引用本文： 鄧肇達, 王靜, 李林成, 鄒文博, 劉榮. DNA交聯修復基因DCLRE1B對肝癌細胞侵襲和遷移影響的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(5): 585-593. doi: 10.7507/1007-9424.202111066 復制
鏈間交聯（interstrand cross-linking，ICL）是最具細胞毒性的 DNA 損傷之一，能共價結合2條DNA鏈并抑制細胞遺傳物質的轉錄和復制[1-2]。除天然存在的內源性（例如乙醛，糖酵解途徑的代謝物）和外源性物質（紫外線）能夠誘導 ICL外，一些抗腫瘤治療的化合物如順鉑等，也會導致ICL[3-4]。 1980 年初，人類發現了幾種對 ICL 誘導劑具有特異性超敏反應的釀酒酵母突變體。其中有兩種是對補骨脂素（psoralen，PSO）和長波紫外線敏感的突變體和對氮芥子氣敏感（sensitive nitrogen mustard，SNM）的突變體。PSO2編碼一種分子量為7.6×103的蛋白質（PSO2p），該蛋白質對于酵母中由 ICL 修復產生的雙鏈斷裂（double strand break，DSB） 的修復必不可少[5]。在哺乳動物細胞中，已發現3種與PSO2p序列具相似性的蛋白質：SNM1A、SNM1B/Apollo 和SNM1C/Artemis ［人類基因符號：DNA交聯修復（DNA cross-link repair，DCLRE）1A、1B 和 1C）］。然而內源性DCLRE1B的表達水平非常低，通常難以檢測[6-7]。上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transformation， EMT）是一個多步驟的生物學過程。 腫瘤EMT主要表現為細胞E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）減少，N-鈣粘蛋白（N-cadherin，N-cad）和波形蛋白（Vimentin）的增多，使得上皮表型缺失，而表現為間充質表型[8]。
國內外鮮有人研究DCLRE1B與肝癌之間的關系，為了進一步探究DCLRE1B對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究通過生物信息分析DCLRE1B在肝癌樣本中的mRNA相對表達量及其與臨床預后的相關性，之后通過構建穩定敲除DCLRE1B的慢病毒，靶向沉默肝癌細胞中 DCLRE1B的表達，探究DCLRE1B對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響及其作用機制，旨在為肝癌的治療提供一定的理論基礎。
1 材料和方法
1.1 主要試劑、材料和設備
肝癌細胞 Huh-7和HepG2 購自中國科學院（上海）細胞庫；杜氏改良培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、細胞轉染試劑（LipofectamineTM 2000）、總RNA提取試劑（total RNA extractor，TRIzol）、微量核酸蛋白測定儀和細胞培養箱均購自 Thermo Fisher公司；反轉錄試劑盒購自大連Takara公司；實時熒光定量-聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自潤康生物公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）試劑、放射免疫沉淀測定（radio-immunoprecipitation assay, RIPA）試劑、蛋白定量測定試劑盒（bicinchoninic acid，BCA）和蛋白免疫印跡（Western blot）二抗試劑均購自碧云天公司；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購自ProteinTech公司；兔抗人DCLRE1B多克隆抗體購自Biorbyt公司；所有的熒光定量引物均購自擎科生物（北京）公司；DCLRE1B質粒沉默表達載體系統購自金拓思（北京）公司；Transwell小室購自Corning公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）購自Millipore 公司；普通PCR儀和熒光定量PCR儀、蛋白質凝膠電泳裝置、蛋白免疫印跡轉膜裝置和Western blot 發光儀均購自Bio-Rad公司；熒光顯微鏡購自Olympus公司；活細胞智能成像監測儀購自徠卡（Paula）公司。
1.2 方法
1.2.1 生物信息分析
從加州大學克魯茲分校基因組（University of California Santa Cruz，UCSC；
1.2.2 免疫組織化學（以下簡稱免疫組化）染色法檢測肝癌組織及其對應正常肝組織中DCLRE1B蛋白的表達
① 標本收集：收集中國人民解放軍總醫院2021年1–3月期間手術切除并經術后病理學檢查確診為原發性肝癌的腫瘤組織及其對應正常肝組織標本30例，用4%中性甲醛液固定，48 h后行常規石蠟包埋、5 μm厚連續切片。② 切片的處理和染色：具體方法參照免疫組化染色試劑盒的說明書。③ 結果判定：免疫組化染色結果由資深病理科醫生對染色后的組織片在光學顯微鏡下觀察進行判讀。 DCLRE1B蛋白陽性表達定位于細胞核，呈棕色或淺棕色，并且無非特異性染色。最終結果以陽性（+）和陰性（–）表示。
1.2.3 細胞培養
將凍存于 –80 ℃冰箱凍存管中的肝癌細胞Huh7和HepG2細胞以及腎上皮細胞293T細胞（3.4×106個/管）置于37 ℃恒溫水中快速溶解，然后轉移至15 mL離心管中并添加適量完全培養基，以1 000 r/min 離心速度離心 5 min（離心半徑為13.5 cm）。然后使用完全培養基重懸細胞后將其接種在10 cm培養皿中，并將其置于5% CO2和37 ℃細胞培養箱中培養。培養至細胞密度達到約90%時，使用胰蛋白酶消化細胞并進行傳代培養，當培養傳代至第3代以后則可進行后續的細胞實驗。
1.2.4 實驗分組及細胞轉染
