引用本文： 呂海冰, 戴志成, 鄒小明. 胃癌早期診斷相關標志物的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(8): 1108-1113. doi: 10.7507/1007-9424.202010116 復制
胃癌是全球第四大常見惡性疾病且是人類惡性腫瘤相關死亡的第二大原因[1]。隨著人們生活水平的提高和醫療觀念的改變，近年來世界范圍內胃癌發病率呈下降趨勢。盡管目前有關胃癌的診斷和治療技術已經有了很大程度提高，但由于早期胃癌無特異性癥狀及體征，僅一小部分患者表現為腹痛、惡心、嘔吐等癥狀，臨床上發現的胃癌大部分為進展期胃癌，其預后較差，5 年生存率僅為 10% 左右，因此臨床醫生一直在尋求胃癌的早診、早治方法，以進一步提高胃癌患者的總生存率。內鏡篩查是目前早期診斷胃癌的主要方法，但因其檢查相關條件要求頗高、為侵入性且費用較高，而且部分患者檢查過程中會產生劇烈的惡心、嘔吐等反應，使其難以廣泛應用于胃癌的臨床篩查中，因此亟需尋找更簡便有效的胃癌早期診斷方法，進而提高胃癌患者的總生存率及改善患者預后。由于癌細胞與正常細胞在基因、轉錄、蛋白、細胞等方面都存在差異，通過監測與篩查基因、轉錄、蛋白和細胞水平的異常變化即可能及時發現與推測惡性腫瘤的發病情況，達到早期篩查的目的。腫瘤分子標志物是指在惡性腫瘤發生或發展進程中，由于腫瘤細胞的基因表達而合成分泌或由機體自身對腫瘤產生的反應而異常產生和（或）升高的各類物質[2]，分子標志物的鑒別對于腫瘤疾病的診斷、預后判斷、研發新的早期診斷工具等有重要的臨床意義，但目前由于受限于其敏感性、特異性等原因，分子標志物在腫瘤早期診斷中的應用進展相對緩慢，筆者現就近年來常見的胃癌早期診斷相關的分子標志物的研究進展作一綜述。
1 異常表達的 DNA 水平標志物
表觀遺傳系統的異常導致了多種惡性腫瘤的發生。許多研究已證實，異常的 DNA 甲基化和組蛋白修飾與進展性疾病包括惡性腫瘤有關[3]。惡性腫瘤中最廣泛的表觀遺傳學改變是異常的 DNA 甲基化[4]，其為 DNA 的化學修飾形式之一，可在不改變 DNA 原有序列的前提下改變相應的遺傳表現，屬于表觀遺傳學范疇[5]。人類 DNA 甲基化發生在鳥嘌呤之前的胞嘧啶殘基上，稱為 CpG 二核苷酸，基因啟動子區域異常的 DNA 甲基化導致抑癌基因等惡性腫瘤相關基因失活，是胃癌中最明確的表觀遺傳帶[3]。已有研究證實多種抑癌基因如 p16、RASSF10、RASSF1A、RPRM、RUNX3 等的啟動子甲基化與胃癌發生、發展等有著密不可分的關系。最早發現的細胞周期依賴的蛋白激酶抑制劑就是 p16 啟動子異常甲基化，p16 異常甲基化可導致相應的抑癌基因失去活性，進而促使胃癌的發生和發展，p16 的異常甲基化是胃癌發生過程中的一個早期分子事件，因此，它可以作為胃癌早期診斷的一種檢測指標[6]。Guo 等[7]對 106 例早期胃癌患者和 18 例健康者的外周血樣本進行甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）分析，結果發現，在早期胃癌患者的胃癌組織中 p16 基因的甲基化率為 72.6%，在健康者的正常胃黏膜組織中 p16 基因的甲基化率為 5.6%（1/18），此結果提示，p16 基因可作為早期胃癌診斷的潛在標志物。Peng 等[8]對 9 項關于中國胃癌患者胃癌組織中 p16 基因啟動子甲基化的研究進行 meta 分析，共涉及 487 例胃癌患者和 271 例健康對照者，發現胃癌患者的甲基化率為 28.3%～64.4%（中位甲基化率為 43.3%），健康對照者的甲基化率為 0.0%～13.3%（中位甲基化率為 0.0%），胃癌患者的甲基化率高于健康對照者（P<0.05），提示 DNA 甲基化是 p16 基因致癌的主要機制。Saliminejad 等[9]采用 MSP 方法檢測了 96 例經組織病理證實的胃腺癌患者和 88 例健康對照者外周血中 3 種抑癌基因（RASSF1A、RPRM、RUNX3）的甲基化狀態，結果發現，胃癌患者外周血中 RASSF1A、RPRM、RUNX3 的甲基化率均高于對照組（33.3% 比 0.0%、66.7% 比 6.8%、 58.3% 比 4.5%，均 P<0.001），結果提示，外周血中 RASSF1A、RPRM、RUNX3 的甲基化狀態可作為胃癌早期診斷的潛在分子標志物。Hu 等[10]使用 MSP 方法檢測了 100 例早期胃癌患者、50 例慢性胃炎患者及 45 例健康對照者的血清和腫瘤樣本中 RASSF10 啟動子的甲基化水平，結果顯示，胃癌患者中 RASSF10 啟動子的甲基化率（49/100）明顯高于慢性胃炎患者（1/50）和健康對照者（0/45），同時結果亦顯示，RASSF10 在血清和腫瘤組織間的甲基化狀態是一致的，提示檢測血清中 RASSF10 啟動子的甲基化狀態可早期診斷胃癌。總之，在 DNA 水平上啟動子的甲基化水平與胃癌的發生、發展有著密不可分的關系，基因啟動子甲基化水平的檢測可能成為胃癌早期診斷的一種潛在的理想分子標志物。
2 異常表達的 RNA 水平標志物
2.1 微小 RNA（microRNA，miRNA 或 miR）
