引用本文： 蘇力擔卡扎·仇曼, 韓瑋, 魏琴, 何鐵英, 林海, 程坤, 聶曉寒, 孫永輝, 陳啟龍. 胰島細胞聯合骨髓間充質干細胞移植對大鼠胰島細胞再血管化的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(4): 450-457. doi: 10.7507/1007-9424.202107016 復制
目前胰島素治療尚不能使所有糖尿病患者血糖得到理想控制[1]。胰島移植是目前治療糖尿病較理想的手段，然而移植后患者體內功能性胰島細胞存活無法長期維持[2]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能通過增強胰島細胞對缺血再灌注的抵抗而提高抗凋亡基因表達[3]。缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在調節缺氧誘導的基因表達過程中、局部血管生成與重塑、調節機體組織和器官氧分布、對缺氧耐受力等方面發揮重要生理作用[4-5]。在細胞移植治療缺血性疾病過程中，細胞歸巢的效率會影響移植效果，而基質細胞衍生因子1α（stromal derived factor 1α，SDF1α）是調控細胞歸巢的主要因子，可受到缺血缺氧、HIF-1α、各種血管因子影響及調控移植細胞移動而發揮作用[6]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子2（basic fibroblast growth factor 2，FGF2）是促進血管形成的重要因子，其轉錄受HIF-1α依賴性調控，這4種血管相關因子很可能在缺氧環境中相互作用、相互影響，而胰島細胞移植正是提供了這樣的環境。因此，本研究通過胰腺被膜下胰島細胞聯合BMSCs移植，觀察其是否更有利于促進胰島血管再通，進而減少移植后胰島細胞丟失，從而提高胰島移植成功率。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑和儀器
1.1.1 實驗動物
清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠54只，3～4周齡，體質量（200±20）g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供 ［實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003］。
1.1.2 主要試劑及儀器
雙硫腙、丫啶橙、碘丙啶、4,6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）、CD44 FITC小鼠抗大鼠、CD45 PE-Cy小鼠抗大鼠、CD29 PE倉鼠抗大鼠均來自Sigma公司；優級胎牛血清來自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM和RPMI 1640細胞培養液均來自Gibco公司；淋巴細胞分離液來自天津灝洋生物技術公司；聚蔗糖Ficoll400來自生興生物技術（南京）有限公司；膠原酶Ⅴ來自北京方程生物科技有限公司；胰蛋白酶來自東恒華道生物科技有限公司；鏈脲佐菌素溶液、谷氨酰胺均來自廣州賽業公司；血糖儀來自中國臺灣厚美德生物科技股份有限公司；LCZ-5-2型低溫自動平衡離心機、熒光實時定量PCR（ real-time quantitative PCR，RT-PCR）檢測儀、流式細胞儀均來自美國Becton Dickinson公司；倒置顯微鏡來自德國Leica公司；CO2培養箱來自中國香港力康生物醫療科技控股集團。
1.2 方法
1.2.1 BMSCs的分離、培養與鑒定
采用隨機數字表法隨機抽取SD大鼠4只，處死后在無菌條件下分離大鼠股骨和脛骨，采用密度梯度離心與貼壁培養法相結合，以Percoll分離液對骨髓細胞進行密度梯度離心，去除大部分造血干細胞，再根據BMSCs具有較強的黏附能力這一特性定期更換培養液，以除去黏附能力較弱的細胞，獲得純度較高的BMSCs。取純化的3代以上BMSCs，利用CD29、CD44、CD45抗體進行免疫熒光染色，流式細胞術檢測并分析鑒定。流式細胞術檢測CD29和CD44表達呈陽性、CD45表達呈陰性即認定為是BMSCs。
1.2.2 胰島細胞的分離純化及鑒定
采用隨機數字表法隨機抽取SD大鼠10只，禁食12 h、禁水6 h，水合氯醛5%濃度腹腔注射（劑量為0.7 mL/100 g）麻醉；然后消毒后橫行切開腹壁進腹，顯露十二指腸，分別用小號血管鉗結扎十二指腸降部與膽總管匯合處上下兩端，用小號頭皮靜脈穿刺針通過膽總管注入4 ℃的0.5 g/L膠原酶溶液7.5 mL，使胰腺充分膨脹以破壞及消化腺泡組織，持續約5 min后鈍性分離并完整取出膨脹的胰腺組織并置入裝有膠原酶溶液的消化管中，于37 ℃水浴靜止消化15 min后取出胰腺，在冰浴中剪碎胰腺組織后移回消化管中，37 ℃水浴振蕩消化15 min后間斷吹打，間斷取樣于光學顯微鏡下觀察消化程度，當見到外分泌腺較為分散、胰島細胞團已從外分泌腺中游離出來且包膜完整時終止消化，立即加入4 ℃Hanks液（含5%胎牛血清），吸管反復吹打，自然沉降，棄去上清液，反復3次。采用無菌不銹鋼濾網過濾并收集沉降物待檢。沉淀物中加25% Ficoll400溶液4 mL輕輕吹打混勻，最后緩慢依次滴入23%、20%、11% Ficoll400溶液和Hanks液各2 mL（均不混勻），4 ℃離心2 min，吸出23%～20%及20%～11%界面的胰島細胞，用4 ℃ Hanks液于50 mL離心管內離心洗滌2次備用。轉入培養成分含有濃度為10%的胎牛血清、相同濃度的谷氨酰胺及100 U/mL的雙抗培養基中進行培養。培養條件為37 ℃、5% CO2。體外培養1周后用雙硫腙行胰島細胞鑒定，用丫啶橙和碘丙啶檢測胰島細胞活性，同時于細胞計數板上計算所獲胰島細胞的數量。