將生長良好的細胞（Huh7、HepG2和293T細胞）篩選出來，其中293T細胞用來進行病毒包裝，肝癌細胞Huh7和HepG2被用來進行細胞轉染和后續細胞實驗。① 質粒病毒包裝：使用水泡性口炎病毒糖蛋白（vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSVG）、病毒顆粒表達調節蛋白（regulation of expression of virion protein，Rev）、Rev應答原件（Rev-responsive element，RRE）、目的基因質粒和空質粒進行病毒包裝，其中目的質粒有2個，分別標記為沉默組1和沉默組2；空質粒為1個，標記為對照組。使用上述2個目的基因質粒體系和空質粒體系分別對3個培養皿的293T細胞進行病毒包裝。具體為：使用100 μL無血清培養基稀釋目的質粒或空質粒4 μg、RRE質粒2 μg、REV質粒1 μg和VSVG質粒1 μg至無菌EP管中，并輕輕吹打混合靜置5 min；另取1個EP管，加入用100 μL 無血清培養基稀釋的24 μL LipofectamineTM 2000至管中，室溫下靜置5 min；然后將稀釋的總質粒與LipofectamineTM 2000混合，室溫下靜置15～30 min；再將該復合物加入293T細胞中，搖勻后放入細胞培養箱，8 h后棄去培養基，改用完全培養基10 mL 繼續培養，48 h后用于細胞轉染。② 細胞轉染：用無菌針管收集上層培養基5 mL，過濾后將2個目的質粒和1個空質粒分別轉染肝癌細胞HepG2和Huh7（分別為HepG2-沉默組1、HepG2-沉默組2、HepG2-對照組、Huh7-沉默組1、Huh7-沉默組2和Huh7-對照組），具體操作見細胞轉染說明書。培養1 h后，加入5 mL新鮮完全培養基；當細胞生長觸及培養皿邊緣時進行傳代，傳代后的培養基使用添加嘌呤霉素后的完全培養基培養細胞。待細胞進行了3次傳代后，采用Western blot法檢測各組細胞DCLRE1B蛋白的表達情況以判定轉染是否成功。③ 最終實驗分組：最后將轉染成功的基因沉默組肝癌HepG2和 Huh7細胞分別標記為HepG2-沉默組和Huh7-沉默組，轉染成功的相應對照組肝癌細胞分別標記為HepG2-對照組和Huh7-對照組。
1.2.5 Western blot 法檢測轉染后DCLRE1B蛋白的表達
將收集的肝癌細胞Huh7和HepG2用PMSF和RIPA裂解液裂解，提取總蛋白，采用BCA法繪制標準曲線，根據曲線計算樣品蛋白濃度，具體方法參照試劑盒說明書。根據計算后的蛋白濃度進行上樣、電泳、轉膜、免疫發光。使用Image J對條帶進行灰度值分析，用GraphPad Prism 9進行統計，計算DCLRE1B蛋白濃度，并用柱狀圖表示。實驗重復3次。
1.2.6 劃痕實驗檢測肝癌細胞的遷移情況
將轉染完成后的4組細胞單層鋪于10 cm培養皿中，待細胞生長至100%密度時在孔中央使用10 μL的無菌槍頭做“十”字劃痕，PBS清洗3次以去掉懸浮的細胞，加入不含血清的DMEM培養液體10 mL繼續培養，分別在0 h（即刻）、12 h和24 h于活細胞自動呈現儀中觀察遷移面積和細胞狀態并拍照。 采用 Image J軟件測量遷移面積（以傷口愈合面積表示）。傷口愈合面積（%）=（初始總面積–當下空白面積）/初始總面積×100% 。實驗重復3次（n=3），取其均值作為最終結果。
1.2.7 Transwell 實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力
① Transwell侵襲實驗：預先以4 ℃預冷的無血清培養基和基質膠（Matrigel）按8∶1的體積比例稀釋后，每孔100 μL，均勻鋪在上室，放入培養箱中靜置2 h使其干成膠狀。收集轉染完成的4組細胞，按每室1×105個細胞制成無血清培養細胞懸液200 μL，加入至8 μm孔徑 Transwell小室基質膠表面，然后將小室移至含10% 血清培養液600 μL的下室中，繼續培養細胞。 48 h時取出，用4%的多聚甲醛溶液固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色20 min、雙蒸水沖洗浸泡2次，棉簽輕柔去除上層的細胞。經烘箱干燥后，置于倒置顯微鏡200倍鏡下隨機采集5個視野進行細胞計數，以此表示細胞侵襲能力。② Transwell遷移實驗：僅小室上層不使用基質膠，剩余實驗步驟和實驗分組同Transwell侵襲實驗。實驗重復3次（n=15），取其均值作為最終結果。
1.2.8 實時熒光定量-聚合酶鏈反應（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測肝癌細胞中EMT 通路相關指標的mRNA表達
本研究僅選取轉染成功的肝癌細胞HepG2進行該項相關指標的檢測。將轉染培養后的肝癌細胞HepG2使用 Trizol 法提取總RNA，采用微量核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度并進行調整，使用反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒分別將RNA反轉錄為cDNA和進行熒光定量實驗。以E-Cad、N-Cad、Vimentin、基質金屬蛋白酶9（matrix metallo- peptidase 9，MMP9）、β-連環蛋白（β-catenin）和鋅指轉錄因子（Snail）為目的基因和GAPDH為內參基因進行PCR擴增，各引物信息見表1。實驗結果采用2－△△Ct法進行分析，每個樣品做 3 個平行實驗，實驗重復3次。3次平行實驗中，最大CT值與最小 CT值之間的誤差小于0.5將視為有效數據。利用CT值計算2－△△Ct值，內參基因計算后的2－△△Ct值一般接近于1，目的基因值在1上下波動。將計算后的每組2－△△Ct數值取平均值后輸入統計軟件Graphpad中并作圖，采用配對t檢驗進行統計學分析。
表1
PCR 引物序列
1.3 統計學方法
生物信息分析：采用非參數秩和檢驗（Wilcox test）和R軟件分析DCLRE1B mRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達差異；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線；與生存相關的預后因素（DCLRE1B基因表達、年齡、性別、腫瘤組織學分級和TNM分期）分析采用Cox比例風險回歸分析法，結果以森林圖表示。細胞實驗結果分析：采用 GraphPad Prism 9統計軟件進行數據處理和作圖；熒光定量PCR結果采用成組t檢驗；Western blot結果采用Image J 進行光密度值計算；細胞劃痕實驗傷口愈合面積使用Image J進行面積計算；Transwell實驗使用Image J進行細胞計數；定量數據符合正態分布（Kolmogorov-Smirnov檢驗，P>0.1），以均數±標準差（