miRNA 是指含 18～25 個核苷酸的非編碼 RNA 序列，由 DNA 轉錄而來，但不會被翻譯為蛋白質，通過與靶基因 mRNA 堿基配對降解 mRNA 或阻礙其翻譯，起到靶基因沉默作用，它廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中。miRNA 可以在人體血液中被檢測出來，其性質穩定，而且具有易于收集、分離、檢測等特點[11]。miRNA 可以通過外泌體顆粒從癌細胞釋放到體液中，這可以保護它們在循環中免受核糖核酸酶的降解。miRNA 在組織、血清或其他體液中的穩定性使其成為一種新型的惡性腫瘤生物標志物，具有不可估量的臨床潛力[12]。miRNA 種類繁多且作用也不盡完全相同，組織和血清中與胃癌早期診斷密切相關的表達上調的 miRNA 主要有 miR-196a、miR-196b、miR-19、miR-21、 miR-222，下調的 miRNA 主要有 miR-146、miR-375、Let-7[11]。Ranjbar 等[13]評估了血循環中 miR-196a 和 miR-196b 在胃癌患者中作為早期發現和預測轉移亦或兩者都有的新生物標志物的潛力，結果發現，與健康對照者相比，胃癌患者術前血循環中 miR-196a 和 miR-196b 水平明顯增高，循環中 miR-196a 或 miR-196b 水平或者二者組合對于區分早期胃癌患者和健康對照者較 CEA 或者 CA19-9 更有效，其敏感性及特異性更高；該研究還發現，在幽門螺桿菌感染的胃癌患者的血漿中 miR-146、miR-375、Let-7 的表達下調而 miR-19、miR-21 表達上調，與對照組相比，幽門螺桿菌感染的胃癌患者中與白細胞介素-1受體相關激酶 4 信號轉導通路相關的基因過表達，而 PTEN 基因卻表達下調。Emami 等[14]為了研究作為胃癌早期診斷潛在的生物標志物的血漿 miRNA 在胃癌樣本和對照組中的表達情況，采用實時定量聚合酶鏈反應評估了 30 例胃癌患者和 30 例健康對照者血漿中 miR-21 和 miR-222 的表達水平，同時通過受試者工作特征曲線來評估已選定的 miRNA 的診斷價值，結果顯示，miR-21、miR-222 在胃癌患者血漿中的表達水平明顯高于對照組（P<0.000 1、P=0.043），血漿 miR-21 的敏感性和特異性分別為 86.7% 和 72.2%，血漿 miR-222 的敏感性和特異性分別為 65.2% 和 56.2%，這些數據表明，miR-21 和 miR-222 可以作為一種潛在的胃癌早期診斷標志物。以上這些研究表明，這些循環 miRNAs 在對胃癌的早期診斷方面可能是比 CA19-9 更具有敏感性和特異性的新型生物標志物[15]。
2.2 長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）
基因組測序工程揭示，人類基因組由不到 2% 的蛋白質編碼基因組成并且 90% 以上的基因組被轉錄為非編碼 RNA[16]。lncRNAs 是一類新定義的轉錄本長度超過 200 nt 的非編碼 RNA 分子，在一系列生物學功能中均發揮著重要作用[17]。lncRNAs 可能在腫瘤的發生和發展中起作用[18]。目前的研究顯示，lncRNAs 廣泛存在于血清、血漿和其他體液中并且某些 lncRNAs 被認定為候選的生物標志物。最新的研究主要集中在 CUDR（19p13.12）、HOTAIR（12q13.13）、BLACAT1（1q32.1）、CCAT1（8q24.21）、GAPLINC（18)、H19 等 lncRNAs 上，其中 lncRNA-CUDR 能夠在血漿中被檢測到，可以將健康樣本和早期胃癌樣本區分開來，可作為胃癌早期診斷的一種標志物，有助于胃癌的早期檢測，并為進一步研究血漿 lncRNAs 在維持監測和預測預后方面的臨床價值奠定基礎[19]。H19 作為一種潛在的診斷胃癌的生物標志物，尤其是對于胃癌的早期篩查[20]，它能夠促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[21]。有研究[22]報道，與健康對照者相比，胃癌患者血漿中 H19 的水平明顯增高并可以用于鑒別早期胃癌，且腫瘤較小（<5 cm）患者的循環系統中 H19 水平高于腫瘤較大（>5 cm）者，提示 H19 對于胃癌的早期診斷可能具有潛在價值。以上研究結果提示，lncRNAs 有望成為胃癌早期診斷的標志物之一，對胃癌的早期診斷有積極意義。
2.3 環狀 RNA（circular RNAs，circRNAs）
circRNAs 是一種新的非編碼 RNAs，廣泛存在于人類的細胞和體液中，它形成一個不含有 5′ 末端和 3′ 末端的緊密閉環結構[23]。circRNAs 最早在 RNA 病毒中被發現，隨著高通量 RNA 測序、基因芯片分析等新分子技術的不斷發展，circRNAs 在所有的真核生物中被發現且為穩定、保守的序列，并通過與 miRNA 互相作用而控制基因表達[24]。circRNAs 異常表達于包括胃癌在內的多種人類疾病中，研究發現的具有生物功能和作用機制的胃癌相關 circRNAs 的數量不斷增加，其參與了胃癌的發生且與腫瘤細胞的增殖和凋亡密切相關[25]，提示 circRNAs 具有作為胃癌的新的生物標志物和治療靶點的巨大潛力[26]。另外，在惡性腫瘤中發現，circRNAs 不易被核糖核酸酶所降解，它們能夠在人類細胞、血漿及胃液中穩定表達[27]，這些發現為血漿中 circRNAs 譜的研究指引了新方向，其研究的目的在于為胃癌患者確定具有特異的診斷價值的 circRNAs。