模型
誘發型肝癌動物模型通常是利用單一或聯合應用多種化學藥物、生物毒素等直接或間接作用于動物的肝臟，產生慢性炎癥反應，使之在數月內發生肝癌。常用的誘導方法有飲食、灌胃、吸入氣體、腹腔注射或皮下注射等，常用于建模的動物包括小鼠、大鼠等。該模型的優點是操作簡單，癌變率高且易于操控，可模擬人類肝癌的發生發展過程，即由肝纖維化、脂肪變性、肝炎、肝硬化到肝癌的過程。 Uehara等[5]用二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）聯合四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導方案模仿人類肝癌的病理生理過程，使小鼠發生肝臟遺傳毒性損傷和慢性纖維化，為研究炎癥和纖維化對肝癌的作用機制提供了有用的實驗方法，這對于模擬人類腫瘤微環境至關重要，是構建肝癌動物模型的理想方法之一。但是目前常規的誘發型動物模型的缺點是誘發過程中肝癌起病隱匿，建模周期長，病死率高，肝癌出現的時間、部位、病灶數等在個體之間表現不均一，腫瘤遺傳背景未知等[6]。所以為了加劇肝損傷和縮短建模時間，有研究者[7]認為，肝臟多種損傷誘導的協同作用不僅可以加速實驗動物肝癌的發生，而且可能更適合臨床前治療或預防研究；另有實驗研究[8]證實，在DEN/硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導的小鼠中加入高脂飲食與單獨使用DEN/TAA誘導劑相比，前者可導致小鼠在24周齡時產生更多的肝癌病灶以及發生更多的肝內炎癥和纖維化。目前的聯合誘導肝癌動物模型包括代謝紊亂聯合化學毒物誘導模型[8]、乙醇聯合化學毒物誘導模型[9]、基因突變聯合化學毒物誘導模型[10]等。化學誘導模型在揭示潛在的致癌機制方面是可靠的，許多誘導劑與肝癌的發生有關，根據其作用機制分為遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性致癌物，以下介紹幾種常見的誘導劑。
2.1 遺傳毒性致癌物
遺傳毒性致癌物通過形成共價鍵直接與DNA相互作用，形成DNA-致癌物復合物，引起基因突變或DNA損傷，從而導致癌變[11]。 常用的遺傳毒性致癌物包括DEN、2-乙酰氨基芴、黃曲霉毒素B1等[12]，其中DEN是目前臨床前研究中用于誘導肝癌動物模型最廣泛的遺傳毒性致癌物，對肝臟作用專一，有較強的親和力，操作簡單，成功率高，價格相對便宜，故在肝癌的研究中，優于其他化學誘癌劑，是迄今應用最廣泛的一種誘發肝癌的化學誘導劑。DEN誘導的肝癌模型所需的時間依賴的因素包括給藥劑量、給藥頻率、性別、年齡、小鼠品系、腫瘤微環境、免疫狀態等。 DEN誘導肝癌的經典小鼠模型是對2周齡的小鼠給予單次腹腔內注射DEN（1.25～25 mg/kg體質量），可導致小鼠在8～12個月左右發生肝癌[12]，但是單次注射DEN誘導的小鼠肝癌模型沒有出現大多數肝癌患者中發生的纖維化和肝硬化特征，所以為了實現發生肝纖維化和肝硬化的背景特征，其一，可以使用單次注射DEN聯合CCl4重復給藥的方式可促進肝臟發生纖維化[5, 13]；其二，可使用DEN長期注射的方法促進小鼠肝臟的炎癥和纖維化改變，從而模擬人類肝癌的病理生理學變化[14]。此外，基因組學分析表明，DEN誘導的小鼠肝癌中的基因表達模式與人類肝癌預后較差亞型的基因表達模式最相似[15]，但Dow等[16]的研究結果卻認為DEN誘導的動物模型應該避免作為人類肝癌的模型，因為DEN誘導腫瘤產生的基因組改變與人類肝癌基因組改變差異極大，并且DEN誘導的腫瘤具有在基因、遺傳途徑和轉錄組水平上明顯不同的分子譜；在一項關于DEN誘導小鼠肝癌的研究[17]中報道，Braf突變是C57BL/6小鼠發生肝臟組織癌變的主要驅動因素，人類肝癌中最常改變的基因是TP53和CTNNB1，但是在DEN誘導的動物模型中未發現TP53和CTNNB1突變。因此，DEN誘導的動物模型是否應用于研究人類肝癌的發病機制仍然具有爭議。