±s） 表示，行Student t檢驗；2組以上均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間與1個對照組比較采用Dunnett-t檢驗。手術切除肝癌組織及其對應的正常肝組織中DCLRE1B蛋白表達結果用率（%）表示，行配對χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DCLRE1B在多種癌組織中的表達及免疫組化檢測結果
生信分析結果顯示：DCLRE1B mRNA在腫瘤組織和相對應的正常組織中的相對表達量存在差異，與正常組織相比較，在多種癌組織中DCLRE1B mRNA相對表達量增高，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1a和1b。對手術切除的30例肝癌組織進行免疫組化染色，其結果也顯示，DCLRE1B蛋白陽性表達定位于細胞核，呈棕色或淺棕色（圖1c）；肝癌組織中DCLRE1B蛋白表達陽性者24例、陽性率為80.0%，在相對應的正常肝臟組織中DCLRE1B蛋白表達陽性者2例、陽性率為6.7%，其差異具有統計學意義（χ2=32.85，P<0.05）。
圖1
示DCLRE1B在腫瘤組織中表達的生物信息分析結果、在手術切除肝癌組織標本中的表達情況以及與肝癌患者生存預后的關系分析結果
a、b：生物信息分析結果顯示的泛癌組織（a）和肝癌組織及其正常組織（b）中DCLRE1B mRNA相對表達量；c：手術切除肝癌組織及其正常肝組織中DCLRE1B蛋白表達情況（免疫組化染色 ×400）；d：生物信息分析結果顯示的DCLRE1B mRNA在不同腫瘤不同臨床分期中的表達情況；e、f：生物信息分析結果顯示DCLRE1B mRNA高、低表達肝癌患者的OS（e）和PFS （f）生存曲線；g、h：單因素（g）和多因素（h）Cox比例風險回歸分析結果，其中性別的對照是女，DCLRE1B 基因表達的對照是低表達；a和d圖中：*
2.2 DCLRE1B mRNA表達與腫瘤臨床分期關系的分析結果
DCLRE1B mRNA在不同腫瘤不同臨床分期中表達情況的生信分析結果顯示：不同腫瘤不同TNM分期者的DCLRE1B mRNA相對表達量不同，差異有統計學意義（P<0.05）。提示DCLRE1B mRNA相對表達量與腫瘤TNM分期有相關性（圖1d）。
2.3 DCLRE1B mRNA表達與肝癌患者預后的相關性分析結果
按DCLRE1B mRNA相對表達量的中位數將納入分析患者分為高表達組和低表達組。生存分析結果表明：肝癌患者DCLRE1B mRNA的相對表達量與OS（P=0.038）和PFS（P=0.005）有關，DCLRE1B mRNA高表達者相對DCLRE1B mRNA低表達者的預后差，差異具有統計學意義。具體見圖1e和1f。
2.4 DCLRE1B和腫瘤TNM分期是影響肝癌預后的因素
將年齡、性別、腫瘤組織學分級和腫瘤TNM分期以及DCLRE1B基因表達納入單因素和多因素Cox比例風險回歸模型，結果顯示，只有肝癌的TNM分期和腫瘤中DCLRE1B mRNA的表達是影響肝癌預后的因素，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖1g和1h。
2.5 DCLRE1B沉默肝癌細胞系的構建
慢病毒轉染肝癌細胞系Huh7和HepG2細胞后蛋白質免疫印跡灰度值檢測結果顯示，HepG2 細胞中構建的2個慢病毒轉染組（HepG2-沉默組1和HepG2-沉默組2）的DCLRE1B蛋白相對表達水平均低于HepG2-對照組（P<0.001），提示在肝癌細胞HepG2中，構建的2種慢病毒均可以沉默DCLRE1B。在Huh7細胞中，構建的慢病毒中只有1組（Huh7-沉默組2）可以沉默DCLRE1B（P<0.01）。上述實驗結果表明，DCLRE1B低表達肝癌細胞株Huh7和HepG2構建成功（圖2）。本研究將分別使用構建成功的HepG2-沉默組1、Huh7-沉默組2以及相對應的對照組進行后續的細胞表型實驗，并分別命名為HepG2-沉默組、Huh7-沉默組、HepG2-對照組和Huh7-對照組。
圖2
示慢病毒轉染肝癌細胞HepG2（a）和Huh7（b）后各組DCLRE1B蛋白相對表達量檢測結果
2.6 沉默DCLRE1B后對肝癌細胞惡性生物學行為的影響
選取構建成功的DCLRE1B沉默肝癌細胞進行惡性生物學行為實驗。 劃痕實驗結果顯示： HepG2-沉默組以及Huh7-沉默組12 h和24 h的傷口愈合面積均小于同時相的各自對照組（因n=3，未行統計學分析），該結果提示DCLRE1B沉默后肝癌細胞的傷口面積愈合速度可能減慢，遷移能力可能減弱。 Transwell遷移和侵襲實驗結果顯示：與各自對照組比較，HepG2-沉默組和Huh7-沉默組的穿膜細胞數量減少，差異均有統計學意義（P<0.05），提示沉默DCLRE1B后肝癌細胞的遷移和侵襲能力均減弱。具體見表2和圖3。
表2
各組肝癌細胞的傷口愈合面積、遷移及侵襲實驗檢測結果（
）
圖3
示DCLRE1B沉默后肝癌細胞Huh7和HepG2劃痕、遷移、侵襲情況
a、b：肝癌細胞劃痕實驗結果顯示的細胞傷口愈合面積（ ×30）；c：無基質膠Transwell遷移實驗（結晶紫染色 ×200）； d：有基質膠Transwell侵襲實驗（結晶紫染色 ×200）
2.7 沉默DCLRE1B對肝癌細胞EMT通路相關基因的影響
qRT-PCR結果顯示：與對照組比較，HepG2-沉默組的E-Cad、MMP9和β-catenin的mRNA表達上調（P<0.05），N-Cad和Vimentin的 mRNA表達則下調，差異均有統計學意義（P<0.05）；而Snail mRNA表達無差異（P>0.05）。該結果提示，沉默DCLRE1B后可抑制EMT的轉變，從而抑制腫瘤的發生發展。具體見圖4。
圖4
示沉默DCLRE1B后肝癌細胞EMT相關基因mRNA表達情況
a～f：分別代表E-Cad 、N-Cad 、Vimentin、MMP9、Snail和β-catenin的mRNA表達情況
3 討論
肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，盡管肝癌的治療取得了一些進展，但手術切除肝臟腫瘤后的轉移和復發率仍然很高。因此，探索和闡明肝癌發生和轉移的機制對治療肝癌具有重要意義。DNA ICL的修復過程是很復雜的，因為它涉及DNA修復的多種途徑，包括范可尼貧血（fanconi anaemia，FA）/乳腺癌途徑、同源重組以及核苷酸切除和錯配修復途徑[9-11]。同時有學者[12]發現，DCLRE1B與Mre11-Rad50-Nbs1蛋白復合物和FA D2蛋白相互作用，進一步證實了其作為DNA修復蛋白檢查點的重要角色。除此之外，DCLRE1B是DNA ICL正常細胞反應過程所必需的，沉默DT40細胞中DCLRE1B會導致細胞對絲裂霉素和順鉑的敏感性增加[13]。 雖然有實驗室研究[14]表明DCLRE1B耗盡的HeLa細胞對電離輻射具有超敏性，但 Bae等[12]發現耗盡的 HEK293細胞在輻射后卻沒有增加敏感性。