1.2.3 大鼠糖尿病模型的建立
SD大鼠40只，按50 mg/kg鏈脲佐菌素于SD大鼠腹腔內注射，然后連續檢測空腹血糖3次，每次空腹血糖≥16.7 mmol/L；然后隨著病程的進展，在一般狀態下觀察大鼠逐漸出現多飲、多食、多尿、毛發失去光澤、脫毛、消瘦、活動減少等表現時認為糖尿病建模成功。于移植前第7、3、1天以及移植后第1、3、7、15、21、29天采空腹靜脈血采用血糖儀檢測血糖水平。
1.2.4 大鼠移植實驗
對SD糖尿病大鼠40只采用隨機數字表法隨機均分為對照組、胰島細胞組、BMSCs組及聯合移植組4組。對照組大鼠接受開腹手術后于胰腺被膜下注射等量生理鹽水；胰島細胞組和BMSCs組于大鼠胰腺被膜下分別移植1 000個胰島細胞和含1×106個BMSCs；聯合移植組同時于大鼠胰腺被膜下移植1 000個胰島細胞和含1×106個BMSCs。然后于移植后第1、3、7、15、29天采血采用放射免疫方法檢測胰島素水平。
1.2.5 移植胰腺組織的病理學檢測及移植胰腺組織中血管相關因子HIF-1α、SDF1α、VEGF、FGF2 mRNA表達量檢測
于術后第15、30天分別處死各組一半數量大鼠，然后取出胰腺組織按長軸方向分成2份，其中一份胰腺組織用于RT-PCR檢測HIF-1α、SDF-1α、VEGF、FGF2 mRNA在移植部位的表達量，每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度并記錄在電腦軟件中，通過對每個樣品Ct值的計算獲得半定量結果；另一份胰腺組織于10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制作5 mm冰凍切片，常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色并在顯微鏡下觀察胰島及血管分布情況；胰腺組織切片經脫蠟水化后先與一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等二抗進行反應，再用堿性磷酸酶結合，最后通過呈色反應來顯示組織或細胞中的化學成分，在光學顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物。結果判斷標準：以細胞質和（或）細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞。
1.3 統計學方法
應用SPSS 25.0軟件對數據進行統計學分析。經正態性檢驗符合正態分布的計量資料用均數±標準差（
±s）表示。血糖和胰島素水平比較用重復測量方差分析、血管相關因子mRNA表達量經方差齊性檢驗方差齊時用方差分析，在差異有統計學意義時進一步用LSD法做兩兩比較。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 的分離、培養與鑒定結果
培養至第21天時，第3代BMSCs成熟、穩定且活性高，之后會出現不同程度細胞老化現象（圖1a~1f），故選取第3代培養細胞行流式細胞術檢測分析及免疫熒光染色。結果顯示，BMSCs中CD29和CD44表達呈陽性、CD45表達呈陰性（圖1g~1i）。DAPI 標記的 BMSCs，胞核可見明亮藍色熒光（圖1j）。CD29、CD44及CD45免疫熒光染色顯示BMSCs細胞質及細胞核均染熒光綠色，可以清楚顯示整個細胞形態（圖1k~1m）。
圖1
示BMSCs培養及鑒定結果
a~f：分別為培養至第3天（a）、第7天第1代（b）、第14天第2代（c）、第21天第3代（d）、第28天第4代（e）、第35天第5代（f）時的BMSCs（ ×10）；g~i：流式細胞儀檢測培養至第21天時熒光標記的BMSCs中CD29（g）和CD44（h）陽性、CD45（i）陰性；j：DAPI標記的BMSCs（ ×10）；k~m：免疫熒光染色檢測BMSCs中CD29（k）、CD44（l）、CD45（m）表達（ ×10）
2.2 胰島細胞的分離、培養及鑒定
第7天收集到的胰島細胞團完整，其直徑為100~300 μm的胰島細胞占80%。每只大鼠平均可獲得約500個胰島細胞。經雙硫腙染色顯示呈橘紅色的胰島細胞純度達90%。將純化的胰島細胞用丫啶橙/碘丙啶染色，在熒光顯微鏡下見胰島細胞團呈亮綠色熒光，證明胰島細胞存活良好（圖2a~2d）。
圖2
示胰島細胞培養及鑒定結果、移植后胰島組織病理學檢測結果以及術后血糖和胰島素水平變化情況
a~d：分別為培養第3天（a）、第1代（b）、雙硫腙染色（c）及丫啶橙/碘丙啶染色（d）的胰島細胞（ ×10）； e~h：分別為對照組（e）、胰島細胞組（f）、BMSCs組（g）及聯合移植組（h）的胰腺組織病理學結果（HE染色 ×400）；i~l：分別聯合移植組胰腺組織中HIF-1α（i）、SDF-1α（j）、VEGF（k）、FGF2（l）蛋白表達結果（免疫組織化學染色 ×400）；m~p：分別為移植術后15 d內和術后29 d內血糖（m、n）和胰島素（o、p）水平變化情況