Necula 等[28]對 3 種胃癌樣本和血漿進行了 circRNAs 基因芯片檢測，以評估 circRNAs 表達譜的差異，結果發現，在患者血漿和腫瘤組織中同時都存在 3 種 circRNAs 上調和 14 種 circRNAs 下調；還通過 RT-droplet digital PCR 技術分析了 121 例胃癌患者血漿中的 circRNAs 水平，最終確定兩種 circRNAs 即 hsa-circ-0001017（30.85 倍變化）和 hsa-circ-0061276（121.54 倍變化）對胃癌具有早期診斷價值。Huang 等[29]研究證實，circRNA0026（hsa-circ-0000026）在胃癌組織中的表達顯著下調了 2.8 倍。以上研究結果提示，由于 circRNAs 在組織和血漿中的表達水平密切相關且可以穩定存在于血漿之中，因此，circRNAs 對于胃癌的早期篩查、早期診斷可能是一類有價值的生物標志物。
3 異常表達的蛋白質水平標志物
蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規律的科學，其本質是在大規模水平上研究蛋白質的特征，通過這種方式獲得在蛋白質水平上對于疾病發生、發展的整體而全面的認識，進而進一步揭示生命活動過程中的各種基因調控的機制。通過對正常個體及病理狀態下個體的蛋白質組進行對比，期望可以找到一些疾病所特有的蛋白質分子，這些分子有可能為疾病的早期診斷提供特異性分子標記。目前，蛋白質組學最常用的技術主要包括雙向凝膠電泳、質譜鑒定技術及生物信息學，并逐步向熒光差異凝膠電泳技術、同位素親和標記技術、細胞培養氨基酸穩定同位素標記技術、串聯質譜標簽法等[30]發展。通過利用蛋白質組學相關的分析技術識別出了數量相當可觀的有關早期胃癌的特異性蛋白。gastrokine 1（GKN1）是一種胃癌抑制因子，與胃癌的發生和發展有著密切的聯系[31]，它是胃組織管腔表面上皮細胞層顯著表達的一種小蛋白，參與黏膜完整性的維護并被分泌到胃內，但它在胃癌組織中表達缺失[32]。有研究[33]發現，GKN1 作為腫瘤抑制因子和凋亡信號調節因子，其低表達或缺失被認為是胃癌發生風險增高的一個因素，有助于胃癌的早期診斷。Gao 等[34]運用串聯質譜標簽法對非胃癌組織和胃癌組織進行了質膜蛋白表達水平的分析，首次發現了 flotillin 1 在胃癌和非胃癌中存在差異化表達，提出 flotillin 1 可能是潛在的一種胃癌診斷標志物，可能有利于胃癌的早期篩查和診斷。Shimura 等[35]為了發現可用于胃癌早期診斷的非侵入性生物標志物，利用來自早期胃癌患者和健康對照者的尿液樣本進行了病例對照研究，在 372 例患者尿液樣本中，年齡和性別匹配的 282 例患者被隨機分為發現隊列（n=18）、訓練隊列（n=176）及驗證隊列（n=38）3 組，在綜合定量蛋白質組學分析中發現，尿蛋白中 TFF1 和 ADAM12 水平是顯著獨立的胃癌診斷的生物標志物，可以很好地區分早期胃癌患者和健康對照者（男性的受試者操作特征曲線下面積為 0.850，女性為 0.845）。綜上，蛋白質水平生物標志物代表了一類有前途的非侵入性的胃癌早期診斷的生物標志物。
4 異常的細胞水平標志物
4.1 循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）
CTCs 是指由原發腫瘤組織脫離出來并可以進入外周血液循環系統的腫瘤細胞，它是腫瘤復發和轉移的重要因素之一，并且可增加惡性腫瘤患者的死亡風險。外周血液循環中 CTCs 檢測可用于腫瘤疾病的早期診斷、化療藥物的療效評估等。盡管 150 年前就有文獻記載過 CTCs[36]，但是直到最近幾年才證明在液體活檢中分析 CTCs 這種基于血液的診斷方式可作為組織活檢的一種替代，已成為實時監測惡性腫瘤發展的工具和管理策略[37]。大多數分泌進入外周血液循環的腫瘤細胞的預期壽命比較短，只有少數高活性的腫瘤細胞才擁有高的轉移潛能，在循環系統中存活下來且最終聚集成簇，從而形成腫瘤微血栓[38]。因而外周血系統中的 CTCs 是腫瘤發生的一種可能評估指標。Kang 等[39]對 116 例胃癌患者和 31 名健康志愿者進行了前瞻性研究，結果顯示，在 102 例被檢測出 CTCs 水平≥2 個 CTCs/7.5 mL 血液的人群中有 99 例（97.1%）患有胃癌，同時 CTCs 對于區分胃癌患者和健康對照者的敏感性和特異性分別為 85.3% 和 90.3%，提示 CTCs 檢測可以作為胃癌早期診斷的生物標志物。郭迎雪等[40]選擇了 80 例經病理結果證實為胃癌的患者作為研究組，并以 50 例慢性胃炎患者以及 50 名健康志愿者作為對照組，分別對各組外周血中的 CTCs 進行檢測，結果顯示，健康對照組（4.0%）和慢性胃炎組（10.0%）外周血的 CTCs 檢出率都明顯低于胃癌組（65.0%) ，提示 CTCs 或許可以成為診斷胃癌的一種新的生物標志物且可能有助于胃癌的早期診斷。由于有許多基因和表觀遺傳學的畸變可以激活癌基因、促進腫瘤進展，因此開發出了分子分析技術來檢測血漿中的 CTCs，以發現腫瘤特異性的畸變。此外，一些針對特定腫瘤相關抗原的自身抗體已經被確認，這些抗體由癌細胞表達且在診斷 5 年前就可以在血漿中檢測到[41]。因此，CTCs 及其表達的自身抗體有可能成為胃癌早期診斷的潛在標志物，對于早期發現胃癌具有重要臨床意義。