之后的研究[15-16]發現，DCLRE1B參與共濟失調性毛細血管擴張突變蛋白和共濟失調性毛細血管擴張突變基因Rad3相關激酶介導的DNA損傷修復信號傳導。FA途徑修復了基因組中的DNA ICL，但FA通路是否與DCLRE1B產生作用尚有爭議[9]。通常情況下，DNA損傷后對復制叉的修復需要DCLRE1B參與，并通過減少拓撲應力和端粒懸垂而維持端粒作用[17]。有研究[18]表明，DCLRE1B的變異與癌癥存在高度相關性，或許可作為治療靶點。
近年的研究[19]表明，白花蛇舌草提取物通過調節賴氨酸脫甲基酶和DCLRE1B，可有效促進順鉑耐藥卵巢癌細胞的死亡。DCLRE1B也可能利用其活性來幫助清除端粒上常見的氧化損傷[20]。Yosaatmadja等[21]提出了一種野生型和變異型晶體結構，這些結構包含一種頭孢曲松鈉的結構，將有助于開發選擇性SNM1/DCLRE1核酸酶抑制劑。 同時，DCLRE1B可能在落葉型天皰瘡自身免疫性疾病的發生中發揮作用[22]。此外有研究[23]表明DCLRE1B的N端區域形成1個包含異四聚體GINS復合物亞基2和核酸內切酶特殊結構亞基甲磺酸鹽及紫外線敏感性81號基因復合物，而N端區域對突變體Sld5的伴侶PSF2介導的染色質結合起重要作用。
然而DCLRE1B對肝癌的作用卻鮮有報道。近年的一項研究[24]表明，母源性印記基因3通過阻斷維持端粒長度的復合物端粒保護-核酸外切酶Ⅰ-端粒重復序列結合因子2-SNM1B的形成來減少端粒長度，從而抑制肝癌的發生發展。
本研究從數據庫中提取了關于DCLRE1B基因和癌癥的信息數據，發現DCLRE1B mRNA在肝癌組織及其正常肝組織中的表達存在差異，肝癌組織中DCLRE1B mRNA相對表達量增高。相比低表達組患者，DCLRE1B mRNA高表達肝癌患者其OS和PFS在一定范圍內縮短。通過進一步分析我們發現，在腫瘤TNM分期中，DCLRE1B mRNA的表達在肝癌TNM分期的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中表達均升高，但是在Ⅳ期中其表達反而下降。其具體原因有待研究，可能與其他影響因素有關，例如樣本量的大小、數據隨訪的丟失或者與晚期肝癌相關調控通路相互作用等所導致。在DCLRE1B生存分析曲線中我們發現，在4年總生存期內，患者DCLRE1B mRNA的表達存在明顯差異，但在4年之后，高低表達組間患者總生存期的差異逐漸消失。出現該情況可能與在TNM分期為Ⅳ期的腫瘤中，DCLRE1B的表達開始降低有關。在無進展生存分析中發現，DCLRE1B mRNA表達一直存在差異，這與患者的總生存期的分析結果相矛盾，其具體原因有待進一步研究。通過以上的分析筆者認為，DCLRE1B在肝癌早中期的發生和發展中扮演重要角色，能為早期肝癌治療以及預后提供一定指導。
本研究通過單因素和多因素Cox比例風險回歸分析發現，腫瘤TNM分期和DCLRE1B mRNA 表達是影響肝癌預后的因素，提示DCLRE1B mRNA表達與肝癌疾病的進展和腫瘤分期可能存在一定的相關性。這也是筆者為什么要研究DCLRE1B 在肝癌侵襲遷移中的意義所在。為了解答這個問題，本研究成功構建了DCLRE1B沉默的肝癌細胞。在劃痕實驗中發現，DCLRE1B沉默組中肝癌細胞的傷口愈合面積小于對照組，提示沉默DCLRE1B可能抑制肝癌細胞的遷移能力。之后通過Transwell實驗測試了Huh7和HepG2兩種肝癌細胞的侵襲遷移能力。與對照組比較，DCLRE1B 沉默組肝癌細胞穿過Transwell小室膜的細胞總數減少（P<0.05）；在Transwell實驗中，無論是否加入基質膠，肝癌細胞都可以穿過小室膜到達小室膜的下表面，且DCLRE1B沉默組的穿膜細胞數量少于對照組（P<0.05）。在加入基質膠的細胞侵襲實驗中，細胞在穿膜之前需分泌MMP溶解基質膠，之后才能進行穿膜行為。然而當細胞無法分泌或分泌較少的MMP時，則細胞無法對基質膠進行溶解，此時細胞無法穿過膜而停留在小室膜上層。結合本研究的熒光定量實驗結果，沉默DCLRE1B 后，肝癌細胞MMP9的表達仍舊處于較高水平，說明細胞可以通過分泌MMP從而實現穿膜行為，這與上面的侵襲實驗相互印證。人體肝臟除固有的功能細胞外，還有相當一部分的結締組織和細胞外基質。當肝癌細胞進行擴散轉移時，需要破壞這些包裹在細胞外的基質才能進行侵襲遷移。本研究關于遷移和侵襲的結果提示DCLRE1B在肝癌細胞的侵襲遷移中扮演了重要的角色。
EMT是上皮細胞向間質細胞表型的轉變過程，也是上皮細胞失去極性并獲得遷移和侵襲能力的過程。腫瘤惡性生物學行為增加與EMT之間的關系已被證明。研究[25-26]表明，EMT的生物學過程被認為是致癌作用的關鍵標志，靶向EMT途徑是一種有潛力的癌癥治療策略。EMT的標志是上皮標志物表達的喪失，通常由 E-Cad的存在來表明，而間充質標志物表達（如N-Cad和Vimentin） 的改變也同時伴隨著侵襲性表型的改變[27-28]。 本研究肝癌細胞侵襲遷移的初步結果提示， DCLRE1B參與或調控了肝癌細胞惡性生物學行為，該過程可能與腫瘤EMT過程有關。通過對沉默DCLRE1B后肝癌細胞EMT相關通路的qRT-PCR實驗，發現其相關指標的mRNA表達發生了改變（P<0.05），但Snail無明顯改變。其經典特征通路顯示E-Cad mRNA表達上調，N-Cad和Vimentin的mRNA表達下調（P<0.05），符合腫瘤EMT被抑制的特征。提示沉默DCLRE1B可能抑制EMT 的發生或參與EMT調控肝癌的發生發展。
綜上，DNA損傷修復基因在腫瘤發生發展中的重要作用逐漸被人們所揭示，生物信息研究方法在醫學領域有待被進一步開發，本研究將生物信息分析與細胞實驗相結合，其初步結果希望能為肝癌的治療提供一些新思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，所有作者之間沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：鄧肇達負責實驗與論文撰寫；王靜負責基礎實驗部分的指導；李林成和鄒文博負責生物信息部分的數據分析；劉榮負責文章審核。
