輻射聯合脂質體介導的胞嘧啶脫氨基酶/5-氟胞嘧啶系統體外抑殺人胰腺癌細胞的研究_《中國普外基礎與臨床雜志》

作者：

 孫勝 ^1,2 , 孫誠誼 ¹ , 潘耀振 ¹ , 鄧小強 ² , 李紅偉 ²

1. 貴州醫科大學第一附屬醫院肝膽外科（貴陽 550005）;
2. 漯河市中心醫院肝膽外科（河南漯河 462000）;

關鍵詞：

胰腺腫瘤輻射胞嘧啶脫氨基酶 5-氟胞嘧啶基因治療放射增敏

DOI：

10.7507/1007-9424.201912009

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的探討輻射聯合脂質體介導的胞嘧啶脫氨基酶（CD）/5-氟胞嘧啶（5-FC）系統對胰腺癌的協同治療作用。方法在脂質體介導下，將 CD 基因導入人胰腺癌 PC3 細胞，經 G418 篩選出穩定表達的克隆。用 RT-PCR 法鑒定 CD 基因的整合及表達；MTT 法檢測給入前藥 5-FC 后細胞的存活率及其旁觀者效應；細胞克隆形成實驗檢測鈷-60（⁶⁰Co）體外照射傳代培養后細胞的輻射敏感性。結果 CD 基因在轉染了 CD 基因細胞中獲得了穩定表達；5-FC 對轉染 CD 基因細胞具有較強的殺傷及旁觀者殺傷效應（P<0.05），聯合輻射能進一步增強這一殺傷效應（P<0.05）；5-FC 處理過的轉染了 CD 基因的 PC3 細胞對輻射的敏感性明顯提高（P<0.05），臨床相關劑量（2 Gy）照射時轉染 CD 基因細胞的放射增敏比達到 1.5。結論 CD/5-FC 系統對轉染了 CD 基因的細胞具有明顯的輻射增敏效應，聯合應用輻射和 CD/5-FC 系統能顯著增強 CD/5-FC 系統對 PC3 細胞的殺傷作用。

引用本文： 孫勝, 孫誠誼, 潘耀振, 鄧小強, 李紅偉. 輻射聯合脂質體介導的胞嘧啶脫氨基酶/5-氟胞嘧啶系統體外抑殺人胰腺癌細胞的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(9): 1078-1083. doi: 10.7507/1007-9424.201912009 復制

胰腺癌是腹部外科常見的惡性腫瘤，其發病隱匿，病情進展快，手術切除率僅為 15%～30%，病死率高，對傳統的手術、放化療及近年來新興的靶向治療等均不敏感，是臨床上的難題之一^[1-2]。而源于 20 世紀 90 年代興起的自殺基因體系對腫瘤的研究和近年來自殺基因體系聯合其他治療方法的臨床研究結果再次給胰腺癌這類療效欠佳腫瘤的治療提出了新的思考和希望^[3-8]。胞嘧啶脫氨基酶（cytosine deaminase，CD）/5-氟胞嘧啶（5-flurocytosine，5-FC）系統技術是通過把僅存在于細菌、真菌的 CD 基因導入腫瘤細胞，利用其表達產物將前體藥物 5-FC 轉化為具有輻射增敏效應的細胞毒性藥物 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），進而影響細胞增殖時 DNA、RNA 的合成，表現出較強的抑瘤效應及“旁觀者效應” ^[9-10]。為此，本研究應用 CD/5-FC 系統聯合輻射對人胰腺癌細胞進行實驗性自殺基因治療，同時觀察其輻射增敏效應和二者的協同抑瘤作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人胰腺癌細胞系 PC3 購自 ATCC 公司。脂質體 Lipofectin、G418 購自 Gibco 公司。MTT、5-FC 購自 Sigma 公司。含大腸桿菌 CD 基因的質粒 pcDNA3-CD、載體 pcDNA3 由中國醫科院曹慧青博士惠贈。質粒提取、純化試劑盒、反轉錄試劑盒購自 Promega 公司，總 RNA 提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司。

1.2 細胞培養

將人胰腺癌 PC3 細胞常規傳代培養于含 10% 胎牛血清（北京元亨圣馬生物技術研究所，56 ℃，1 h 滅活）的 RPMI 1640（Gibco 公司）培養液中，培養條件為 37 ℃、飽和濕度及 5% CO₂ 的孵箱。