4.2 循環游離 DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）
cfDNA 是指來源于正常或癌細胞、游離于細胞之外且可以在血液中檢測到的 DNA[42]。來源于原發腫瘤組織、轉移灶或 CTCs 的這部分 cfDNA 稱之為 ctDNA。與傳統生物活檢的局限性相比，ctDNA 檢測具有取材方便、侵襲性更小、可重復性高等優點，而且有證據[43]表明 ctDNA 可以在惡性腫瘤患者早期階段的血漿中被檢測出來；此外，ctDNA 已被證明比 CTCs 具有更高的敏感性[44]。有一系統分析[45]研究結果顯示，ctDNA 檢測在胃癌診斷的特異性方面具有明顯優勢，而在敏感性方面未檢測到 ctDNA 優于傳統的蛋白生物標志物如 CEA、CA125、CA724 等。cfDNA 檢測顯示 EB 病毒 DNA 在診斷 EB 病毒相關的胃癌亞型、監測腫瘤進展等方面有重要作用[46]。Qian 等[47]采用 Alu-qPCR 方法研究了 124 例胃癌患者、64 例胃良性疾病患者和 92 例健康對照者血清中 cfDNA 的水平，結果顯示，胃癌患者 cfDNA 水平明顯高于胃良性疾病患者及健康對照者（P<0.05)，且發現胃癌患者血清的 cfDNA 水平與腫瘤 TNM 分期（Ⅲ、Ⅳ期）和腫瘤大小（>5 cm）相關，而與性別、年齡等無關。由于 cfDNA 水平檢測不需要任何關于腫瘤組織遺傳改變的先驗知識，因此該檢測在胃癌的早期診斷中具有重要意義，提示其具有作為胃癌早期診斷的生物標志物的潛力。
4.3 外泌體
外泌體是指由細胞分泌出來的直徑 30～100 nm 的一種囊泡小體，其內含有大量的物質包括核酸、蛋白質、酶等，然而它們由于能夠在細胞間傳遞從 RNA 到蛋白質等不同的分子信號而被眾所周知[48]。有關惡性腫瘤的研究[49]已經證明，外泌體能夠傳遞特定蛋白質和核酸給腫瘤微環境中的接受細胞或傳遞到特定的遠距離位置。外泌體的獨特表達模式和相對穩定的內容物使其成為腫瘤液體活檢的一種新候選物，其具有作為胃癌早期診斷的生物標志物的巨大潛力[50]。Fu 等[51]團隊的研究揭示了胃癌患者血清外泌體中 TRIM3 蛋白水平明顯低于健康對照者。Shi 等[52]最近研究發現，循環中外泌體來源的 miR-1246 在胃癌患者中的表達顯著上調，而且證明了血清中外泌體來源的 miR-1246 的升高是由腫瘤所引起的，這為胃癌的早期診斷提供了一個新的潛在的外泌體來源的生物標志物。有研究[53]表明，外泌體作為天然的納米載體不斷地脫離各種類型細胞，與其他細胞外囊泡家族相比，外泌體的生物形成是在嚴格的加載機制控制下，是多泡體與漿細胞膜融合而不是直接脫落的結果，在包括惡性腫瘤在內的病理條件下不同的生物分子通過外泌體的分布，對惡性腫瘤的發生、進展和轉移具有調節作用。另有研究[54]結果表明，血漿外泌體 lncUEGC1 可能是主要的胃癌診斷的生物標志物，而且它可以有效區分早期胃癌和癌前病變，因此早期胃癌來源的外泌體 lncUEGC1 有望發展成為同時具有高敏感性、高穩定性、非侵入性等特點的胃癌早期診斷的生物標志物。綜上有關外泌體的研究，表明其可能有助于胃癌的早期診斷。
5 異常的微生物水平標志物
微生物因子中幽門螺桿菌是引起胃組織慢性炎癥、消化性潰瘍和胃癌的高致病性病原微生物因子，是胃癌發生的一個獨立危險因素[55]。目前普遍接受的觀點是“從正常的胃黏膜→慢性的胃黏膜炎癥→慢性的萎縮性胃炎→腸上皮化生不典型增生→胃癌”這一胃癌發生的多階段模式。細胞毒素相關基因（CagA）是第 1 個被發現的同幽門螺桿菌毒力密切相關的因子，是在胃癌進程中發揮積極作用的細菌蛋白[56]。有研究[57]表明，包含有特異性空泡毒素相關基因（VacA）等位基因類型的幽門螺桿菌感染與患胃癌的風險增加有關。雖然根除幽門螺桿菌感染可降低胃癌發生的風險，但它并不能阻止胃癌的發生和發展，而且也并不是所有感染幽門螺桿菌的患者最終都發展成為胃癌[58]。因為胃癌的發生不僅與幽門螺桿菌感染有關系，還與其他一些菌群感染或失調有關。Hu 等[59]的研究發現，在胃癌中微生物物種的豐度下降，尤其是具有降解致癌物質功能的矢野鞘氨醇菌類的菌群在胃癌中的水平顯著下降。以上研究結果提示，確診幽門螺桿菌感染可能意味著有一定罹患早期胃癌的風險，應在早期重視對幽門螺桿菌感染的及時處理。
6 小結與展望
近年來研究的逐步深入和新技術的不斷發展，為更好地理解胃癌的發病機理奠定了堅實有力的基礎，DNA 甲基化、CTCs、cfDNA、外泌體等展現出了較廣闊的臨床應用前景。盡管有了這些令人鼓舞的結果，但關于胃癌早期診斷方面的生物分子標志物領域依然有許多問題有待解決，如目前已經識別的生物分子標志物是否存在個體間表達水平的差異；同一個體的表達水平是否受病理狀態感染、缺氧、藥物治療影響等；最重要的是，目前大多數關于分子標志物的研究都僅僅涉及小樣本，在臨床應用前必須在較大樣本的前瞻性研究中進行進一步驗證，以確定其敏感性、特異性、預測價值等。總之，胃癌早期診斷的分子標志物的研究工作任重道遠，還需進一步探索更加具有臨床應用價值的標志物，以期實現對胃癌患者的早發現、早診斷、早治療并改善胃癌患者的預后。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：呂海冰負責選題、文獻檢索和初稿撰寫工作；戴志成協助部分文獻檢索；鄒小明指導選題、審閱文章并且提出具體修改意見。
