引用本文： 林法彬, 邱福南. DNA 甲基化與膽管癌研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(7): 870-875. doi: 10.7507/1007-9424.201812063 復制
膽管癌是目前已知的最兇險的惡性腫瘤之一，現有的治療方案對膽管癌的療效有限，使得膽管癌患者的預后較差，隨著發病率在全球范圍內的增高，膽管癌受到越來越多的關注。膽管癌發病的最新分子機制研究進展[1]表明，膽管癌發生過程中除了遺傳變化之外，某些基因啟動子區域甲基化水平的改變也起到了重要的致癌作用。筆者現就 DNA 甲基化相關原理和與膽管癌相關的甲基化基因機制進行綜述、分析，對甲基化基因作為膽管癌治療的研究進展進行討論，并對其研究問題和未來方向予以展望。
1 膽管癌概述與危險因素
膽管癌是膽管不同位置上的上皮細胞的惡性腫瘤。從解剖學上它可以分為肝內膽管癌、肝門周圍膽管癌和遠端膽管癌 3 種亞型[2]。這些亞型不僅在解剖位置上有所不同，其流行病學、起源、病因、發病機理和治療方面也存在顯著不同。盡管全世界的膽管癌發病率和病因存在差異，但在過去的幾十年中，在全球范圍內其發病率在逐年增加。已確定的膽管癌危險因素包括：年齡增長、吸煙、原發性硬化性膽管炎、糖尿病[3]、膽總管囊腫等。近年，肝硬變、丙型和乙型病毒性肝炎也被認為是膽管癌的危險因素，在西方國家和亞洲國家之間，丙型肝炎和乙型肝炎對腫瘤生長的作用有所區別。在西方國家，丙型肝炎更具有流行性，但在亞洲國家乙型肝炎更具流行性。美國和歐洲的研究[4-5]表明，肝內膽管癌的危險因素與丙型肝炎具有相關性；韓國[6]和中國[7]的研究表明，乙型肝炎是造成肝內膽管癌的重要危險因素之一。在東南亞以及南亞地區，膽管癌的發病率相對較高，這與肝吸蟲、華支睪吸蟲有關[8-9]。膽管癌早期診斷困難，包括計算機斷層掃描（CT）和磁共振成像（MRI）在內的影像學方法，以及低特異性和缺乏絕對診斷標準的血清 CA19-9 的血清學檢測都不足以用于膽管癌的診斷[10]。目前來說，對于少數早期膽管癌患者，手術是唯一的治療選擇。因此迫切需要一種能夠快速、精準的診斷、檢測膽管癌的生物標志物。DNA 異常甲基化是腫瘤公認的表觀遺傳特征并且已經在大多類型腫瘤中被發現，是一種在哺乳動物基因組中發生最頻繁的表觀遺傳學事件，因此被更多人作為了潛在的生物標志物[11-13]。
2 DNA 甲基化
表觀遺傳學研究基因活性或功能的可遺傳變化，而這與 DNA 序列本身的任何變化無關。DNA 甲基化作為共價化學修飾是表觀遺傳機制的一種。DNA 甲基轉移酶（DNMTS）催化 S-腺苷甲硫氨酸，使其成為甲基的直接供體，將甲基轉移到 DNA 分子的堿基上。甲基與 DNA 中胞嘧啶上的第 5 碳原子共價結合，胞嘧啶由此成為 5-甲基胞嘧啶。異常 DNA 甲基化在腫瘤中的作用主要包括 DNA 低甲基化、DNA 高甲基化以及 5mC 突變。DNA 低甲基化能夠使癌基因轉錄激活[14]，而抑癌基因的失活突變大多是其啟動子高甲基化造成的。
CpG 二核苷酸是發生 DNA 甲基化的主要位點。在人類的基因體中，甲基化的 CpG 二核苷酸主要有兩種分布位置，其中一種位于 CpG 島區。在基因啟動子的轉錄調控區附近常成簇存在著富含 CpG 的 DNA 片段，約每 10 bp 就出現 1 個 CpG 位點，通常長度在 1～2 kb 左右，G 和 C 含量占核苷酸至少 50%，實測/預期的 CpG 比率>0.6，稱為 CpG 島[15]，其在進化中具有保守性。CpG 島在人類基因體中十分常見，50% 的基因都包含有 CpG 島。