1.3 質粒轉染

參照試劑盒說明書，用 Lipofectin 分別將空載體 pcDNA3 及 pcDNA3-CD 轉染人胰腺癌 PC3 細胞。轉染后的細胞經 G418（0.8 mg/mL）篩選。第 15 天時，挑取最佳單克隆于含 G418（0.2 mg/mL）的培養液中擴大培養，培養后的細胞分別命名為 PC3+pcDNA3 細胞（空載體 pcDNA3 轉染的 PC3 細胞）、PC3+pcDNA3-CD 細胞（含 EC-CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞）、PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 細胞（含 EC-CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞并經 2 Gy 鈷-60（⁶⁰Co）輻射。

1.4 采用 RT-PCR 方法對細胞進行鑒定

采用總 RNA 提取試劑盒分別提取未經轉染的 PC3、PC3+pcDNA3、PC3+pcDNA3-CD 和 PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 細胞的總 RNA，取適量總 RNA，以 Oligo（dt）為引物進行反轉錄，對反轉錄產物進行 PCR 反應。CD 基因上游引物為 5′-ACCGGATCCTTACAATGTCGAATAACGC-3′，下游引物為 5′-CGCGAATTCCCAGTCGTTCAACGTTTG3-3′，PCR 反應條件為 94 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，總循環數 32，擴增片段長度 1.3 kb。內對照 GAPDH 基因上游引物為 5′ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物為 5′ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，總循環數 28，擴增片段長度約 450 bp。結果經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用凝膠成像儀檢測進行定性分析。

1.5 細胞體外藥物敏感實驗

在該實驗中細胞被分為 5 組：① PC3 組：未轉染基因的 PC3 細胞；② PC3+pcDNA3 組：空載體 pcDNA3 轉染 PC3 細胞；③ PC3+2 Gy 組：未轉染基因的 PC3 細胞經 2 Gy ⁶⁰Co 照射（照射距離為 4 m，輻射率為 1.01×10^–3 C/（kg?s)，北京軍事醫學科學院鈷源室）；④ PC3+pcDNA3-CD 組：含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞；⑤ PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 組：含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞經 2 Gy ⁶⁰Co 照射（照射同 PC3+2 Gy 組）。然后將上述 5 組細胞按 2×10³個/孔分別接種于 96 孔板，培養 10～12 h 后加入 5-FC 至終濃度分別為 0、10、100、200、500、1 000 μmol/L，每個劑量設 4 個平行孔。培養 4 d 后采用 MTT 法測定各組光吸收度值即 A 值，以 PC3 組細胞為對照，培養液調零，計算細胞存活抑制率，其計算公式為：存活抑制率（%）=（1－實驗組 A 值）/（1－對照組 A 值）×100%。實驗獨立重復 3 次，計算平均值。

1.6 MTT 法檢測 CD/5-FC 系統的旁觀者效應

將 PC3+pcDNA3-CD 細胞和 PC3 細胞（未經轉染的 PC3 細胞）按 0∶10、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2、10∶0 的數目比制做單細胞混合懸液，按 1×10⁴ 個/孔細胞接種于 96 孔板，每個數目比設 6 個平行孔。培養 10～12 h 后每個數目比細胞中加入 5-FC 至終濃度為 500 μmol/L，繼續培養 4 d 后采用 MTT 法測 A 值，以 PC3 組細胞為對照，培養液調零，計算出混合細胞存活抑制率并定義為混合細胞存活抑制率實驗值。根據混合細胞存活抑制率實驗值和細胞數目比再次計算出 5-FC 在 500 μmol/L 藥物濃度下混合細胞的存活抑制率并定義為混合細胞存活抑制率預測值。混合細胞存活抑制率實驗值和預測值計算公式為：混合細胞存活抑制率實驗值（%）=（1–實驗組 A 值）/（1–對照組 A 值）×100%；混合細胞存活抑制率預測值=（混合細胞中轉染的 PC3 細胞的數目比×轉染的 PC3 細胞 10∶0 數目比時的混合細胞存活抑制率實驗值）+（未經轉染的 PC3 細胞數目比×未經轉染的 PC3 細胞 10∶0 數目比時的混合細胞存活抑制率實驗值）。