胃癌是全球第四大常見惡性疾病且是人類惡性腫瘤相關死亡的第二大原因[1]。隨著人們生活水平的提高和醫療觀念的改變，近年來世界范圍內胃癌發病率呈下降趨勢。盡管目前有關胃癌的診斷和治療技術已經有了很大程度提高，但由于早期胃癌無特異性癥狀及體征，僅一小部分患者表現為腹痛、惡心、嘔吐等癥狀，臨床上發現的胃癌大部分為進展期胃癌，其預后較差，5 年生存率僅為 10% 左右，因此臨床醫生一直在尋求胃癌的早診、早治方法，以進一步提高胃癌患者的總生存率。內鏡篩查是目前早期診斷胃癌的主要方法，但因其檢查相關條件要求頗高、為侵入性且費用較高，而且部分患者檢查過程中會產生劇烈的惡心、嘔吐等反應，使其難以廣泛應用于胃癌的臨床篩查中，因此亟需尋找更簡便有效的胃癌早期診斷方法，進而提高胃癌患者的總生存率及改善患者預后。由于癌細胞與正常細胞在基因、轉錄、蛋白、細胞等方面都存在差異，通過監測與篩查基因、轉錄、蛋白和細胞水平的異常變化即可能及時發現與推測惡性腫瘤的發病情況，達到早期篩查的目的。腫瘤分子標志物是指在惡性腫瘤發生或發展進程中，由于腫瘤細胞的基因表達而合成分泌或由機體自身對腫瘤產生的反應而異常產生和（或）升高的各類物質[2]，分子標志物的鑒別對于腫瘤疾病的診斷、預后判斷、研發新的早期診斷工具等有重要的臨床意義，但目前由于受限于其敏感性、特異性等原因，分子標志物在腫瘤早期診斷中的應用進展相對緩慢，筆者現就近年來常見的胃癌早期診斷相關的分子標志物的研究進展作一綜述。
1 異常表達的 DNA 水平標志物
表觀遺傳系統的異常導致了多種惡性腫瘤的發生。許多研究已證實，異常的 DNA 甲基化和組蛋白修飾與進展性疾病包括惡性腫瘤有關[3]。惡性腫瘤中最廣泛的表觀遺傳學改變是異常的 DNA 甲基化[4]，其為 DNA 的化學修飾形式之一，可在不改變 DNA 原有序列的前提下改變相應的遺傳表現，屬于表觀遺傳學范疇[5]。人類 DNA 甲基化發生在鳥嘌呤之前的胞嘧啶殘基上，稱為 CpG 二核苷酸，基因啟動子區域異常的 DNA 甲基化導致抑癌基因等惡性腫瘤相關基因失活，是胃癌中最明確的表觀遺傳帶[3]。已有研究證實多種抑癌基因如 p16、RASSF10、RASSF1A、RPRM、RUNX3 等的啟動子甲基化與胃癌發生、發展等有著密不可分的關系。最早發現的細胞周期依賴的蛋白激酶抑制劑就是 p16 啟動子異常甲基化，p16 異常甲基化可導致相應的抑癌基因失去活性，進而促使胃癌的發生和發展，p16 的異常甲基化是胃癌發生過程中的一個早期分子事件，因此，它可以作為胃癌早期診斷的一種檢測指標[6]。Guo 等[7]對 106 例早期胃癌患者和 18 例健康者的外周血樣本進行甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）分析，結果發現，在早期胃癌患者的胃癌組織中 p16 基因的甲基化率為 72.6%，在健康者的正常胃黏膜組織中 p16 基因的甲基化率為 5.6%（1/18），此結果提示，p16 基因可作為早期胃癌診斷的潛在標志物。Peng 等[8]對 9 項關于中國胃癌患者胃癌組織中 p16 基因啟動子甲基化的研究進行 meta 分析，共涉及 487 例胃癌患者和 271 例健康對照者，發現胃癌患者的甲基化率為 28.3%～64.4%（中位甲基化率為 43.3%），健康對照者的甲基化率為 0.0%～13.3%（中位甲基化率為 0.0%），胃癌患者的甲基化率高于健康對照者（P<0.05），提示 DNA 甲基化是 p16 基因致癌的主要機制。Saliminejad 等[9]采用 MSP 方法檢測了 96 例經組織病理證實的胃腺癌患者和 88 例健康對照者外周血中 3 種抑癌基因（RASSF1A、RPRM、RUNX3）的甲基化狀態，結果發現，胃癌患者外周血中 RASSF1A、RPRM、RUNX3 的甲基化率均高于對照組（33.3% 比 0.0%、66.7% 比 6.8%、 58.3% 比 4.5%，均 P<0.001），結果提示，外周血中 RASSF1A、RPRM、RUNX3 的甲基化狀態可作為胃癌早期診斷的潛在分子標志物。Hu 等[10]使用 MSP 方法檢測了 100 例早期胃癌患者、50 例慢性胃炎患者及 45 例健康對照者的血清和腫瘤樣本中 RASSF10 啟動子的甲基化水平，結果顯示，胃癌患者中 RASSF10 啟動子的甲基化率（49/100）明顯高于慢性胃炎患者（1/50）和健康對照者（0/45），同時結果亦顯示，RASSF10 在血清和腫瘤組織間的甲基化狀態是一致的，提示檢測血清中 RASSF10 啟動子的甲基化狀態可早期診斷胃癌。總之，在 DNA 水平上啟動子的甲基化水平與胃癌的發生、發展有著密不可分的關系，基因啟動子甲基化水平的檢測可能成為胃癌早期診斷的一種潛在的理想分子標志物。
2 異常表達的 RNA 水平標志物
2.1 微小 RNA（microRNA，miRNA 或 miR）