倫理聲明：本研究通過了中國人民解放軍總醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號：倫審第 S2016-098-02號）。
鏈間交聯（interstrand cross-linking，ICL）是最具細胞毒性的 DNA 損傷之一，能共價結合2條DNA鏈并抑制細胞遺傳物質的轉錄和復制[1-2]。除天然存在的內源性（例如乙醛，糖酵解途徑的代謝物）和外源性物質（紫外線）能夠誘導 ICL外，一些抗腫瘤治療的化合物如順鉑等，也會導致ICL[3-4]。 1980 年初，人類發現了幾種對 ICL 誘導劑具有特異性超敏反應的釀酒酵母突變體。其中有兩種是對補骨脂素（psoralen，PSO）和長波紫外線敏感的突變體和對氮芥子氣敏感（sensitive nitrogen mustard，SNM）的突變體。PSO2編碼一種分子量為7.6×103的蛋白質（PSO2p），該蛋白質對于酵母中由 ICL 修復產生的雙鏈斷裂（double strand break，DSB） 的修復必不可少[5]。在哺乳動物細胞中，已發現3種與PSO2p序列具相似性的蛋白質：SNM1A、SNM1B/Apollo 和SNM1C/Artemis ［人類基因符號：DNA交聯修復（DNA cross-link repair，DCLRE）1A、1B 和 1C）］。然而內源性DCLRE1B的表達水平非常低，通常難以檢測[6-7]。上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transformation， EMT）是一個多步驟的生物學過程。 腫瘤EMT主要表現為細胞E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）減少，N-鈣粘蛋白（N-cadherin，N-cad）和波形蛋白（Vimentin）的增多，使得上皮表型缺失，而表現為間充質表型[8]。
國內外鮮有人研究DCLRE1B與肝癌之間的關系，為了進一步探究DCLRE1B對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究通過生物信息分析DCLRE1B在肝癌樣本中的mRNA相對表達量及其與臨床預后的相關性，之后通過構建穩定敲除DCLRE1B的慢病毒，靶向沉默肝癌細胞中 DCLRE1B的表達，探究DCLRE1B對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響及其作用機制，旨在為肝癌的治療提供一定的理論基礎。
1 材料和方法
1.1 主要試劑、材料和設備
肝癌細胞 Huh-7和HepG2 購自中國科學院（上海）細胞庫；杜氏改良培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、細胞轉染試劑（LipofectamineTM 2000）、總RNA提取試劑（total RNA extractor，TRIzol）、微量核酸蛋白測定儀和細胞培養箱均購自 Thermo Fisher公司；反轉錄試劑盒購自大連Takara公司；實時熒光定量-聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自潤康生物公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）試劑、放射免疫沉淀測定（radio-immunoprecipitation assay, RIPA）試劑、蛋白定量測定試劑盒（bicinchoninic acid，BCA）和蛋白免疫印跡（Western blot）二抗試劑均購自碧云天公司；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購自ProteinTech公司；兔抗人DCLRE1B多克隆抗體購自Biorbyt公司；所有的熒光定量引物均購自擎科生物（北京）公司；DCLRE1B質粒沉默表達載體系統購自金拓思（北京）公司；Transwell小室購自Corning公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）購自Millipore 公司；普通PCR儀和熒光定量PCR儀、蛋白質凝膠電泳裝置、蛋白免疫印跡轉膜裝置和Western blot 發光儀均購自Bio-Rad公司；熒光顯微鏡購自Olympus公司；活細胞智能成像監測儀購自徠卡（Paula）公司。
1.2 方法
1.2.1 生物信息分析
從加州大學克魯茲分校基因組（University of California Santa Cruz，UCSC；
1.2.2 免疫組織化學（以下簡稱免疫組化）染色法檢測肝癌組織及其對應正常肝組織中DCLRE1B蛋白的表達
① 標本收集：收集中國人民解放軍總醫院2021年1–3月期間手術切除并經術后病理學檢查確診為原發性肝癌的腫瘤組織及其對應正常肝組織標本30例，用4%中性甲醛液固定，48 h后行常規石蠟包埋、5 μm厚連續切片。② 切片的處理和染色：具體方法參照免疫組化染色試劑盒的說明書。③ 結果判定：免疫組化染色結果由資深病理科醫生對染色后的組織片在光學顯微鏡下觀察進行判讀。 DCLRE1B蛋白陽性表達定位于細胞核，呈棕色或淺棕色，并且無非特異性染色。最終結果以陽性（+）和陰性（–）表示。
1.2.3 細胞培養
將凍存于 –80 ℃冰箱凍存管中的肝癌細胞Huh7和HepG2細胞以及腎上皮細胞293T細胞（3.4×106個/管）置于37 ℃恒溫水中快速溶解，然后轉移至15 mL離心管中并添加適量完全培養基，以1 000 r/min 離心速度離心 5 min（離心半徑為13.5 cm）。然后使用完全培養基重懸細胞后將其接種在10 cm培養皿中，并將其置于5% CO2和37 ℃細胞培養箱中培養。培養至細胞密度達到約90%時，使用胰蛋白酶消化細胞并進行傳代培養，當培養傳代至第3代以后則可進行后續的細胞實驗。
1.2.4 實驗分組及細胞轉染