2.3 移植后胰腺組織病理學觀察結果
第30天時處死大鼠取胰腺組織，HE染色結果見聯合移植組具有更多的胰島細胞及較豐富的血管，胰島細胞組胰島細胞數量及大小均不如聯合移植組，對照組及BMSCs組胰島形態較小甚至萎縮且血管數量明顯減少（圖2e~2h）。對聯合移植組的胰腺組織進行免疫組織化學染色可見胰島細胞質中HIF-1α、SDF-1α、VEGF及FGF2顯色明顯（圖2i~2l），表現為細胞質和（或）細胞核出現棕黃色顆粒，提示胰島細胞內HIF-1α、SDF-1α、VEGF、FGF2蛋白較胰腺腺泡細胞強表達。
2.4 移植后各組大鼠血糖及胰島素水平檢測結果
因各組移植術后第15天時處死一半大鼠，故在15 d內將各組全部數據納入分析，第15天后將每組剩余5只大鼠數據納入分析。移植術后15 d和29 d內血糖和胰島素水平變化情況見圖2m~2p。
2.4.1 血糖水平
① 移植術后15 d內的球形檢驗：W=0.595，P=0.620。各組不同時間點血糖水平差異比較的時間和組別主效應均有統計學意義（時間：F=378.425，P<0.001；組別：F=111.459，P<0.001），時間與組別的交互效應有統計學意義（F=48.166，P<0.001）。組間比較，血糖水平在術前各時間點各組間總體比較差異均無統計學意義（P>0.05），術后各時間點各組間總體比較差異均有統計學意義（P<0.05）；組內比較，各組不同時間點血糖水平總體比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表1和圖2m。② 移植術后29 d內的球形檢驗：W=0.130，P=0.856。各組不同時間點血糖水平差異比較的時間和組別主效應均有統計學意義（時間：F=299.298，P<0.001；組別：F=178.737，P<0.001），時間與組別的交互效應有統計學意義（F=46.536，P<0.001）。組間比較， 除術前第7天外，其他各時點各組血糖水平總體比較差異有統計學意義（P<0.05）；組內比較， 各組不同時間點血糖水平總體比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表2和圖2n。
表1
術前及術后15 d內各組不同時間點血糖水平比較（
，mmol/L）
表2
術前及術后29 d內各組不同時間點血糖水平比較（
，mmol/L）
2.4.2 胰島素水平
① 移植術后15 d內的球形檢驗：W=0.900，P=0.599。各組不同時間點胰島素水平差異比較的時間和組別主效應有統計學意義（時間：F=879.689，P<0.001；組別：F=6084.273，P<0.001），時間與組別的交互效應有統計學意義（F=372.785，P<0.001）。組間比較，術后各時間點各組胰島素水平總體比較差異均有統計學意義（P<0.05）；組內比較，胰島細胞組及聯合移植組不同時間點胰島素水平總體比較差異有統計學意義（P<0.05），其他各組不同時間點胰島素水平總體比較差異無統計學意義（P>0.05），見表3和圖2o。② 移植術后29 d內球形檢驗：W=0.593，P=0.584。各組不同時間點胰島素水平差異比較的時間和組別主效應均有統計學意義（時間：F=577.695，P<0.001；組別：F=6 087.146，P<0.001），時間與組別的交互效應有統計學意義（F=225.336，P<0.001）。組間比較，各時間點各組胰島素水平總體比較差異均有統計學意義（P<0.05）；組內比較，胰島細胞組及聯合移植組不同時間點胰島素水平總體比較差異有統計學意義（P<0.05），其他各組不同時間點胰島素水平差異無統計學意義（P>0.05），見表4和圖2p。
表3
術后15 d內各組術后不同時間點胰島素水平比較（
，μU/mL）
表4
術后29 d內術后不同時間點各組間胰島素水平比較（
，μU/mL）
2.5 移植后各組大鼠血管相關因子mRNA表達情況
4組大鼠胰腺組織中FGF2、HIF-1α、SDF-1α及VEGF mRNA相對表達量總體比較差異均有統計學意義（分別：F=5.151，P=0.005；F=4.561，P=0.008；F=7.509，P=0.001；F=5.322，P=0.004）。聯合移植組FGF2、HIF-1α、SDF-1α及VEGF相對表達量均分別高于其他3組且差異有統計學意義（P<0.05），其他3組（對照組、胰島細胞組、BMSCs組）間兩兩比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表5。
表5
移植后各組大鼠血管相關因子的mRNA表達情況（
）
3 討論
目前胰島素治療還不是治療糖尿病的理想手段[1]，有文獻[2]報道胰島移植治療糖尿病較為理想，但移植后隨訪5年的患者中不依賴胰島素治療的比例低于10%，因而需要進一步研究提高移植胰島存活率的方法。
3.1 BMSCs的培養