2.2 非遺傳毒性致癌物
CCl4、TAA、苯巴比妥等非遺傳毒性致癌物與DNA沒有直接的相互作用，它們通過破壞細胞結構和改變細胞增殖來引起肝臟組織損傷，從而導致炎癥、肝纖維化和肝癌的發生[3]。 對于單獨DEN給藥方案，隨著小鼠年齡的增長，小鼠的肝癌發病率逐漸降低，而且對新出生小鼠給予DEN后肝癌發展的潛伏期仍然很長，所以就需要使用不同類型的“啟動子”（即非遺傳毒性致癌物、高脂飲食等）和多階段聯合方案[18]，DEN和CCl4的組合通常用于誘導肝癌，在纖維化的背景下建立肝癌的可重復小鼠模型[19]，可更能模擬真實世界人類肝癌的發病過程，更有利于研究肝癌的腫瘤微環境及免疫藥物的篩選。
總之，化學誘導模型模擬了人肝癌的遺傳、免疫和環境特征，包括DNA損傷、基因改變、炎癥反應、纖維化、腫瘤微環境等；人類肝癌的發生大多數是肝炎–肝硬化–肝癌三部曲的發展過程，為了建立與人類肝癌發生發展和腫瘤微環境更為相似的動物模型，需要使用聯合誘導的方法建立慢性肝炎、肝纖維化的背景，但是，盡管已經使用了各種致癌物質的組合來縮短腫瘤誘導的時間，但肝癌的發生仍需要數月才能建立，所以一定程度上限制了研究人員的使用。
3 轉基因型動物模型
在過去幾十年中，轉基因和基因靶向技術的發展促進了研究腫瘤生物學的轉基因模型的產生，它在闡明腫瘤發生、進展、治療反應和先天耐藥性的機制方面發揮了關鍵作用。轉基因模型最常見的方法是通過基因編輯技術激活/過表達癌基因或滅活/去除抑癌基因，從而誘導腫瘤形成。其中過表達癌基因可以使用SB轉座子系統與流體動力學尾靜脈注射系統（hydrodynamic tail vein injection，HTVI）一起將癌基因整合到小鼠基因組中，以使其構成過表達并隨后誘導肝癌的發生[20]。而規律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和其相關蛋白9（associated protein 9，Cas9）共同組成了一套系統，即CRISPR-Cas9系統，是最新出現的一種由RNA指導的Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術，可用于特異性基因的敲除，通過HTVI能夠將CRISPR-Cas9系統編碼的DNA質粒遞送到小鼠肝臟，以精確地敲除腫瘤抑制基因并誘導肝癌的形成。特定位點的重組酶系統（causes recombination-locus of X-over P1，Cre-loxP）是一種強大的特異性基因敲除工具，Cre重組酶與限制酶相似，能夠特異性識別loxP位點，可使某一基因在特定器官或組織以及特定的時段中被剔除，可減輕由于在全體細胞中敲除產生的副作用[21]，利用HTVI傳遞Cre重組酶，可以在小鼠肝臟中實現Cre-loxP介導的條件性敲除。用于構建肝癌轉基因模型的動物通常包括小鼠、斑馬魚等。
3.1 斑馬魚轉基因模型