將生長良好的細胞（Huh7、HepG2和293T細胞）篩選出來，其中293T細胞用來進行病毒包裝，肝癌細胞Huh7和HepG2被用來進行細胞轉染和后續細胞實驗。① 質粒病毒包裝：使用水泡性口炎病毒糖蛋白（vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSVG）、病毒顆粒表達調節蛋白（regulation of expression of virion protein，Rev）、Rev應答原件（Rev-responsive element，RRE）、目的基因質粒和空質粒進行病毒包裝，其中目的質粒有2個，分別標記為沉默組1和沉默組2；空質粒為1個，標記為對照組。使用上述2個目的基因質粒體系和空質粒體系分別對3個培養皿的293T細胞進行病毒包裝。具體為：使用100 μL無血清培養基稀釋目的質粒或空質粒4 μg、RRE質粒2 μg、REV質粒1 μg和VSVG質粒1 μg至無菌EP管中，并輕輕吹打混合靜置5 min；另取1個EP管，加入用100 μL 無血清培養基稀釋的24 μL LipofectamineTM 2000至管中，室溫下靜置5 min；然后將稀釋的總質粒與LipofectamineTM 2000混合，室溫下靜置15～30 min；再將該復合物加入293T細胞中，搖勻后放入細胞培養箱，8 h后棄去培養基，改用完全培養基10 mL 繼續培養，48 h后用于細胞轉染。② 細胞轉染：用無菌針管收集上層培養基5 mL，過濾后將2個目的質粒和1個空質粒分別轉染肝癌細胞HepG2和Huh7（分別為HepG2-沉默組1、HepG2-沉默組2、HepG2-對照組、Huh7-沉默組1、Huh7-沉默組2和Huh7-對照組），具體操作見細胞轉染說明書。培養1 h后，加入5 mL新鮮完全培養基；當細胞生長觸及培養皿邊緣時進行傳代，傳代后的培養基使用添加嘌呤霉素后的完全培養基培養細胞。待細胞進行了3次傳代后，采用Western blot法檢測各組細胞DCLRE1B蛋白的表達情況以判定轉染是否成功。③ 最終實驗分組：最后將轉染成功的基因沉默組肝癌HepG2和 Huh7細胞分別標記為HepG2-沉默組和Huh7-沉默組，轉染成功的相應對照組肝癌細胞分別標記為HepG2-對照組和Huh7-對照組。
1.2.5 Western blot 法檢測轉染后DCLRE1B蛋白的表達
將收集的肝癌細胞Huh7和HepG2用PMSF和RIPA裂解液裂解，提取總蛋白，采用BCA法繪制標準曲線，根據曲線計算樣品蛋白濃度，具體方法參照試劑盒說明書。根據計算后的蛋白濃度進行上樣、電泳、轉膜、免疫發光。使用Image J對條帶進行灰度值分析，用GraphPad Prism 9進行統計，計算DCLRE1B蛋白濃度，并用柱狀圖表示。實驗重復3次。
1.2.6 劃痕實驗檢測肝癌細胞的遷移情況
將轉染完成后的4組細胞單層鋪于10 cm培養皿中，待細胞生長至100%密度時在孔中央使用10 μL的無菌槍頭做“十”字劃痕，PBS清洗3次以去掉懸浮的細胞，加入不含血清的DMEM培養液體10 mL繼續培養，分別在0 h（即刻）、12 h和24 h于活細胞自動呈現儀中觀察遷移面積和細胞狀態并拍照。 采用 Image J軟件測量遷移面積（以傷口愈合面積表示）。傷口愈合面積（%）=（初始總面積–當下空白面積）/初始總面積×100% 。實驗重復3次（n=3），取其均值作為最終結果。
1.2.7 Transwell 實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力
① Transwell侵襲實驗：預先以4 ℃預冷的無血清培養基和基質膠（Matrigel）按8∶1的體積比例稀釋后，每孔100 μL，均勻鋪在上室，放入培養箱中靜置2 h使其干成膠狀。收集轉染完成的4組細胞，按每室1×105個細胞制成無血清培養細胞懸液200 μL，加入至8 μm孔徑 Transwell小室基質膠表面，然后將小室移至含10% 血清培養液600 μL的下室中，繼續培養細胞。 48 h時取出，用4%的多聚甲醛溶液固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色20 min、雙蒸水沖洗浸泡2次，棉簽輕柔去除上層的細胞。經烘箱干燥后，置于倒置顯微鏡200倍鏡下隨機采集5個視野進行細胞計數，以此表示細胞侵襲能力。② Transwell遷移實驗：僅小室上層不使用基質膠，剩余實驗步驟和實驗分組同Transwell侵襲實驗。實驗重復3次（n=15），取其均值作為最終結果。
1.2.8 實時熒光定量-聚合酶鏈反應（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測肝癌細胞中EMT 通路相關指標的mRNA表達
本研究僅選取轉染成功的肝癌細胞HepG2進行該項相關指標的檢測。將轉染培養后的肝癌細胞HepG2使用 Trizol 法提取總RNA，采用微量核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度并進行調整，使用反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒分別將RNA反轉錄為cDNA和進行熒光定量實驗。以E-Cad、N-Cad、Vimentin、基質金屬蛋白酶9（matrix metallo- peptidase 9，MMP9）、β-連環蛋白（β-catenin）和鋅指轉錄因子（Snail）為目的基因和GAPDH為內參基因進行PCR擴增，各引物信息見表1。實驗結果采用2－△△Ct法進行分析，每個樣品做 3 個平行實驗，實驗重復3次。3次平行實驗中，最大CT值與最小 CT值之間的誤差小于0.5將視為有效數據。利用CT值計算2－△△Ct值，內參基因計算后的2－△△Ct值一般接近于1，目的基因值在1上下波動。將計算后的每組2－△△Ct數值取平均值后輸入統計軟件Graphpad中并作圖，采用配對t檢驗進行統計學分析。
表1
PCR 引物序列
1.3 統計學方法
生物信息分析：采用非參數秩和檢驗（Wilcox test）和R軟件分析DCLRE1B mRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達差異；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線；與生存相關的預后因素（DCLRE1B基因表達、年齡、性別、腫瘤組織學分級和TNM分期）分析采用Cox比例風險回歸分析法，結果以森林圖表示。細胞實驗結果分析：采用 GraphPad Prism 9統計軟件進行數據處理和作圖；熒光定量PCR結果采用成組t檢驗；Western blot結果采用Image J 進行光密度值計算；細胞劃痕實驗傷口愈合面積使用Image J進行面積計算；Transwell實驗使用Image J進行細胞計數；定量數據符合正態分布（Kolmogorov-Smirnov檢驗，P>0.1），以均數±標準差（±s） 表示，行Student t檢驗；2組以上均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間與1個對照組比較采用Dunnett-t檢驗。手術切除肝癌組織及其對應的正常肝組織中DCLRE1B蛋白表達結果用率（%）表示，行配對χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DCLRE1B在多種癌組織中的表達及免疫組化檢測結果