BMSCs有多向分化及高度增殖潛力，可定向分化為神經細胞、成骨細胞、軟骨細胞等，而且不表達主要組織相容性復合物Ⅱ類抗原而僅表達Ⅰ類抗原，因而具有較低的免疫原性，其免疫抑制和免疫調節作用備受關注[7]。采用自體骨髓細胞移植無免疫排斥，在組織工程、細胞移植、基因治療等方面已被廣泛應用。目前用于分離BMSCs的方法有依據細胞的密度來分離的密度梯度離心法、依據與底物黏附特性來分離的貼壁篩選法、依據細胞體積進行流式細胞儀分離法及依據細胞表面特異性抗原進行免疫磁珠分離法，其中貼壁篩選法具有經濟實用、操作簡便等優點，也是目前實驗室應用最多的BMSCs培養方法。CD44、CD29目前被認為是BMSCs的重要標志抗原，CD45則是骨髓造血干細胞的重要標志抗原[8-12]。本研究中采用貼壁篩選法進行分離培養并經流式細胞儀檢測，分離結果發現，CD29、CD44陽性而CD45陰性，鑒定了培養擴增的細胞為BMSCs。
3.2 胰島細胞的分離純化
純化后體積大而完整的胰島細胞主要分布在23%～20%及20%～11%之間的界面，而25%～23%界面間的胰島細胞為體積較小的胰島細胞[13-15]，直徑50 μm的多為消化過度、結構不完整的胰島細胞，收集意義不大，故本研究采用Ficoll400濃度為23%～20%及20%～11%的界面收集并純化胰島細胞，可在此界面處收集到結構完整、純度高的胰島細胞，本研究中的方法既減少了梯度純化的操作步驟，又獲得了較純化的胰島細胞，可以節約時間、提高胰島細胞活性。
3.3 移植后胰島功能觀察
3.3.1 血糖水平
本研究中對照組和BMSCs組在整個觀察期內血糖水平均高于正常水平，術后第1天達峰值；胰島細胞組和聯合移植組于術后第1天達峰值后急速下降，至第15天時降至正常，胰島細胞組于術后第15天后出現反彈并高于正常水平，而聯合移植組一直呈下降趨勢且維持在正常水平。分析其原因，各組在術后第1天血糖均明顯高于本組術前水平，考慮是術后應激性血糖升高可能。單純胰島細胞組在術后第15天血糖降至正常，表明移植胰島參與了胰島素分泌活動，但該組術后第21、29天血糖逐漸升高，提示移植胰島可能失去功能；聯合移植組術后第15、21、29天均降至正常，提示移植胰島細胞能夠在較長內持續且穩定地參與胰島素釋放活動。
3.3.2 胰島素水平
本研究中發現，對照組和BMSCs組胰島素水平較低且基本穩定；胰島細胞組和聯合移植組于術后第1天至第3天均呈上升趨勢，峰值出現在術后第3天，術后第7天開始下降，在觀察時間范圍之內術后第29天時達到最低值。聯合移植組術后的胰島素水平均高于胰島細胞組。分析其原因，包含有胰島細胞的移植組（胰島細胞組、聯合移植組），無論是單純移植組還是聯合移植組，胰島素釋放水平較移植前明顯升高且明顯高于其他組同期水平，提示移植的胰島參與了胰島素釋放活動，但這2組胰島素水平在移植術后第7、15、29天仍表現為下降趨勢，單純胰島細胞組下降趨勢尤為明顯，提示各組均有不同程度的移植胰島失去功能，且單純胰島移植后胰島失功更為明顯。僅行BMSCs移植組胰島素水平與對照組相似，較本組術前及同期對照組無明顯變化，提示單純BMSCs移植短期內不能促進胰島素釋放水平。有研究[16]也提出，聯合高糖、胰高血糖素樣肽-1、活化素A、尼克酰胺等因子可以在體外誘導人BMSCs分化為胰島素分泌細胞，但胰島素分泌水平較低。
3.4 血管生成相關因子與BMSCs的相互作用
HIF-1α在調節缺氧誘導的基因表達過程中起著關鍵性作用[4]，HIF-1α參與體內氧代謝相關的信號通路的調控。BMSCs能夠通過增強胰島細胞對缺血再灌注的抵抗而提高抗凋亡基因的表達[3]，缺氧可以上調SDF1α的表達[6]，高表達SDF1α的BMSCs能更有效促進急性心肌梗死血管形成[17]。VEGF、FGF2可以刺激內皮細胞分泌集中蛋白酶和蛋白酶活化因子，從而導致血管基底膜的降解，細胞得以侵入周圍基質，遷移、增殖，最終分化而形成一個新的含有一個空腔的血管，且VEGF及FGF2與HIF-1α表達呈正相關[18-19]。在本研究中發現，HIF-1α、SDF-1α、VEGF、FGF2 mRNA相對表達量在聯合移植組最高，在對照組最低，胰島細胞組及BMSCs組介入這2組之間，這4個指標在聯合移植組中均高于其他3組（P<0.05）。HE染色結果見聯合移植組較其他組比較具有更多的胰島細胞及較豐富的血管。聯合移植組免疫組織化學染色結果中可見胰島細胞質中HIF-1α、SDF-1α、VEGF及FGF2呈陽性且部分血管壁有顯色，結果提示，聯合移植組較其他組血管生成相關因子（HIF-1α、SDF-1α、VEGF、FGF2）相對高表達。雖然單純以RT-PCR檢測結果僅能提示BMSCs移植可提高血管生成相關因子表達，尚不能說明BMSCs可促進移植部位血管再生，但結合同組術后血糖及胰島素水平分析，存在移植胰島功能持續存在，有部分胰島細胞血管再通可能，并且HE染色切片也提示聯合移植組在胰島細胞數量上具有明顯優勢，并可觀察到較豐富的血管分布。提示聯合移植在胰島細胞成活率及血管再生方面具有優勢。
從本研究初步結果看，胰島細胞聯合BMSCs移植可能提高移植胰島血管再通有提示作用，但也存在一定的不足，如移植術后第15天時處死各組一半的大鼠后每組僅剩5只大鼠，術后第15天后數據樣本量過小，雖然也顯示出了差異性，但對總體的代表性有局限性；由于不能明確胰島細胞示蹤劑是否會影響移植效果，未能對移植前胰島細胞使用示蹤劑染色，故后續病理切片不能明確胰島細胞來源，有待進一步研究驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：蘇力擔卡扎·仇曼全程參與實驗過程并撰寫論文；陳啟龍對實驗設計提供理論指導；韓瑋對動物實驗環節提供技術指導；魏琴在細胞培養及鑒定過程中提供技術支持；林海、程坤在數據統計及文章撰寫過程中提供指導與幫助；聶曉寒及孫永輝收集數據與整理；何鐵英指導對論文寫作及后期修改。