miRNA 是指含 18～25 個核苷酸的非編碼 RNA 序列，由 DNA 轉錄而來，但不會被翻譯為蛋白質，通過與靶基因 mRNA 堿基配對降解 mRNA 或阻礙其翻譯，起到靶基因沉默作用，它廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中。miRNA 可以在人體血液中被檢測出來，其性質穩定，而且具有易于收集、分離、檢測等特點[11]。miRNA 可以通過外泌體顆粒從癌細胞釋放到體液中，這可以保護它們在循環中免受核糖核酸酶的降解。miRNA 在組織、血清或其他體液中的穩定性使其成為一種新型的惡性腫瘤生物標志物，具有不可估量的臨床潛力[12]。miRNA 種類繁多且作用也不盡完全相同，組織和血清中與胃癌早期診斷密切相關的表達上調的 miRNA 主要有 miR-196a、miR-196b、miR-19、miR-21、 miR-222，下調的 miRNA 主要有 miR-146、miR-375、Let-7[11]。Ranjbar 等[13]評估了血循環中 miR-196a 和 miR-196b 在胃癌患者中作為早期發現和預測轉移亦或兩者都有的新生物標志物的潛力，結果發現，與健康對照者相比，胃癌患者術前血循環中 miR-196a 和 miR-196b 水平明顯增高，循環中 miR-196a 或 miR-196b 水平或者二者組合對于區分早期胃癌患者和健康對照者較 CEA 或者 CA19-9 更有效，其敏感性及特異性更高；該研究還發現，在幽門螺桿菌感染的胃癌患者的血漿中 miR-146、miR-375、Let-7 的表達下調而 miR-19、miR-21 表達上調，與對照組相比，幽門螺桿菌感染的胃癌患者中與白細胞介素-1受體相關激酶 4 信號轉導通路相關的基因過表達，而 PTEN 基因卻表達下調。Emami 等[14]為了研究作為胃癌早期診斷潛在的生物標志物的血漿 miRNA 在胃癌樣本和對照組中的表達情況，采用實時定量聚合酶鏈反應評估了 30 例胃癌患者和 30 例健康對照者血漿中 miR-21 和 miR-222 的表達水平，同時通過受試者工作特征曲線來評估已選定的 miRNA 的診斷價值，結果顯示，miR-21、miR-222 在胃癌患者血漿中的表達水平明顯高于對照組（P<0.000 1、P=0.043），血漿 miR-21 的敏感性和特異性分別為 86.7% 和 72.2%，血漿 miR-222 的敏感性和特異性分別為 65.2% 和 56.2%，這些數據表明，miR-21 和 miR-222 可以作為一種潛在的胃癌早期診斷標志物。以上這些研究表明，這些循環 miRNAs 在對胃癌的早期診斷方面可能是比 CA19-9 更具有敏感性和特異性的新型生物標志物[15]。
2.2 長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）
基因組測序工程揭示，人類基因組由不到 2% 的蛋白質編碼基因組成并且 90% 以上的基因組被轉錄為非編碼 RNA[16]。lncRNAs 是一類新定義的轉錄本長度超過 200 nt 的非編碼 RNA 分子，在一系列生物學功能中均發揮著重要作用[17]。lncRNAs 可能在腫瘤的發生和發展中起作用[18]。目前的研究顯示，lncRNAs 廣泛存在于血清、血漿和其他體液中并且某些 lncRNAs 被認定為候選的生物標志物。最新的研究主要集中在 CUDR（19p13.12）、HOTAIR（12q13.13）、BLACAT1（1q32.1）、CCAT1（8q24.21）、GAPLINC（18)、H19 等 lncRNAs 上，其中 lncRNA-CUDR 能夠在血漿中被檢測到，可以將健康樣本和早期胃癌樣本區分開來，可作為胃癌早期診斷的一種標志物，有助于胃癌的早期檢測，并為進一步研究血漿 lncRNAs 在維持監測和預測預后方面的臨床價值奠定基礎[19]。H19 作為一種潛在的診斷胃癌的生物標志物，尤其是對于胃癌的早期篩查[20]，它能夠促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[21]。有研究[22]報道，與健康對照者相比，胃癌患者血漿中 H19 的水平明顯增高并可以用于鑒別早期胃癌，且腫瘤較小（<5 cm）患者的循環系統中 H19 水平高于腫瘤較大（>5 cm）者，提示 H19 對于胃癌的早期診斷可能具有潛在價值。以上研究結果提示，lncRNAs 有望成為胃癌早期診斷的標志物之一，對胃癌的早期診斷有積極意義。
2.3 環狀 RNA（circular RNAs，circRNAs）
circRNAs 是一種新的非編碼 RNAs，廣泛存在于人類的細胞和體液中，它形成一個不含有 5′ 末端和 3′ 末端的緊密閉環結構[23]。circRNAs 最早在 RNA 病毒中被發現，隨著高通量 RNA 測序、基因芯片分析等新分子技術的不斷發展，circRNAs 在所有的真核生物中被發現且為穩定、保守的序列，并通過與 miRNA 互相作用而控制基因表達[24]。circRNAs 異常表達于包括胃癌在內的多種人類疾病中，研究發現的具有生物功能和作用機制的胃癌相關 circRNAs 的數量不斷增加，其參與了胃癌的發生且與腫瘤細胞的增殖和凋亡密切相關[25]，提示 circRNAs 具有作為胃癌的新的生物標志物和治療靶點的巨大潛力[26]。另外，在惡性腫瘤中發現，circRNAs 不易被核糖核酸酶所降解，它們能夠在人類細胞、血漿及胃液中穩定表達[27]，這些發現為血漿中 circRNAs 譜的研究指引了新方向，其研究的目的在于為胃癌患者確定具有特異的診斷價值的 circRNAs。