基因的啟動子一般含有 CpG 島，尤其是管家基因的啟動子區[15]，有時也位于基因 5’端的外顯子和內含子。DNA 上 CpG 島甲基化水平常在腫瘤細胞中發生改變，正常細胞的 CpG 島一般不發生甲基化，但在細胞發生癌變時，有些抑癌基因的啟動子甲基化，使得基因表達下調或沉默，細胞出現無限制生長。除了 CpG 島之外，位于島嶼周圍的較低 CpG 密度的區域，稱為“CpG 海岸”（距離 CpG 島最多 2 kb）和“CpG 架”（距離 CpG 島 2～4 kb），遠離 CpG 島的區域（距離 CpG 島最少 4 kb）被一些作者命名為“大海”。盡管CpG密度降低，但已證明這些區域對于基因表達調節具有功能上的重要性。
另外一種甲基化的 CpG 二核苷酸分布散亂，70%～90% 的 CpG 被甲基化修飾，當其甲基化狀態變化時，導致染色體穩定性降低、基因表達非正常，是發生腫瘤的重要誘因[16]。分布散亂的 CpG 二核苷酸存在于基因間區域以及基因體中。基因間區域存在大量甲基化沉默的轉座子和病毒元件。它們的復制或插入可導致基因破壞和 DNA 突變，因此絕大多數通過 DNA 甲基化或 5mC 脫氨突變失活。所以在基因間區域中，DNA 甲基化的主要作用之一便是抑制潛在危險遺傳元件的表達。在植物中基因體中的甲基化經常發生，但在哺乳動物細胞中，基因體甲基化與表達之間的關系尚未明確。在基因體中各個區域 DNA 甲基化的結果是不同的。Brenet 等[17]研究表明，高密度的外顯子甲基化的發生較過去所認知或預期統計的更加頻繁。與更下游的外顯子和內含子相比，第 1 外顯子甲基化發生相對較少，但第 1 外顯子的甲基化對轉錄沉默至關重要。
除 CpG 甲基化外，還有一種非 CpG 甲基化（mCH，其中 H=A，C，T）。Lister 等[18]研究證實了這種 DNA 修飾的存在，出現在多種人類細胞和組織中，包括不同的多能細胞、雌性生殖細胞、神經元和神經膠質。由于 mCH 發現不久，因此其具體作用仍不清楚，在此不詳述。
3 異常 DNA 甲基化作為膽管癌的生物標志物
發生膽管癌的分子途徑包括抑癌基因突變失活、致癌基因的過度激活以及異常 DNA 甲基化改變導致的重要分子途徑失調。通過在基因組和表觀基因組內積累遺傳變化，逐漸發展成膽管癌。可信的生物標志物能夠早期篩查膽管癌，提高早期診斷率，改善預后，預測治療反應復發風險。
Lee 等[19]在肝內膽管細胞癌中檢測的基因座甲基化頻率 14-3-3sigma 為 59.5%、APC 為 26.6%、E-cadherin 為 21.5%、p16 為 17.7%、MGMT 為 11.4%、THBS1 為 11.4%、p14 為 8.9%、TIMP 為 38.9%、DAP 激酶為 7.6%、GSTP1 為 6.3%、COX-2 為 5.1%、MINT12 為 50.6%、MINT1 為 40.5%、MINT25 為 15.4%、MINT32 為 35.4%以及 MINT31 為 1.3%。這些結果表明，異常 DNA 甲基化在膽管癌中的發生頻率非常高，并且與膽管癌的發生密切相關。