倫理聲明：本研究通過了新疆醫科大學倫理委員會審批（批文編號：IACUC-20130217-01）。
志謝 感謝新疆醫科大學動物實驗中心的每一位老師在動物造模、養殖及手術過程中提供的幫助。
目前胰島素治療尚不能使所有糖尿病患者血糖得到理想控制[1]。胰島移植是目前治療糖尿病較理想的手段，然而移植后患者體內功能性胰島細胞存活無法長期維持[2]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能通過增強胰島細胞對缺血再灌注的抵抗而提高抗凋亡基因表達[3]。缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在調節缺氧誘導的基因表達過程中、局部血管生成與重塑、調節機體組織和器官氧分布、對缺氧耐受力等方面發揮重要生理作用[4-5]。在細胞移植治療缺血性疾病過程中，細胞歸巢的效率會影響移植效果，而基質細胞衍生因子1α（stromal derived factor 1α，SDF1α）是調控細胞歸巢的主要因子，可受到缺血缺氧、HIF-1α、各種血管因子影響及調控移植細胞移動而發揮作用[6]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子2（basic fibroblast growth factor 2，FGF2）是促進血管形成的重要因子，其轉錄受HIF-1α依賴性調控，這4種血管相關因子很可能在缺氧環境中相互作用、相互影響，而胰島細胞移植正是提供了這樣的環境。因此，本研究通過胰腺被膜下胰島細胞聯合BMSCs移植，觀察其是否更有利于促進胰島血管再通，進而減少移植后胰島細胞丟失，從而提高胰島移植成功率。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑和儀器
1.1.1 實驗動物
清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠54只，3～4周齡，體質量（200±20）g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供 ［實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003］。
1.1.2 主要試劑及儀器
雙硫腙、丫啶橙、碘丙啶、4,6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）、CD44 FITC小鼠抗大鼠、CD45 PE-Cy小鼠抗大鼠、CD29 PE倉鼠抗大鼠均來自Sigma公司；優級胎牛血清來自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM和RPMI 1640細胞培養液均來自Gibco公司；淋巴細胞分離液來自天津灝洋生物技術公司；聚蔗糖Ficoll400來自生興生物技術（南京）有限公司；膠原酶Ⅴ來自北京方程生物科技有限公司；胰蛋白酶來自東恒華道生物科技有限公司；鏈脲佐菌素溶液、谷氨酰胺均來自廣州賽業公司；血糖儀來自中國臺灣厚美德生物科技股份有限公司；LCZ-5-2型低溫自動平衡離心機、熒光實時定量PCR（ real-time quantitative PCR，RT-PCR）檢測儀、流式細胞儀均來自美國Becton Dickinson公司；倒置顯微鏡來自德國Leica公司；CO2培養箱來自中國香港力康生物醫療科技控股集團。
1.2 方法
1.2.1 BMSCs的分離、培養與鑒定
采用隨機數字表法隨機抽取SD大鼠4只，處死后在無菌條件下分離大鼠股骨和脛骨，采用密度梯度離心與貼壁培養法相結合，以Percoll分離液對骨髓細胞進行密度梯度離心，去除大部分造血干細胞，再根據BMSCs具有較強的黏附能力這一特性定期更換培養液，以除去黏附能力較弱的細胞，獲得純度較高的BMSCs。取純化的3代以上BMSCs，利用CD29、CD44、CD45抗體進行免疫熒光染色，流式細胞術檢測并分析鑒定。流式細胞術檢測CD29和CD44表達呈陽性、CD45表達呈陰性即認定為是BMSCs。
1.2.2 胰島細胞的分離純化及鑒定
采用隨機數字表法隨機抽取SD大鼠10只，禁食12 h、禁水6 h，水合氯醛5%濃度腹腔注射（劑量為0.7 mL/100 g）麻醉；然后消毒后橫行切開腹壁進腹，顯露十二指腸，分別用小號血管鉗結扎十二指腸降部與膽總管匯合處上下兩端，用小號頭皮靜脈穿刺針通過膽總管注入4 ℃的0.5 g/L膠原酶溶液7.5 mL，使胰腺充分膨脹以破壞及消化腺泡組織，持續約5 min后鈍性分離并完整取出膨脹的胰腺組織并置入裝有膠原酶溶液的消化管中，于37 ℃水浴靜止消化15 min后取出胰腺，在冰浴中剪碎胰腺組織后移回消化管中，37 ℃水浴振蕩消化15 min后間斷吹打，間斷取樣于光學顯微鏡下觀察消化程度，當見到外分泌腺較為分散、胰島細胞團已從外分泌腺中游離出來且包膜完整時終止消化，立即加入4 ℃Hanks液（含5%胎牛血清），吸管反復吹打，自然沉降，棄去上清液，反復3次。采用無菌不銹鋼濾網過濾并收集沉降物待檢。沉淀物中加25% Ficoll400溶液4 mL輕輕吹打混勻，最后緩慢依次滴入23%、20%、11% Ficoll400溶液和Hanks液各2 mL（均不混勻），4 ℃離心2 min，吸出23%～20%及20%～11%界面的胰島細胞，用4 ℃ Hanks液于50 mL離心管內離心洗滌2次備用。轉入培養成分含有濃度為10%的胎牛血清、相同濃度的谷氨酰胺及100 U/mL的雙抗培養基中進行培養。培養條件為37 ℃、5% CO2。體外培養1周后用雙硫腙行胰島細胞鑒定，用丫啶橙和碘丙啶檢測胰島細胞活性，同時于細胞計數板上計算所獲胰島細胞的數量。