1.7 細胞照射和細胞存活克隆形成

在該實驗中，將指數生長期的未經轉染的 PC3 細胞和含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞按 1×10⁵ 個/孔分別接種于 6 孔板中并將其分為4 組：① PC3 組：未轉染基因的 PC3 細胞；② PC3+5-FC 組：未轉染基因的 PC3 細胞經含500 μmol/L 5-FC 濃度的細胞培養液培養；③ PC3/CD 組：含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞；④ PC3/CD+5-FC 組：含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞經含 500 μmol/L5-FC 濃度的細胞培養液培養。PC3 組和 PC3/CD 組細胞用常規細胞培養液培養，PC3+5-FC 組和 PC3/CD+5-FC 組細胞用含 500 μmol/L 5-FC 濃度的細胞培養液培養。培養 72 h 后收集各組細胞，然后分別給予 0、1、2、4、6、8 Gy 的 ⁶⁰Co 照射，對應于以上輻射劑量按細胞數依次為 500、1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 個/孔接種于 35 mm 平皿，每個劑量設 3 個平行皿；培養 12 d 后計數各組存活細胞克隆數（細胞數≥50 個的集落為 1 個存活細胞克隆），同時計算細胞克隆形成率、存活分數（SF）和放射增敏比（sensitizer enchancement ratio，SER），計算公式分別為：細胞克隆形成率（%）=照射后細胞形成的克隆數/種植細胞數×100%；SF=2 Gy ⁶⁰Co 照射后細胞克隆形成率/0 Gy ⁶⁰Co 照射時細胞克隆形成率；本研究中，結合臨床實際放療劑量，將 SER 定義為 2 Gy ⁶⁰Co 照射時 PC3 組細胞存活分數與 PC3/CD+5-FC 組細胞 SF 之比值，即 SER=PC3 組 SF /PC3/CD+5-FC 組 SF。實驗獨立重復 3 次，計算平均值。

1.8 統計學方法

應用 SPSS 18.0 軟件包對數據進行分析，對符合正態分布的數據以均數±標準差（±s）表示，多組計量資料進行單因素方差結果分析，兩兩組間比較，采用 LSD-t 檢驗方法。檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 細胞鑒定結果

PCR 產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，未轉染基因的 PC3 細胞及空載體 pcDNA3 轉染 PC3 細胞未能擴增出相應的目的基因—CD 基因片段；含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞和2 Gy ⁶⁰Co 照射后含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞均見到了預期大小的 CD（1.3 kb）基因相應的片段。該結果提示，目的質粒成功轉染入靶細胞即 CD 基因已穩定地整合入 PC3 細胞并獲得了一定的表達，見圖 1。

圖1 示 RT-PCR 方法檢測 PC3 細胞總 RNA 結果

1：未轉染基因的 PC3 細胞；2：空載體 pcDNA3 轉染 PC3 細胞；3：含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染、經 2 Gy ⁶⁰Co 照射的 PC3 細胞；4：含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞；5：DNA Marker DL2000

圖選項

下載全尺寸圖像

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2.2 細胞對藥物的敏感性結果

通過 MTT 法檢驗細胞的藥物敏感性，結果見表 1。5-FC 對實驗中 5 組的 PC3 細胞均表現出一定的藥物抑制敏感性，且隨著藥物濃度增加存活抑制率也不斷升高。其中 PC3 組細胞和 PC3+pcDNA3 組細胞對 5-FC 敏感性較低，即使在 5-FC 濃度達到 1 000 μmol/L 時，對細胞存活抑制率仍低于 10%。5-FC 對 PC3+pcDNA3-CD 組和 PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 組細胞的存活抑制率明顯高于 PC3 組（P<0.05），當 5-FC 濃度在 200 μmol/L 時的存活抑制率達 50% 左右，提示 5-FC 對 PC3+pcDNA3-CD 細胞的半抑制濃度（IC₅₀）約為 200 μmol/L，此濃度下 PC3+pcDNA3-CD 對 5-FC 的敏感性與 PC3、PC3+pcDNA3 組細胞相比均提高了 10 倍左右。在 0 μmol/L 濃度 5-FC 時即單純給予2 Gy ⁶⁰Co 照射后較未照射 PC3 組和 PC3+pcDNA3 組細胞的存活抑制率均大約提高了 5%（P<0.05），提示單純的臨床相關劑量 2 Gy ⁶⁰Co 照射對 PC3 細胞存在一定的抑殺效應，與輻射抑瘤原理相符合。