生信分析結果顯示：DCLRE1B mRNA在腫瘤組織和相對應的正常組織中的相對表達量存在差異，與正常組織相比較，在多種癌組織中DCLRE1B mRNA相對表達量增高，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1a和1b。對手術切除的30例肝癌組織進行免疫組化染色，其結果也顯示，DCLRE1B蛋白陽性表達定位于細胞核，呈棕色或淺棕色（圖1c）；肝癌組織中DCLRE1B蛋白表達陽性者24例、陽性率為80.0%，在相對應的正常肝臟組織中DCLRE1B蛋白表達陽性者2例、陽性率為6.7%，其差異具有統計學意義（χ2=32.85，P<0.05）。
圖1
示DCLRE1B在腫瘤組織中表達的生物信息分析結果、在手術切除肝癌組織標本中的表達情況以及與肝癌患者生存預后的關系分析結果
a、b：生物信息分析結果顯示的泛癌組織（a）和肝癌組織及其正常組織（b）中DCLRE1B mRNA相對表達量；c：手術切除肝癌組織及其正常肝組織中DCLRE1B蛋白表達情況（免疫組化染色 ×400）；d：生物信息分析結果顯示的DCLRE1B mRNA在不同腫瘤不同臨床分期中的表達情況；e、f：生物信息分析結果顯示DCLRE1B mRNA高、低表達肝癌患者的OS（e）和PFS （f）生存曲線；g、h：單因素（g）和多因素（h）Cox比例風險回歸分析結果，其中性別的對照是女，DCLRE1B 基因表達的對照是低表達；a和d圖中：*
2.2 DCLRE1B mRNA表達與腫瘤臨床分期關系的分析結果
DCLRE1B mRNA在不同腫瘤不同臨床分期中表達情況的生信分析結果顯示：不同腫瘤不同TNM分期者的DCLRE1B mRNA相對表達量不同，差異有統計學意義（P<0.05）。提示DCLRE1B mRNA相對表達量與腫瘤TNM分期有相關性（圖1d）。
2.3 DCLRE1B mRNA表達與肝癌患者預后的相關性分析結果
按DCLRE1B mRNA相對表達量的中位數將納入分析患者分為高表達組和低表達組。生存分析結果表明：肝癌患者DCLRE1B mRNA的相對表達量與OS（P=0.038）和PFS（P=0.005）有關，DCLRE1B mRNA高表達者相對DCLRE1B mRNA低表達者的預后差，差異具有統計學意義。具體見圖1e和1f。
2.4 DCLRE1B和腫瘤TNM分期是影響肝癌預后的因素
將年齡、性別、腫瘤組織學分級和腫瘤TNM分期以及DCLRE1B基因表達納入單因素和多因素Cox比例風險回歸模型，結果顯示，只有肝癌的TNM分期和腫瘤中DCLRE1B mRNA的表達是影響肝癌預后的因素，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖1g和1h。
2.5 DCLRE1B沉默肝癌細胞系的構建
慢病毒轉染肝癌細胞系Huh7和HepG2細胞后蛋白質免疫印跡灰度值檢測結果顯示，HepG2 細胞中構建的2個慢病毒轉染組（HepG2-沉默組1和HepG2-沉默組2）的DCLRE1B蛋白相對表達水平均低于HepG2-對照組（P<0.001），提示在肝癌細胞HepG2中，構建的2種慢病毒均可以沉默DCLRE1B。在Huh7細胞中，構建的慢病毒中只有1組（Huh7-沉默組2）可以沉默DCLRE1B（P<0.01）。上述實驗結果表明，DCLRE1B低表達肝癌細胞株Huh7和HepG2構建成功（圖2）。本研究將分別使用構建成功的HepG2-沉默組1、Huh7-沉默組2以及相對應的對照組進行后續的細胞表型實驗，并分別命名為HepG2-沉默組、Huh7-沉默組、HepG2-對照組和Huh7-對照組。
圖2
示慢病毒轉染肝癌細胞HepG2（a）和Huh7（b）后各組DCLRE1B蛋白相對表達量檢測結果
2.6 沉默DCLRE1B后對肝癌細胞惡性生物學行為的影響
選取構建成功的DCLRE1B沉默肝癌細胞進行惡性生物學行為實驗。 劃痕實驗結果顯示： HepG2-沉默組以及Huh7-沉默組12 h和24 h的傷口愈合面積均小于同時相的各自對照組（因n=3，未行統計學分析），該結果提示DCLRE1B沉默后肝癌細胞的傷口面積愈合速度可能減慢，遷移能力可能減弱。 Transwell遷移和侵襲實驗結果顯示：與各自對照組比較，HepG2-沉默組和Huh7-沉默組的穿膜細胞數量減少，差異均有統計學意義（P<0.05），提示沉默DCLRE1B后肝癌細胞的遷移和侵襲能力均減弱。具體見表2和圖3。
表2
各組肝癌細胞的傷口愈合面積、遷移及侵襲實驗檢測結果（）
圖3
示DCLRE1B沉默后肝癌細胞Huh7和HepG2劃痕、遷移、侵襲情況
a、b：肝癌細胞劃痕實驗結果顯示的細胞傷口愈合面積（ ×30）；c：無基質膠Transwell遷移實驗（結晶紫染色 ×200）； d：有基質膠Transwell侵襲實驗（結晶紫染色 ×200）
2.7 沉默DCLRE1B對肝癌細胞EMT通路相關基因的影響
qRT-PCR結果顯示：與對照組比較，HepG2-沉默組的E-Cad、MMP9和β-catenin的mRNA表達上調（P<0.05），N-Cad和Vimentin的 mRNA表達則下調，差異均有統計學意義（P<0.05）；而Snail mRNA表達無差異（P>0.05）。該結果提示，沉默DCLRE1B后可抑制EMT的轉變，從而抑制腫瘤的發生發展。具體見圖4。
圖4
示沉默DCLRE1B后肝癌細胞EMT相關基因mRNA表達情況
a～f：分別代表E-Cad 、N-Cad 、Vimentin、MMP9、Snail和β-catenin的mRNA表達情況
3 討論
肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，盡管肝癌的治療取得了一些進展，但手術切除肝臟腫瘤后的轉移和復發率仍然很高。因此，探索和闡明肝癌發生和轉移的機制對治療肝癌具有重要意義。DNA ICL的修復過程是很復雜的，因為它涉及DNA修復的多種途徑，包括范可尼貧血（fanconi anaemia，FA）/乳腺癌途徑、同源重組以及核苷酸切除和錯配修復途徑[9-11]。同時有學者[12]發現，DCLRE1B與Mre11-Rad50-Nbs1蛋白復合物和FA D2蛋白相互作用，進一步證實了其作為DNA修復蛋白檢查點的重要角色。除此之外，DCLRE1B是DNA ICL正常細胞反應過程所必需的，沉默DT40細胞中DCLRE1B會導致細胞對絲裂霉素和順鉑的敏感性增加[13]。 雖然有實驗室研究[14]表明DCLRE1B耗盡的HeLa細胞對電離輻射具有超敏性，但 Bae等[12]發現耗盡的 HEK293細胞在輻射后卻沒有增加敏感性。