1.2.3 大鼠糖尿病模型的建立
SD大鼠40只，按50 mg/kg鏈脲佐菌素于SD大鼠腹腔內注射，然后連續檢測空腹血糖3次，每次空腹血糖≥16.7 mmol/L；然后隨著病程的進展，在一般狀態下觀察大鼠逐漸出現多飲、多食、多尿、毛發失去光澤、脫毛、消瘦、活動減少等表現時認為糖尿病建模成功。于移植前第7、3、1天以及移植后第1、3、7、15、21、29天采空腹靜脈血采用血糖儀檢測血糖水平。
1.2.4 大鼠移植實驗
對SD糖尿病大鼠40只采用隨機數字表法隨機均分為對照組、胰島細胞組、BMSCs組及聯合移植組4組。對照組大鼠接受開腹手術后于胰腺被膜下注射等量生理鹽水；胰島細胞組和BMSCs組于大鼠胰腺被膜下分別移植1 000個胰島細胞和含1×106個BMSCs；聯合移植組同時于大鼠胰腺被膜下移植1 000個胰島細胞和含1×106個BMSCs。然后于移植后第1、3、7、15、29天采血采用放射免疫方法檢測胰島素水平。
1.2.5 移植胰腺組織的病理學檢測及移植胰腺組織中血管相關因子HIF-1α、SDF1α、VEGF、FGF2 mRNA表達量檢測
于術后第15、30天分別處死各組一半數量大鼠，然后取出胰腺組織按長軸方向分成2份，其中一份胰腺組織用于RT-PCR檢測HIF-1α、SDF-1α、VEGF、FGF2 mRNA在移植部位的表達量，每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度并記錄在電腦軟件中，通過對每個樣品Ct值的計算獲得半定量結果；另一份胰腺組織于10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制作5 mm冰凍切片，常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色并在顯微鏡下觀察胰島及血管分布情況；胰腺組織切片經脫蠟水化后先與一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等二抗進行反應，再用堿性磷酸酶結合，最后通過呈色反應來顯示組織或細胞中的化學成分，在光學顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物。結果判斷標準：以細胞質和（或）細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞。
1.3 統計學方法
應用SPSS 25.0軟件對數據進行統計學分析。經正態性檢驗符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示。血糖和胰島素水平比較用重復測量方差分析、血管相關因子mRNA表達量經方差齊性檢驗方差齊時用方差分析，在差異有統計學意義時進一步用LSD法做兩兩比較。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 的分離、培養與鑒定結果
培養至第21天時，第3代BMSCs成熟、穩定且活性高，之后會出現不同程度細胞老化現象（圖1a~1f），故選取第3代培養細胞行流式細胞術檢測分析及免疫熒光染色。結果顯示，BMSCs中CD29和CD44表達呈陽性、CD45表達呈陰性（圖1g~1i）。DAPI 標記的 BMSCs，胞核可見明亮藍色熒光（圖1j）。CD29、CD44及CD45免疫熒光染色顯示BMSCs細胞質及細胞核均染熒光綠色，可以清楚顯示整個細胞形態（圖1k~1m）。
圖1
示BMSCs培養及鑒定結果
a~f：分別為培養至第3天（a）、第7天第1代（b）、第14天第2代（c）、第21天第3代（d）、第28天第4代（e）、第35天第5代（f）時的BMSCs（ ×10）；g~i：流式細胞儀檢測培養至第21天時熒光標記的BMSCs中CD29（g）和CD44（h）陽性、CD45（i）陰性；j：DAPI標記的BMSCs（ ×10）；k~m：免疫熒光染色檢測BMSCs中CD29（k）、CD44（l）、CD45（m）表達（ ×10）
2.2 胰島細胞的分離、培養及鑒定
第7天收集到的胰島細胞團完整，其直徑為100~300 μm的胰島細胞占80%。每只大鼠平均可獲得約500個胰島細胞。經雙硫腙染色顯示呈橘紅色的胰島細胞純度達90%。將純化的胰島細胞用丫啶橙/碘丙啶染色，在熒光顯微鏡下見胰島細胞團呈亮綠色熒光，證明胰島細胞存活良好（圖2a~2d）。
圖2
示胰島細胞培養及鑒定結果、移植后胰島組織病理學檢測結果以及術后血糖和胰島素水平變化情況
a~d：分別為培養第3天（a）、第1代（b）、雙硫腙染色（c）及丫啶橙/碘丙啶染色（d）的胰島細胞（ ×10）； e~h：分別為對照組（e）、胰島細胞組（f）、BMSCs組（g）及聯合移植組（h）的胰腺組織病理學結果（HE染色 ×400）；i~l：分別聯合移植組胰腺組織中HIF-1α（i）、SDF-1α（j）、VEGF（k）、FGF2（l）蛋白表達結果（免疫組織化學染色 ×400）；m~p：分別為移植術后15 d內和術后29 d內血糖（m、n）和胰島素（o、p）水平變化情況
2.3 移植后胰腺組織病理學觀察結果