Necula 等[28]對 3 種胃癌樣本和血漿進行了 circRNAs 基因芯片檢測，以評估 circRNAs 表達譜的差異，結果發現，在患者血漿和腫瘤組織中同時都存在 3 種 circRNAs 上調和 14 種 circRNAs 下調；還通過 RT-droplet digital PCR 技術分析了 121 例胃癌患者血漿中的 circRNAs 水平，最終確定兩種 circRNAs 即 hsa-circ-0001017（30.85 倍變化）和 hsa-circ-0061276（121.54 倍變化）對胃癌具有早期診斷價值。Huang 等[29]研究證實，circRNA0026（hsa-circ-0000026）在胃癌組織中的表達顯著下調了 2.8 倍。以上研究結果提示，由于 circRNAs 在組織和血漿中的表達水平密切相關且可以穩定存在于血漿之中，因此，circRNAs 對于胃癌的早期篩查、早期診斷可能是一類有價值的生物標志物。
3 異常表達的蛋白質水平標志物
蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規律的科學，其本質是在大規模水平上研究蛋白質的特征，通過這種方式獲得在蛋白質水平上對于疾病發生、發展的整體而全面的認識，進而進一步揭示生命活動過程中的各種基因調控的機制。通過對正常個體及病理狀態下個體的蛋白質組進行對比，期望可以找到一些疾病所特有的蛋白質分子，這些分子有可能為疾病的早期診斷提供特異性分子標記。目前，蛋白質組學最常用的技術主要包括雙向凝膠電泳、質譜鑒定技術及生物信息學，并逐步向熒光差異凝膠電泳技術、同位素親和標記技術、細胞培養氨基酸穩定同位素標記技術、串聯質譜標簽法等[30]發展。通過利用蛋白質組學相關的分析技術識別出了數量相當可觀的有關早期胃癌的特異性蛋白。gastrokine 1（GKN1）是一種胃癌抑制因子，與胃癌的發生和發展有著密切的聯系[31]，它是胃組織管腔表面上皮細胞層顯著表達的一種小蛋白，參與黏膜完整性的維護并被分泌到胃內，但它在胃癌組織中表達缺失[32]。有研究[33]發現，GKN1 作為腫瘤抑制因子和凋亡信號調節因子，其低表達或缺失被認為是胃癌發生風險增高的一個因素，有助于胃癌的早期診斷。Gao 等[34]運用串聯質譜標簽法對非胃癌組織和胃癌組織進行了質膜蛋白表達水平的分析，首次發現了 flotillin 1 在胃癌和非胃癌中存在差異化表達，提出 flotillin 1 可能是潛在的一種胃癌診斷標志物，可能有利于胃癌的早期篩查和診斷。Shimura 等[35]為了發現可用于胃癌早期診斷的非侵入性生物標志物，利用來自早期胃癌患者和健康對照者的尿液樣本進行了病例對照研究，在 372 例患者尿液樣本中，年齡和性別匹配的 282 例患者被隨機分為發現隊列（n=18）、訓練隊列（n=176）及驗證隊列（n=38）3 組，在綜合定量蛋白質組學分析中發現，尿蛋白中 TFF1 和 ADAM12 水平是顯著獨立的胃癌診斷的生物標志物，可以很好地區分早期胃癌患者和健康對照者（男性的受試者操作特征曲線下面積為 0.850，女性為 0.845）。綜上，蛋白質水平生物標志物代表了一類有前途的非侵入性的胃癌早期診斷的生物標志物。
4 異常的細胞水平標志物
4.1 循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）
CTCs 是指由原發腫瘤組織脫離出來并可以進入外周血液循環系統的腫瘤細胞，它是腫瘤復發和轉移的重要因素之一，并且可增加惡性腫瘤患者的死亡風險。外周血液循環中 CTCs 檢測可用于腫瘤疾病的早期診斷、化療藥物的療效評估等。盡管 150 年前就有文獻記載過 CTCs[36]，但是直到最近幾年才證明在液體活檢中分析 CTCs 這種基于血液的診斷方式可作為組織活檢的一種替代，已成為實時監測惡性腫瘤發展的工具和管理策略[37]。大多數分泌進入外周血液循環的腫瘤細胞的預期壽命比較短，只有少數高活性的腫瘤細胞才擁有高的轉移潛能，在循環系統中存活下來且最終聚集成簇，從而形成腫瘤微血栓[38]。因而外周血系統中的 CTCs 是腫瘤發生的一種可能評估指標。Kang 等[39]對 116 例胃癌患者和 31 名健康志愿者進行了前瞻性研究，結果顯示，在 102 例被檢測出 CTCs 水平≥2 個 CTCs/7.5 mL 血液的人群中有 99 例（97.1%）患有胃癌，同時 CTCs 對于區分胃癌患者和健康對照者的敏感性和特異性分別為 85.3% 和 90.3%，提示 CTCs 檢測可以作為胃癌早期診斷的生物標志物。郭迎雪等[40]選擇了 80 例經病理結果證實為胃癌的患者作為研究組，并以 50 例慢性胃炎患者以及 50 名健康志愿者作為對照組，分別對各組外周血中的 CTCs 進行檢測，結果顯示，健康對照組（4.0%）和慢性胃炎組（10.0%）外周血的 CTCs 檢出率都明顯低于胃癌組（65.0%) ，提示 CTCs 或許可以成為診斷胃癌的一種新的生物標志物且可能有助于胃癌的早期診斷。由于有許多基因和表觀遺傳學的畸變可以激活癌基因、促進腫瘤進展，因此開發出了分子分析技術來檢測血漿中的 CTCs，以發現腫瘤特異性的畸變。此外，一些針對特定腫瘤相關抗原的自身抗體已經被確認，這些抗體由癌細胞表達且在診斷 5 年前就可以在血漿中檢測到[41]。因此，CTCs 及其表達的自身抗體有可能成為胃癌早期診斷的潛在標志物，對于早期發現胃癌具有重要臨床意義。