斑馬魚模型的優點包括生命周期短、成本低、體積小、后代繁殖數量多、肝臟再生能力強、基因序列與人類基因序列高度相似等[22]，允許進行大樣本的實驗研究，可以方便快捷地建立轉基因動物模型。有研究[23]顯示，80%的Twist1a-ERT2/xmrk雙轉基因斑馬魚模型 ［一種他莫昔芬誘導的Twist1a-ERT2轉基因斑馬魚系，通過將Twist1a-ERT2與xmrk（酪氨酸激酶型受體）轉基因斑馬魚雜交，可發展為肝細胞癌］ 在Twist1a-ERT2激活后5 d內，紅色熒光蛋白mCherry標記的肝細胞從肝臟自發擴散到整個腹部區域和尾部區域。此外，透明的斑馬魚攜帶熒光蛋白，可以進行實時可視化研究，直接觀察腫瘤的發生、發展和消退過程，研究人員能夠觀察和追蹤特定細胞，并對基因表達進行分析[24]；與嚙齒動物相比，斑馬魚模型的另一個巨大優勢是能夠進行高通量的體內化學藥物的篩選，例如用于新藥發現或臨床前藥物篩選，因此，這些屬性使斑馬魚轉基因動物模型成為研究肝癌藥物篩選的有效工具[25]。斑馬魚模型的缺點是其肝臟非常小，這導致在轉錄組學或蛋白質印跡進行分析的組織量較少，可能導致某些蛋白檢測不足[26]。
3.2 小鼠轉基因模型
人類和小鼠肝癌的遺傳特征是不同的，一部分轉基因小鼠模型密切再現了人類肝癌的基因表達譜，而另一部分轉基因模型則沒有，通過比較人類和小鼠肝癌的基因表達譜可以有效地確定合適的轉基因模型來研究人類肝癌的某些亞型，例如c-Myc原癌基因/轉化生長因子轉基因小鼠模型的基因表達譜與人類肝癌低分化亞型的基因表達譜極為相似[15]。 Cigliano等[27]通過SB轉座子系統結合通過流體動力學的方式將質粒pT3EF1a-c-Myc注射到6～8周齡小鼠的側尾靜脈中構建小鼠轉基因模型，在6周時建模成功。Liu等[28]使用流體動力學注射和轉座子系統建立了一種Akt蛋白激酶/N-Ras癌基因誘導的新型肝癌小鼠模型，發現該肝癌模型中的腫瘤進展比大多數化學誘導和轉基因模型中的腫瘤進展更快，而且能夠在模型中觀察到CD8 T細胞和免疫抑制細胞群的耗盡狀態，可以作為評估肝癌免疫治療的臨床前模型。
轉基因動物模型的主要優勢在于已知的特異性基因突變，通過轉基因模型可以深入了解特定蛋白質和信號通路在肝癌發生中的作用，還可以用于驗證候選癌基因和藥物靶點，所以對于抗肝癌分子靶向藥物的篩選尤為重要。此外，轉基因模型與其他模型相比的另一個主要優點是，肝癌可在免疫功能正常的腫瘤微環境中自然產生，有助于了解動物模型的腫瘤微環境對腫瘤的影響[29]。 然而，轉基因肝癌動物模型的缺點是成本高、耗時長、區域或組織特異性不高，而且沒有纖維化/肝硬化的發展過程[30]；相反，人類肝癌通常是在纖維化的背景下發展起來的，而且人類肝癌具有異質性，具有廣泛的基因和通路改變。因此，盡管肝癌的轉基因動物模型已經在重現人類肝癌方面取得了進步，但由此產生的自發性腫瘤沒有慢性炎癥和纖維化的循序漸進的過程，所以并不能替代人類肝癌[6]。雖然大多數轉基因動物模型是耗時和昂貴的，但是近年來隨著CRISPR-Cas9技術的出現，明顯改善了這一缺點，但CRISPR-Cas9技術應以肝纖維化或肝硬化為背景，才能準確反映人類肝癌的情況[31]。 Chung等[32]在肝臟纖維化的背景下開發了一種肝癌轉基因小鼠模型，將編碼c-Myc癌基因加shp53的轉座子與表達SB轉座酶的質粒混合，采用流體動力學注射法經小鼠尾靜脈注射建立肝癌轉基因模型，然后用CCl4誘發肝臟慢性損傷形成肝臟纖維化的背景，從而模擬出了人類肝癌發展的過程。
在轉基因動物模型中，肝癌通常在特定的肝臟微環境中自發產生，具有完整的免疫系統，其是移植性動物模型的有效替代方案，可用于抗腫瘤免疫反應的研究[33]，但是該模型沒有纖維化和肝硬化的背景，需要結合慢性肝損傷的基礎上建立轉基因動物模型才更加完善。
4 移植型動物模型
移植型肝癌動物模型是指將動物或人體內的肝癌細胞或肝癌組織移植到實驗動物體內而建立的模型，這種模型的優點是：腫瘤細胞的增長速度高度一致，也可以根據實驗目的去控制腫瘤的位置和大小，實驗動物的個體差異很小，接種的存活率高，并且試驗周期通常比較短，試驗條件易于控制，便于對療效進行客觀的判斷[34]。根據移植部位不同可以分為原位移植和異位移植；根據腫瘤來源不同又可以分為同種移植和異種移植。