第30天時處死大鼠取胰腺組織，HE染色結果見聯合移植組具有更多的胰島細胞及較豐富的血管，胰島細胞組胰島細胞數量及大小均不如聯合移植組，對照組及BMSCs組胰島形態較小甚至萎縮且血管數量明顯減少（圖2e~2h）。對聯合移植組的胰腺組織進行免疫組織化學染色可見胰島細胞質中HIF-1α、SDF-1α、VEGF及FGF2顯色明顯（圖2i~2l），表現為細胞質和（或）細胞核出現棕黃色顆粒，提示胰島細胞內HIF-1α、SDF-1α、VEGF、FGF2蛋白較胰腺腺泡細胞強表達。
2.4 移植后各組大鼠血糖及胰島素水平檢測結果
因各組移植術后第15天時處死一半大鼠，故在15 d內將各組全部數據納入分析，第15天后將每組剩余5只大鼠數據納入分析。移植術后15 d和29 d內血糖和胰島素水平變化情況見圖2m~2p。
2.4.1 血糖水平
① 移植術后15 d內的球形檢驗：W=0.595，P=0.620。各組不同時間點血糖水平差異比較的時間和組別主效應均有統計學意義（時間：F=378.425，P<0.001；組別：F=111.459，P<0.001），時間與組別的交互效應有統計學意義（F=48.166，P<0.001）。組間比較，血糖水平在術前各時間點各組間總體比較差異均無統計學意義（P>0.05），術后各時間點各組間總體比較差異均有統計學意義（P<0.05）；組內比較，各組不同時間點血糖水平總體比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表1和圖2m。② 移植術后29 d內的球形檢驗：W=0.130，P=0.856。各組不同時間點血糖水平差異比較的時間和組別主效應均有統計學意義（時間：F=299.298，P<0.001；組別：F=178.737，P<0.001），時間與組別的交互效應有統計學意義（F=46.536，P<0.001）。組間比較， 除術前第7天外，其他各時點各組血糖水平總體比較差異有統計學意義（P<0.05）；組內比較， 各組不同時間點血糖水平總體比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表2和圖2n。
表1
術前及術后15 d內各組不同時間點血糖水平比較（，mmol/L）
表2
術前及術后29 d內各組不同時間點血糖水平比較（，mmol/L）
2.4.2 胰島素水平
① 移植術后15 d內的球形檢驗：W=0.900，P=0.599。各組不同時間點胰島素水平差異比較的時間和組別主效應有統計學意義（時間：F=879.689，P<0.001；組別：F=6084.273，P<0.001），時間與組別的交互效應有統計學意義（F=372.785，P<0.001）。組間比較，術后各時間點各組胰島素水平總體比較差異均有統計學意義（P<0.05）；組內比較，胰島細胞組及聯合移植組不同時間點胰島素水平總體比較差異有統計學意義（P<0.05），其他各組不同時間點胰島素水平總體比較差異無統計學意義（P>0.05），見表3和圖2o。② 移植術后29 d內球形檢驗：W=0.593，P=0.584。各組不同時間點胰島素水平差異比較的時間和組別主效應均有統計學意義（時間：F=577.695，P<0.001；組別：F=6 087.146，P<0.001），時間與組別的交互效應有統計學意義（F=225.336，P<0.001）。組間比較，各時間點各組胰島素水平總體比較差異均有統計學意義（P<0.05）；組內比較，胰島細胞組及聯合移植組不同時間點胰島素水平總體比較差異有統計學意義（P<0.05），其他各組不同時間點胰島素水平差異無統計學意義（P>0.05），見表4和圖2p。
表3
術后15 d內各組術后不同時間點胰島素水平比較（，μU/mL）
表4
術后29 d內術后不同時間點各組間胰島素水平比較（，μU/mL）
2.5 移植后各組大鼠血管相關因子mRNA表達情況
4組大鼠胰腺組織中FGF2、HIF-1α、SDF-1α及VEGF mRNA相對表達量總體比較差異均有統計學意義（分別：F=5.151，P=0.005；F=4.561，P=0.008；F=7.509，P=0.001；F=5.322，P=0.004）。聯合移植組FGF2、HIF-1α、SDF-1α及VEGF相對表達量均分別高于其他3組且差異有統計學意義（P<0.05），其他3組（對照組、胰島細胞組、BMSCs組）間兩兩比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表5。
表5
移植后各組大鼠血管相關因子的mRNA表達情況（）
3 討論
目前胰島素治療還不是治療糖尿病的理想手段[1]，有文獻[2]報道胰島移植治療糖尿病較為理想，但移植后隨訪5年的患者中不依賴胰島素治療的比例低于10%，因而需要進一步研究提高移植胰島存活率的方法。
3.1 BMSCs的培養
BMSCs有多向分化及高度增殖潛力，可定向分化為神經細胞、成骨細胞、軟骨細胞等，而且不表達主要組織相容性復合物Ⅱ類抗原而僅表達Ⅰ類抗原，因而具有較低的免疫原性，其免疫抑制和免疫調節作用備受關注[7]。采用自體骨髓細胞移植無免疫排斥，在組織工程、細胞移植、基因治療等方面已被廣泛應用。目前用于分離BMSCs的方法有依據細胞的密度來分離的密度梯度離心法、依據與底物黏附特性來分離的貼壁篩選法、依據細胞體積進行流式細胞儀分離法及依據細胞表面特異性抗原進行免疫磁珠分離法，其中貼壁篩選法具有經濟實用、操作簡便等優點，也是目前實驗室應用最多的BMSCs培養方法。CD44、CD29目前被認為是BMSCs的重要標志抗原，CD45則是骨髓造血干細胞的重要標志抗原[8-12]。本研究中采用貼壁篩選法進行分離培養并經流式細胞儀檢測，分離結果發現，CD29、CD44陽性而CD45陰性，鑒定了培養擴增的細胞為BMSCs。