不同膽管癌亞型中的 DNA 甲基化水平存在異同。Yang 等[11]研究發現，大多數腫瘤抑制基因在肝內和肝外膽管癌之間具有相似的甲基化頻率，例如 APC、E-cadherin/CDH1、p15 INK4b、p16 INK4a 和 MGMT 的甲基化。但在肝外膽管癌中，RASSF1A 的甲基化（30/36）發生頻率高于肝內膽管癌（17/36，83% 比 47%，P=0.003）。在肝內膽管細胞癌中，GSTP 啟動子甲基化比在肝外膽管癌中更常見，并且這種差異具有統計學意義（31% 比 6%，P=0.012）。Borger 等[20]研究發現，在肝內膽管癌 IDH1 和 IDH2 的突變率很高（9/40，23%），但在肝外膽管癌中未發現（0/22）。Kipp 等[21] 對 94 例甲醛固定、石蠟包埋的膽管癌（67 例肝內、27 例肝外）進行測序，發現在肝內膽管癌中 IDH1/2 突變頻率高于肝外膽管癌（28% 比 7%，P=0.03）。IDH1 和 IDH2 蛋白酶活性的產物是 2-羥戊二酸，而突變的 IDH1 和 IDH2 蛋白使 α-酮戊二酸減少并積累 α-酮戊二酸拮抗劑 2-羥戊二酸，導致 DNA 甲基化[22]。不僅如此，血清中存在 2-羥戊二酸易于檢測，可作為生物標志物。部分基因甲基化已在前期文獻中報告[23-24]，因此以下例舉一些近年來與膽管癌有關的甲基化基因。
3.1 OPCML 和 SFRP1
阿片肽結合蛋白（OPCML）屬于細胞黏附分子中的一員，由 OPCML 基因所編碼，該蛋白質定位于質膜中并且可能在阿片受體功能中具有輔助作用。分泌型卷曲相關蛋白 1 （SFRP1）基因位于染色體 8p12-p11.1，編碼 SFRP1，可充當 Wnt 信號傳導的可溶性調節劑，抑制 Wnt 活性，導致細胞異常增殖[25]。Dicer 是 RNase Ⅲ 內切核糖核酸酶家族的成員之一，在調節哺乳動物癌細胞 CpG 島的甲基化中起到重要作用。Cheng 等[26]證明，Dicer 通過促進 SFRP1 啟動子的 DNA 甲基化，導致 SFRP1 表達下調，促進膽管癌細胞增殖和侵襲。Amornpisutt 等[27]通過應用甲基化敏感的高分辨率熔解（MS-HRM）等方法表明，OPCML 的敏感度、特異度和準確率分別為 89.04%、100% 和 90.36%，SFRP1 的敏感度、特異度和準確率分別為 83.56%、100% 和 85.54%，提示 OPCML 和 SFRP1 的 DNA 甲基化水平是診斷膽管癌的潛在生物標志物，具有高特異度、靈敏度和準確性。
3.2 人半胱氨酸雙加氧酶 1（CDO1）
CDO1 基因位于 5 號染色體長臂 23 區 2 亞帶（5q23.2）上，其編碼的蛋白是一種非血紅素結構的含鐵金屬酶，參與半胱氨酸向半胱氨酸亞磺酸鹽的轉化，在牛磺酸生物合成中起關鍵作用。目前，通過研究發現 CDO1 基因啟動子區 DNA 甲基化能夠導致多種腫瘤的發生[28]。因此，CDO1 啟動子區異常 DNA 甲基化是多種腫瘤中的診斷和（或）預后的生物標志物，例如結直腸癌、膽囊癌、胃癌等[29-31]。Nakamoto 等[32]在膽管癌患者中研究 CDO1 基因啟動子甲基化和預后的相關性，研究結果表明，CDO1 基因表現優異（AUC=0.93），甚至作為單一甲基化標志物的 COD1 基因與組合分析（AUC=0.94）表現相當，證明了 CDO1 基因的啟動子 DNA 甲基化是原發性肝外膽管細胞癌（EHCC）有效的分子診斷和預后生物標志物。
3.3 DLEC1
DLEC1 基因位于染色體上的 3p21.3-22，全長 59 kb，包含 37 個外顯子。DLEC1 蛋白主要存在于細胞質中，但細胞核中存在相對少量的 DLEC1 蛋白，其具有抑制細胞集落形成、誘導細胞 G1 期停滯、抑制細胞遷移等功能，以此抑制腫瘤發育生長。其與多種惡性腫瘤的發生有關，包括腎細胞癌，非小細胞肺癌和前列腺癌[33-34]，而目前該基因在膽管癌細胞中研究較少。Kim 等[35]通過對 10 例肝內膽管癌和正常囊性導管標本使用 MethyLight 檢測，篩選出 113 個啟動子 CpG 島位點，并從中選擇 30 個與腫瘤相關的高甲基化 CpG 島位點，用來分析 172 個肝內膽管癌的甲基化狀態。在小管型肝內膽管細胞癌患者（n=68）中發現 DLEC1 甲基化 26 例（38.2%），并與腫瘤相關生存率和無復發生存率的臨床結果相關，DLEC1 甲基化可作為小管型肝內膽管細胞癌患者的預后標志物。