4.1 原位移植
原位移植是指將肝癌細胞或者肝癌組織直接種植于實驗動物的肝臟內，原位移植模型為腫瘤提供了最適宜的生長環境，特別是肝臟微血管的形成以及免疫細胞和腫瘤的相互作用[35]，能模擬人類肝癌的發生、發展、擴散、侵襲、轉移等過程。但原位移植操作難度大、技術要求高、難以測量腫瘤大小和監測腫瘤進展、監測腫瘤生長需要腹部成像等[36]。隨著成像技術的進步，建立了表達熒光素酶的人肝癌細胞系，通過使用體內生物發光成像跟蹤原位模型中的腫瘤生長[37]；磁共振成像或正電子發射斷層掃描等成像方法也經常被用于評估原位移植模型中腫瘤的演變。原位移植模型主要用于研究肝癌遠處轉移的機制、腫瘤與宿主的相互作用、免疫治療的效果等。
4.2 異位移植
異位移植又分為皮下移植、靜脈移植、脾臟移植、腹腔移植等，其中皮下移植具有操作簡單、成功率高、術中死亡率低、可重復性高、便于觀察腫瘤的生長情況、準確測量腫瘤大小的優點，可以用于抗癌藥物的篩選。例如在免疫功能正常的小鼠側腹壁皮下注射小鼠肝癌細胞系HCa-1成功構建肝癌動物模型，并證明了放射治療和免疫檢查點阻斷劑之間的協同抗腫瘤作用[38]；但是腫瘤在皮下生長不能模擬腫瘤原位生長的微環境[39]。靜脈移植主要是通過小鼠尾靜脈注射腫瘤細胞，可模擬腫瘤的血行轉移過程，可觀察腫瘤的侵襲轉移能力，但是操作困難、成功率低[40]，所以很少有研究者采用。一般小鼠肝癌細胞皮下移植模型主要用于評價新藥的抗腫瘤作用。
4.3 同種移植動物模型
通過異位或原位注射的方法將小鼠肝癌細胞系或小鼠肝癌組織移植到近交系具有相同遺傳背景的免疫功能正常的小鼠中，該模型能夠保留宿主的正常免疫功能，是免疫檢查點阻斷劑的臨床前開發、闡明抗腫瘤免疫反應和評價免疫治療的關鍵工具[41]。一項研究[42]將轉染程序性死亡受體-配體1的小鼠肝癌細胞用原位同源移植的方法注射到免疫功能正常的小鼠肝臟中成功建立了肝癌同種移植模型，用于研究抗程序性死亡受體1治療期間T細胞功能的改變。肝癌的同源小鼠原位模型還可用于研究肝癌中復雜的腫瘤-宿主間的相互作用，Zhao等[43]建立同源小鼠原位移植模型研究了肝星狀細胞的免疫抑制特性及其對肝癌發生發展的作用，發現靶向肝星狀細胞可能是免疫治療的新方向。然而，小鼠和人類在基因組、免疫反應和腫瘤微環境方面存在差異，發生在小鼠肝癌中的突變可能與人原發性肝癌中的突變無關，同種移植模型的免疫力和腫瘤微環境來自小鼠而非人類，故而難以將小鼠肝癌的免疫反應及免疫治療藥物運用于臨床[41]。
4.4 異種移植動物模型
通過異位或原位移植的方法將培養的人肝癌細胞系或人肝癌組織植入免疫缺陷的小鼠中來建立，異種移植的一個優點是使用攜帶人類遺傳物質的人類腫瘤組織或腫瘤細胞進行研究，這樣更能代表人類肝癌的遺傳異質性[44]。其中患者來源的腫瘤組織是異種移植模型的首選，因為其保留了人類癌癥的組織學、分子和遺傳特征，這被稱為患者來源的異種移植物模型（patient-derived xenografts，PDX） [45]，PDX模型是臨床前個體化藥物開發的有前途的工具，因為它可以模擬人類原發性肝癌的腫瘤微環境，患者原發性肝癌活檢組織的病理組織學、分子和遺傳學特征在PDX模型中得到了很好地保留，從而能夠預測肝癌患者對治療的反應[46]。Blumer等[47]將穿刺活檢的54例人肝癌組織皮下移植到聯合免疫缺陷的小鼠中建立PDX模型，總體成功率約20%，并證明通過連續傳代可以保留活檢的肝癌的特征。而人類腫瘤細胞系在體外培養過程中可能發生遺傳變異，并且并不總是穩定地表達人類肝癌的基因表型，使其與在患者中觀察到的癌癥有一定差距[29]，如Gao等[48]通過對1 000個PDX腫瘤模型的高通量藥物篩查，揭示了患者對藥物治療產生耐藥的新機制，并表明PDX模型比細胞系移植模型能更準確地評估某些治療方式的臨床效果。異種移植模型的缺點是異種移植的動物存在免疫缺陷，不能反映腫瘤免疫監視的動態過程；免疫功能低下的小鼠缺乏免疫系統的主要成分，不能完全模仿人類肝癌的抗腫瘤免疫反應。為了研究癌癥免疫療法，重現人體免疫系統的復雜性，實現這一目標的一種策略就是使用人源化小鼠模型。