3.2 胰島細胞的分離純化
純化后體積大而完整的胰島細胞主要分布在23%～20%及20%～11%之間的界面，而25%～23%界面間的胰島細胞為體積較小的胰島細胞[13-15]，直徑50 μm的多為消化過度、結構不完整的胰島細胞，收集意義不大，故本研究采用Ficoll400濃度為23%～20%及20%～11%的界面收集并純化胰島細胞，可在此界面處收集到結構完整、純度高的胰島細胞，本研究中的方法既減少了梯度純化的操作步驟，又獲得了較純化的胰島細胞，可以節約時間、提高胰島細胞活性。
3.3 移植后胰島功能觀察
3.3.1 血糖水平
本研究中對照組和BMSCs組在整個觀察期內血糖水平均高于正常水平，術后第1天達峰值；胰島細胞組和聯合移植組于術后第1天達峰值后急速下降，至第15天時降至正常，胰島細胞組于術后第15天后出現反彈并高于正常水平，而聯合移植組一直呈下降趨勢且維持在正常水平。分析其原因，各組在術后第1天血糖均明顯高于本組術前水平，考慮是術后應激性血糖升高可能。單純胰島細胞組在術后第15天血糖降至正常，表明移植胰島參與了胰島素分泌活動，但該組術后第21、29天血糖逐漸升高，提示移植胰島可能失去功能；聯合移植組術后第15、21、29天均降至正常，提示移植胰島細胞能夠在較長內持續且穩定地參與胰島素釋放活動。
3.3.2 胰島素水平
本研究中發現，對照組和BMSCs組胰島素水平較低且基本穩定；胰島細胞組和聯合移植組于術后第1天至第3天均呈上升趨勢，峰值出現在術后第3天，術后第7天開始下降，在觀察時間范圍之內術后第29天時達到最低值。聯合移植組術后的胰島素水平均高于胰島細胞組。分析其原因，包含有胰島細胞的移植組（胰島細胞組、聯合移植組），無論是單純移植組還是聯合移植組，胰島素釋放水平較移植前明顯升高且明顯高于其他組同期水平，提示移植的胰島參與了胰島素釋放活動，但這2組胰島素水平在移植術后第7、15、29天仍表現為下降趨勢，單純胰島細胞組下降趨勢尤為明顯，提示各組均有不同程度的移植胰島失去功能，且單純胰島移植后胰島失功更為明顯。僅行BMSCs移植組胰島素水平與對照組相似，較本組術前及同期對照組無明顯變化，提示單純BMSCs移植短期內不能促進胰島素釋放水平。有研究[16]也提出，聯合高糖、胰高血糖素樣肽-1、活化素A、尼克酰胺等因子可以在體外誘導人BMSCs分化為胰島素分泌細胞，但胰島素分泌水平較低。
3.4 血管生成相關因子與BMSCs的相互作用
HIF-1α在調節缺氧誘導的基因表達過程中起著關鍵性作用[4]，HIF-1α參與體內氧代謝相關的信號通路的調控。BMSCs能夠通過增強胰島細胞對缺血再灌注的抵抗而提高抗凋亡基因的表達[3]，缺氧可以上調SDF1α的表達[6]，高表達SDF1α的BMSCs能更有效促進急性心肌梗死血管形成[17]。VEGF、FGF2可以刺激內皮細胞分泌集中蛋白酶和蛋白酶活化因子，從而導致血管基底膜的降解，細胞得以侵入周圍基質，遷移、增殖，最終分化而形成一個新的含有一個空腔的血管，且VEGF及FGF2與HIF-1α表達呈正相關[18-19]。在本研究中發現，HIF-1α、SDF-1α、VEGF、FGF2 mRNA相對表達量在聯合移植組最高，在對照組最低，胰島細胞組及BMSCs組介入這2組之間，這4個指標在聯合移植組中均高于其他3組（P<0.05）。HE染色結果見聯合移植組較其他組比較具有更多的胰島細胞及較豐富的血管。聯合移植組免疫組織化學染色結果中可見胰島細胞質中HIF-1α、SDF-1α、VEGF及FGF2呈陽性且部分血管壁有顯色，結果提示，聯合移植組較其他組血管生成相關因子（HIF-1α、SDF-1α、VEGF、FGF2）相對高表達。雖然單純以RT-PCR檢測結果僅能提示BMSCs移植可提高血管生成相關因子表達，尚不能說明BMSCs可促進移植部位血管再生，但結合同組術后血糖及胰島素水平分析，存在移植胰島功能持續存在，有部分胰島細胞血管再通可能，并且HE染色切片也提示聯合移植組在胰島細胞數量上具有明顯優勢，并可觀察到較豐富的血管分布。提示聯合移植在胰島細胞成活率及血管再生方面具有優勢。
從本研究初步結果看，胰島細胞聯合BMSCs移植可能提高移植胰島血管再通有提示作用，但也存在一定的不足，如移植術后第15天時處死各組一半的大鼠后每組僅剩5只大鼠，術后第15天后數據樣本量過小，雖然也顯示出了差異性，但對總體的代表性有局限性；由于不能明確胰島細胞示蹤劑是否會影響移植效果，未能對移植前胰島細胞使用示蹤劑染色，故后續病理切片不能明確胰島細胞來源，有待進一步研究驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：蘇力擔卡扎·仇曼全程參與實驗過程并撰寫論文；陳啟龍對實驗設計提供理論指導；韓瑋對動物實驗環節提供技術指導；魏琴在細胞培養及鑒定過程中提供技術支持；林海、程坤在數據統計及文章撰寫過程中提供指導與幫助；聶曉寒及孫永輝收集數據與整理；何鐵英指導對論文寫作及后期修改。
倫理聲明：本研究通過了新疆醫科大學倫理委員會審批（批文編號：IACUC-20130217-01）。
志謝 感謝新疆醫科大學動物實驗中心的每一位老師在動物造模、養殖及手術過程中提供的幫助。