之后的研究[15-16]發現，DCLRE1B參與共濟失調性毛細血管擴張突變蛋白和共濟失調性毛細血管擴張突變基因Rad3相關激酶介導的DNA損傷修復信號傳導。FA途徑修復了基因組中的DNA ICL，但FA通路是否與DCLRE1B產生作用尚有爭議[9]。通常情況下，DNA損傷后對復制叉的修復需要DCLRE1B參與，并通過減少拓撲應力和端粒懸垂而維持端粒作用[17]。有研究[18]表明，DCLRE1B的變異與癌癥存在高度相關性，或許可作為治療靶點。
近年的研究[19]表明，白花蛇舌草提取物通過調節賴氨酸脫甲基酶和DCLRE1B，可有效促進順鉑耐藥卵巢癌細胞的死亡。DCLRE1B也可能利用其活性來幫助清除端粒上常見的氧化損傷[20]。Yosaatmadja等[21]提出了一種野生型和變異型晶體結構，這些結構包含一種頭孢曲松鈉的結構，將有助于開發選擇性SNM1/DCLRE1核酸酶抑制劑。 同時，DCLRE1B可能在落葉型天皰瘡自身免疫性疾病的發生中發揮作用[22]。此外有研究[23]表明DCLRE1B的N端區域形成1個包含異四聚體GINS復合物亞基2和核酸內切酶特殊結構亞基甲磺酸鹽及紫外線敏感性81號基因復合物，而N端區域對突變體Sld5的伴侶PSF2介導的染色質結合起重要作用。
然而DCLRE1B對肝癌的作用卻鮮有報道。近年的一項研究[24]表明，母源性印記基因3通過阻斷維持端粒長度的復合物端粒保護-核酸外切酶Ⅰ-端粒重復序列結合因子2-SNM1B的形成來減少端粒長度，從而抑制肝癌的發生發展。
本研究從數據庫中提取了關于DCLRE1B基因和癌癥的信息數據，發現DCLRE1B mRNA在肝癌組織及其正常肝組織中的表達存在差異，肝癌組織中DCLRE1B mRNA相對表達量增高。相比低表達組患者，DCLRE1B mRNA高表達肝癌患者其OS和PFS在一定范圍內縮短。通過進一步分析我們發現，在腫瘤TNM分期中，DCLRE1B mRNA的表達在肝癌TNM分期的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中表達均升高，但是在Ⅳ期中其表達反而下降。其具體原因有待研究，可能與其他影響因素有關，例如樣本量的大小、數據隨訪的丟失或者與晚期肝癌相關調控通路相互作用等所導致。在DCLRE1B生存分析曲線中我們發現，在4年總生存期內，患者DCLRE1B mRNA的表達存在明顯差異，但在4年之后，高低表達組間患者總生存期的差異逐漸消失。出現該情況可能與在TNM分期為Ⅳ期的腫瘤中，DCLRE1B的表達開始降低有關。在無進展生存分析中發現，DCLRE1B mRNA表達一直存在差異，這與患者的總生存期的分析結果相矛盾，其具體原因有待進一步研究。通過以上的分析筆者認為，DCLRE1B在肝癌早中期的發生和發展中扮演重要角色，能為早期肝癌治療以及預后提供一定指導。
本研究通過單因素和多因素Cox比例風險回歸分析發現，腫瘤TNM分期和DCLRE1B mRNA 表達是影響肝癌預后的因素，提示DCLRE1B mRNA表達與肝癌疾病的進展和腫瘤分期可能存在一定的相關性。這也是筆者為什么要研究DCLRE1B 在肝癌侵襲遷移中的意義所在。為了解答這個問題，本研究成功構建了DCLRE1B沉默的肝癌細胞。在劃痕實驗中發現，DCLRE1B沉默組中肝癌細胞的傷口愈合面積小于對照組，提示沉默DCLRE1B可能抑制肝癌細胞的遷移能力。之后通過Transwell實驗測試了Huh7和HepG2兩種肝癌細胞的侵襲遷移能力。與對照組比較，DCLRE1B 沉默組肝癌細胞穿過Transwell小室膜的細胞總數減少（P<0.05）；在Transwell實驗中，無論是否加入基質膠，肝癌細胞都可以穿過小室膜到達小室膜的下表面，且DCLRE1B沉默組的穿膜細胞數量少于對照組（P<0.05）。在加入基質膠的細胞侵襲實驗中，細胞在穿膜之前需分泌MMP溶解基質膠，之后才能進行穿膜行為。然而當細胞無法分泌或分泌較少的MMP時，則細胞無法對基質膠進行溶解，此時細胞無法穿過膜而停留在小室膜上層。結合本研究的熒光定量實驗結果，沉默DCLRE1B 后，肝癌細胞MMP9的表達仍舊處于較高水平，說明細胞可以通過分泌MMP從而實現穿膜行為，這與上面的侵襲實驗相互印證。人體肝臟除固有的功能細胞外，還有相當一部分的結締組織和細胞外基質。當肝癌細胞進行擴散轉移時，需要破壞這些包裹在細胞外的基質才能進行侵襲遷移。本研究關于遷移和侵襲的結果提示DCLRE1B在肝癌細胞的侵襲遷移中扮演了重要的角色。
EMT是上皮細胞向間質細胞表型的轉變過程，也是上皮細胞失去極性并獲得遷移和侵襲能力的過程。腫瘤惡性生物學行為增加與EMT之間的關系已被證明。研究[25-26]表明，EMT的生物學過程被認為是致癌作用的關鍵標志，靶向EMT途徑是一種有潛力的癌癥治療策略。EMT的標志是上皮標志物表達的喪失，通常由 E-Cad的存在來表明，而間充質標志物表達（如N-Cad和Vimentin） 的改變也同時伴隨著侵襲性表型的改變[27-28]。 本研究肝癌細胞侵襲遷移的初步結果提示， DCLRE1B參與或調控了肝癌細胞惡性生物學行為，該過程可能與腫瘤EMT過程有關。通過對沉默DCLRE1B后肝癌細胞EMT相關通路的qRT-PCR實驗，發現其相關指標的mRNA表達發生了改變（P<0.05），但Snail無明顯改變。其經典特征通路顯示E-Cad mRNA表達上調，N-Cad和Vimentin的mRNA表達下調（P<0.05），符合腫瘤EMT被抑制的特征。提示沉默DCLRE1B可能抑制EMT 的發生或參與EMT調控肝癌的發生發展。
綜上，DNA損傷修復基因在腫瘤發生發展中的重要作用逐漸被人們所揭示，生物信息研究方法在醫學領域有待被進一步開發，本研究將生物信息分析與細胞實驗相結合，其初步結果希望能為肝癌的治療提供一些新思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，所有作者之間沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：鄧肇達負責實驗與論文撰寫；王靜負責基礎實驗部分的指導；李林成和鄒文博負責生物信息部分的數據分析；劉榮負責文章審核。
倫理聲明：本研究通過了中國人民解放軍總醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號：倫審第 S2016-098-02號）。