4.2 循環游離 DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）
cfDNA 是指來源于正常或癌細胞、游離于細胞之外且可以在血液中檢測到的 DNA[42]。來源于原發腫瘤組織、轉移灶或 CTCs 的這部分 cfDNA 稱之為 ctDNA。與傳統生物活檢的局限性相比，ctDNA 檢測具有取材方便、侵襲性更小、可重復性高等優點，而且有證據[43]表明 ctDNA 可以在惡性腫瘤患者早期階段的血漿中被檢測出來；此外，ctDNA 已被證明比 CTCs 具有更高的敏感性[44]。有一系統分析[45]研究結果顯示，ctDNA 檢測在胃癌診斷的特異性方面具有明顯優勢，而在敏感性方面未檢測到 ctDNA 優于傳統的蛋白生物標志物如 CEA、CA125、CA724 等。cfDNA 檢測顯示 EB 病毒 DNA 在診斷 EB 病毒相關的胃癌亞型、監測腫瘤進展等方面有重要作用[46]。Qian 等[47]采用 Alu-qPCR 方法研究了 124 例胃癌患者、64 例胃良性疾病患者和 92 例健康對照者血清中 cfDNA 的水平，結果顯示，胃癌患者 cfDNA 水平明顯高于胃良性疾病患者及健康對照者（P<0.05)，且發現胃癌患者血清的 cfDNA 水平與腫瘤 TNM 分期（Ⅲ、Ⅳ期）和腫瘤大小（>5 cm）相關，而與性別、年齡等無關。由于 cfDNA 水平檢測不需要任何關于腫瘤組織遺傳改變的先驗知識，因此該檢測在胃癌的早期診斷中具有重要意義，提示其具有作為胃癌早期診斷的生物標志物的潛力。
4.3 外泌體
外泌體是指由細胞分泌出來的直徑 30～100 nm 的一種囊泡小體，其內含有大量的物質包括核酸、蛋白質、酶等，然而它們由于能夠在細胞間傳遞從 RNA 到蛋白質等不同的分子信號而被眾所周知[48]。有關惡性腫瘤的研究[49]已經證明，外泌體能夠傳遞特定蛋白質和核酸給腫瘤微環境中的接受細胞或傳遞到特定的遠距離位置。外泌體的獨特表達模式和相對穩定的內容物使其成為腫瘤液體活檢的一種新候選物，其具有作為胃癌早期診斷的生物標志物的巨大潛力[50]。Fu 等[51]團隊的研究揭示了胃癌患者血清外泌體中 TRIM3 蛋白水平明顯低于健康對照者。Shi 等[52]最近研究發現，循環中外泌體來源的 miR-1246 在胃癌患者中的表達顯著上調，而且證明了血清中外泌體來源的 miR-1246 的升高是由腫瘤所引起的，這為胃癌的早期診斷提供了一個新的潛在的外泌體來源的生物標志物。有研究[53]表明，外泌體作為天然的納米載體不斷地脫離各種類型細胞，與其他細胞外囊泡家族相比，外泌體的生物形成是在嚴格的加載機制控制下，是多泡體與漿細胞膜融合而不是直接脫落的結果，在包括惡性腫瘤在內的病理條件下不同的生物分子通過外泌體的分布，對惡性腫瘤的發生、進展和轉移具有調節作用。另有研究[54]結果表明，血漿外泌體 lncUEGC1 可能是主要的胃癌診斷的生物標志物，而且它可以有效區分早期胃癌和癌前病變，因此早期胃癌來源的外泌體 lncUEGC1 有望發展成為同時具有高敏感性、高穩定性、非侵入性等特點的胃癌早期診斷的生物標志物。綜上有關外泌體的研究，表明其可能有助于胃癌的早期診斷。
5 異常的微生物水平標志物
微生物因子中幽門螺桿菌是引起胃組織慢性炎癥、消化性潰瘍和胃癌的高致病性病原微生物因子，是胃癌發生的一個獨立危險因素[55]。目前普遍接受的觀點是“從正常的胃黏膜→慢性的胃黏膜炎癥→慢性的萎縮性胃炎→腸上皮化生不典型增生→胃癌”這一胃癌發生的多階段模式。細胞毒素相關基因（CagA）是第 1 個被發現的同幽門螺桿菌毒力密切相關的因子，是在胃癌進程中發揮積極作用的細菌蛋白[56]。有研究[57]表明，包含有特異性空泡毒素相關基因（VacA）等位基因類型的幽門螺桿菌感染與患胃癌的風險增加有關。雖然根除幽門螺桿菌感染可降低胃癌發生的風險，但它并不能阻止胃癌的發生和發展，而且也并不是所有感染幽門螺桿菌的患者最終都發展成為胃癌[58]。因為胃癌的發生不僅與幽門螺桿菌感染有關系，還與其他一些菌群感染或失調有關。Hu 等[59]的研究發現，在胃癌中微生物物種的豐度下降，尤其是具有降解致癌物質功能的矢野鞘氨醇菌類的菌群在胃癌中的水平顯著下降。以上研究結果提示，確診幽門螺桿菌感染可能意味著有一定罹患早期胃癌的風險，應在早期重視對幽門螺桿菌感染的及時處理。
6 小結與展望
近年來研究的逐步深入和新技術的不斷發展，為更好地理解胃癌的發病機理奠定了堅實有力的基礎，DNA 甲基化、CTCs、cfDNA、外泌體等展現出了較廣闊的臨床應用前景。盡管有了這些令人鼓舞的結果，但關于胃癌早期診斷方面的生物分子標志物領域依然有許多問題有待解決，如目前已經識別的生物分子標志物是否存在個體間表達水平的差異；同一個體的表達水平是否受病理狀態感染、缺氧、藥物治療影響等；最重要的是，目前大多數關于分子標志物的研究都僅僅涉及小樣本，在臨床應用前必須在較大樣本的前瞻性研究中進行進一步驗證，以確定其敏感性、特異性、預測價值等。總之，胃癌早期診斷的分子標志物的研究工作任重道遠，還需進一步探索更加具有臨床應用價值的標志物，以期實現對胃癌患者的早發現、早診斷、早治療并改善胃癌患者的預后。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：呂海冰負責選題、文獻檢索和初稿撰寫工作；戴志成協助部分文獻檢索；鄒小明指導選題、審閱文章并且提出具體修改意見。