表1 不同濃度 5-FC 對各組細胞的存活抑制率（

，%）

表選項

下載CSV

組別	n	不同濃度 5-FC（μmol/L）
PC3 組	4	0	1.42±0.76	2.81±0.22	4.17±0.27	6.82±0.71	8.53±0.55
PC3+2 Gy 組	4	5.23±0.84^*△	6.71±0.88	7.52±0.36	8.31±0.31	11.63±0.60	13.22±0.84
PC3+pcDNA3 組	4	0	2.08±0.42	3.05±0.42	5.04±0.29	7.12±0.49	8.56±0.70
PC3+pcDNA3-CD 組	4	0	4.37±0.21^*	38.56±6.19^*	48.44±8.88^*	75.93±9.12^*	88.92±6.12^*
PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 組	4	5.42±0.61^*△	13.03±1.01^*	40.37±8.21^*	59.48±9.12^*	80.78±6.17^*	90.23±7.06^*
與 PC3 組比較，*P<0.01；與 PC3+pcDNA3 組比較，△P<0.05

2.3 CD/5-FC 系統對 PC3 細胞的旁觀者效應

500 μmol/L 濃度下前藥 5-FC 對不同比例混合細胞的存活抑制率實驗值和預測值見表 2。從表 2 可見，由 PC3+pcDNA3-CD 細胞和未經轉染 PC3 細胞按 2∶8、4∶6、6∶4、8∶2 混合細胞比例時的存活抑制率實驗值和存活抑制率預測值均明顯高于“0∶10”混合細胞即單一的未經轉染的 PC3 細胞（P<0.05），但與“10∶0”混合細胞即單一的含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的胰腺癌 PC3 細胞比較差異無統計學意義（P>0.05）；同時在 2∶8、4∶6、6∶4、8∶2 同一混合細胞比例條件下的存活抑制率實驗值明顯高于存活抑制率預測值（P<0.05），即混合細胞中穩定表達 CD 基因的 PC3 細胞的存在大大提高了 5-FC 對混合細胞中 PC3+pcDNA3-CD 細胞和 PC3 細胞的抑殺作用，提示 CD/5-FC 系統對 PC3 細胞旁觀者效應的客觀存在。

表2 500 μmol/L 5-FC 濃度對不同比例細胞的存活抑制率實驗值和預測值（

，%）

表選項

下載CSV

混合細胞	n	存活抑制率實驗值	存活抑制率預測值
0∶10	4	6.9±0.61	6.9±0.52
2∶8	4	37.8±0.82^*△	20.2±0.76^*
4∶6	4	55.6±2.14^*△	36.5±2.01^*
6∶4	4	69.4±6.10^*△	51.2±5.18^*
8∶2	4	75.9±7.26^*△	66.1±7.01^*
10∶0	4	80.8±9.12	80.8±9.06
與 0∶10 混合細胞比較，*P<0.05；與存活抑制率預測值比較，△P<0.05

2.4 細胞輻射敏感性分析結果

細胞照射和細胞存活克隆形成結果見表 3。各組內細胞在分別給予 1、2、4、6、8 Gy ⁶⁰Co 照射后的細胞克隆形成率和 SF 均較給予 0 Gy ⁶⁰Co 照射狀態的細胞克隆形成率和 SF 低（P<0.05），且隨照射劑量的增加呈現進行性下降趨勢（P<0.05）。PC3 組、PC3+5-FC 組、PC3/CD 組的 PC3 細胞在相對應各⁶⁰Co 照射劑量點的細胞克隆形成率和 SF 值較為接近（P>0.05）；而 PC3/CD+5-FC 組在 1、2、4、6、8 Gy ⁶⁰Co 照射點相對應的細胞克隆形成率和 SF 值均明顯低于 PC3 組、PC3+5-FC 組和 PC3/CD 組（P<0.05）。在 2 Gy ⁶⁰Co 照射下 PC3/CD 組和 PC3/CD+5-FC 組細胞的 SF 值分別是 0.296、0.201，二者比值即 SER 約為 1.5。

表3 各組細胞輻射敏感性分析結果（

，n=3）

表選項

下載CSV

組別	0^♂+500^♀		1^♂+1 000^♀		2^♂+2 000^♀		4^♂+4 000^♀		6^♂+6 000^♀		8^♂+8 000^♀
PC3 組	28.4±1.7	1		17.0±1.0^△	0.599^△		8.5±0.4^△	0.299^△		4.8±0.2^△	0.169^△		2.3±0.1^△	0.081^△	1.4±0.1^△	0.049^△
PC3+5-FC 組	28.2±2.0	1	16.9±0.9^△	0.599^△	8.5±0.4^△	0.301^△	3.8±0.2^△	0.135^△	2.3±0.2^△	0.082^△	1.4±0.1^△	0.050^△
PC3/CD 組	28.4±1.6	1	16.8±0.7^△	0.592^△	8.4±0.5^△	0.296^△	4.8±0.2^△	0.169^△	2.4±0.1^△	0.085^△	1.3±0.1^△	0.046^△
PC3/CD+5-FC 組	27.4±1.4	1	13.1±0.8^*△	0.476^*△	5.6±0.3^*△	0.201^*△	2.1±0.1^*△	0.076^*△	0.6±0.1^*△	0.021^*△	0.2±0.0^*△	0.007^*△
♂：指輻射劑量（Gy）；♀：指接種細胞數（個/皿）；#：SF的數據表示由于標準差的值較小，故直接用均數表示；與上面 3 組比較，*P<0.05；與同組內 0^♂+500^♀條件下的相應指標比較，△P<0.05