5 人源化動物模型
近年來，開發了具有人源化免疫系統的小鼠，開辟了腫瘤學領域的研究，這是一種既包含人類正常免疫系統又包含人類腫瘤組織的動物模型，該模型再現了復雜的人體免疫系統并模擬更真實的腫瘤微環境，對于評估免疫治療藥物的療效和安全性至關重要[49]。通過將人的CD34+造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSC）、外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）或免疫器官移植到重度免疫缺陷小鼠（NPG小鼠）體內，即把小鼠的免疫系統人源化，獲得具有人源化造血/免疫系統的小鼠，然后將人類腫瘤組織或人類腫瘤細胞移植到該小鼠體內即可獲得人源化小鼠模型[50]，用于研究免疫系統與腫瘤之間的相互作用、免疫療法在抗腫瘤中的作用、揭示免疫治療耐受和副作用的潛在機制等。如Cogels等[51]通過人源化小鼠模型的建立證明了免疫檢查點抑制劑帕博利珠單抗和伊匹單抗的抗腫瘤效果和副作用。然而，人源化動物模型建立和應用仍面臨諸多挑戰，包括免疫細胞與腫瘤之間的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）不相容性、殘留的小鼠先天免疫細胞、特異性細胞因子的缺乏等；此外，PBMC移植模型的免疫細胞對受體小鼠產生免疫攻擊，會發生移植物抗宿主病（graft versus-host disease，GVHD），并在幾周后導致小鼠死亡，因此，PBMC模型僅適用于短期研究[52]。目前正在評估是否能克服GVHD反應來改進該模型。有文獻[53]報道，MHCⅠ類和MHCⅡ類缺陷NOG小鼠已被證明可以降低這種移植物抗宿主的反應。人類CD34+ HSC移植模型的局限性是B細胞成熟通路發育受阻，將會產生不完全成熟的B細胞進而B細胞不能產生足夠的抗體，人源T細胞在小鼠胸腺上發育受到小鼠MHC的限制，T細胞無法針對某些腫瘤特異性抗原進行反應。
總的來說，人源化小鼠模型作為一種有效的免疫治療評價工具，可以模擬腫瘤的發生、發展和轉移過程，模擬人類免疫微環境，是免疫腫瘤學領域一種有前途的臨床前模型，它的使用不僅將有利于腫瘤免疫療法的開發，而且可能增加對腫瘤機制的理解，為開發新的治療靶點和克服免疫治療耐藥性打開新的大門。
6 結論
動物模型是用于了解疾病發病機制，確定治療靶點和篩選有效藥物的成熟工具。由于肝癌的病因復雜且存在腫瘤異質性，構建與人類疾病環境相似的肝癌動物模型是一項挑戰。目前，沒有一種動物模型能夠完全概括人類腫瘤的遺傳學和病理生理學特征，肝癌的動物模型各有其優勢和局限性，研究者應根據自身研究目的選擇不同的動物模型，了解現有動物模型的局限性和優勢將有利于探索其在人類腫瘤的早期診斷和治療中的作用，最終將動物模型的研究成果應用于臨床，從而降低醫療保健費用并提高患者生活質量。肝癌研究的未來趨勢與基于腫瘤異質性的個體化治療有關，這些治療能夠對肝癌發生的關鍵分子途徑和基因突變提供準確的干預。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益沖突。
作者貢獻聲明：王娜娜負責文獻檢索、文章撰寫及投稿；馮春林負責文章質量控制、指導文章撰寫和修改。