3 討論

自殺基因療法一直是腫瘤基因治療領域的研究熱點之一^[11-12]，對某些腫瘤的治療已進入臨床并取得預期療效^{[9-10, 13-14]}。CD/5-FC 自殺基因系統通過導入外源 CD 基因在腫瘤細胞中表達，將前藥 5-FC 轉換成臨床常用的化療藥物 5-FU 并在局部獲得較高的藥物濃度，從而對腫瘤細胞產生針對性靶向殺傷作用，同時也表現出極有利用價值的“旁殺傷效應”^[15-17]。本實驗觀察了 CD/5-FC 系統對人胰腺癌的治療作用，同樣證實了 5-FC 對表達 CD 基因的 PC3 細胞具有野生型 PC3 細胞無法比擬的殺傷力。另外，本研究發現 5-FC 對由未經轉染 PC3 細胞和含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞按不同比例組成的混合細胞的殺傷效應比對單純未經轉染的 PC3 及單純含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的胰腺癌 PC3 細胞的殺傷效應存在明顯優勢，進一步證實 CD/5-FC 系統對 PC3 細胞旁觀者效應的客觀存在，這在一定程度上避免了臨床常規應用化療藥物的全身毒副作用，而旁觀者效應的存在，使目前基因治療中載體對腫瘤細胞的低轉染效率的缺陷得以彌補。

輻射應用于腫瘤治療已有百年歷史，放射治療引起細胞死亡的主要靶分子是 DNA。在大量的自殺基因 CD/5-FC 系統治療結腸癌研究^[18-21]中發現，聯合輻射治療時具有明顯的協同作用，前藥 5-FC 轉換而成的 5-FU 相對集中于局部腫瘤細胞內，其對放射線的增敏作用較與之對照的 5-FU 與放療結合組具有相對集中、更強和低毒副作用的特點。CD/5-FC 系統通過轉換而來的 5-FU 本身即是一種公認的放療增敏劑，它通過耗盡細胞核多肽來抑制輻射后 DNA 損傷修復^[22-25]。本實驗結果證實，當給予經過 5-FC 處理且穩定表達 CD 基因的 PC3 細胞不同劑量的輻射后，發現細胞克隆形成率和細胞存活分數較野生型 PC3 細胞和單純給予輻射的穩定表達 CD 基因 PC3 細胞顯著減低，且與輻射劑量成一定依賴性；僅給予單次 2 Gy 照射后同樣表現出一定的協同抑瘤作用，這一結果進一步證實 CD/5-FC 自殺基因體系明顯增強了輻射對含 CD 基因質粒 pcDNA3-CD 轉染的 PC3 細胞的抑殺效應，即提高了穩定表達 CD 基因 PC3 細胞的輻射殺傷敏感性。電離輻射和 5-FU 會對正常組織產生一定的影響，但由于所采用的輻射劑量為臨床相關劑量 2 Gy，同時前藥 5-FC 轉換而成的 5-FU 相對集中于局部腫瘤細胞內，二者累積劑量均較低，對患者將不會產生明顯的毒副影響。

總之，輻射和自殺基因 CD/5-FC 治療系統的聯合可以促進目的基因的轉染和表達、協同提高治療效果，具有強效抑瘤作用，且多不伴有明顯的劑量依賴毒副效應^[26-27]。相信隨著研究的深入，在加上目前成熟的介入及靶向放療技術，聯合輻射和 CD/5-FC 系統有望為最大限度地抑制胰腺癌的生長和轉移提供一種新的可能。

重要聲明

利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。

作者貢獻聲明：孫勝提出研究思路、設計研究方案、負責設計和進行實驗并負責論文起草；孫誠誼提出研究方向、指導研究設計并監督、管理研究進行；潘耀振指導部分實驗設計、負責部分數據分析并協助稿件起草；鄧小強參與部分實驗操作并負責部分數據分析；李紅偉參與部分實驗設計并提供技術支持和資料收集。