3.4 GATA5
GATA5 基因位于 20q13.2-q13.3 上，其編碼的蛋白屬于鋅指轉錄因子（GATA1-6）家族，對共有 DNA 序列（A/T）GATA（A/G）具有高親和力。研究表明，GATA5 CpG 島甲基化和轉錄失活涉及結直腸癌、胃癌、肺癌和腎癌[36-38]。然而鮮有人研究膽管癌中的 GATA5 CpG 島甲基化。Liu 等[39]通過綜合分析 152 例膽管癌患者組織樣本，表明甲基化介導的 GATA5 基因沉默抑制膽管癌細胞增殖和轉移及 GATA5 通過失活 Wnt/β-連環蛋白信號傳導來抑制膽管癌增殖和轉移，從而在膽管癌細胞中起負面作用。GATA5 在膽管癌發展中的作用仍需進一步闡明。拋開其他表觀遺傳調控機制如組蛋白乙酰化，GATA5 結合位點的下游基因在癌細胞中通過高甲基化而表觀遺傳沉默以及 VHL/HIF 信號傳導的潛在相互作用也是未來研究的方向。
異常 DNA 甲基化作為生物標志物通常不是某種腫瘤的特性，因此難以找到膽管癌中特異 DNA 甲基化基因。然而甲基化標志物的組合分析能夠更好地診斷和治療膽管癌，彌補了獨立分析特異性不高的缺點。
4 DNA 甲基化在診斷和治療膽管癌中的作用
DNA 甲基化具有可逆性，一些位點可根據細胞活性發生去甲基化，因此通過使用甲基化抑制劑重新激活腫瘤抑制基因成為新型的腫瘤治療療法，Zebularine 便是一種甲基化抑制劑。Zebularine 是一種新型的 DNMT 抑制胞嘧啶核苷類似物。研究表明，相較于正常細胞，Zebularine 對癌細胞具有更高的選擇性[40]，但其臨床效益尚需進一步的評估。Zebularine 通過降低 DNMT1 水平和 DNA 去甲基化，誘導某些基因的激活，包括原鈣粘蛋白、轉錄調節因子和 Wnt 信號傳導相關基因，以此誘導膽管癌細胞的凋亡。Zebularine 可降低不同類型癌細胞中的 DNMT 亞型。Nakamura 等[41]研究表明，Zebularine 可降低 TFK-1 和 HuCCT1 細胞中 DNMT3A、DNMT3B 尤其是 DNMT1 的水平，導致 TFK-1 和 HuCCT1 細胞活力降低。
綜上所述，可知在各種類型的腫瘤中 Wnt 信號通路的激活與腫瘤發生和進展密切相關，Nakamura 等[41]證明 Zebularine 可誘導 Wnt 信號通路相關基因的 DNA 去甲基化，并降低膽管癌細胞中 β-連環蛋白的水平。其中“Wnt 信號通路”中的 31 個基因出現去甲基化，包括 Wnt 信號增強基因和阻遏基因。總之，腫瘤抑制基因去甲基化可能是治療膽管癌的高效生物標志物。利用 DNA 甲基化抑制劑進行的表觀遺傳治療通過腫瘤抑制基因的再激活，使得膽管癌的治療具有相當大的希望。
最新研究[42]表明，一氧化氮（NO）通過改變表觀遺傳酶來改變 DNA 甲基化和組蛋白修飾，能夠直接或間接的影響表觀遺傳機制。Spirlì等[43]證明了促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）通過誘導一氧化氮合酶 2（NOS2）刺激膽管上皮細胞產生 NO。持續性炎癥通過損傷 DNA 以及激活細胞因子和其他生長因子來促進腫瘤發生[44]。當肝損傷引起慢性炎癥和膽汁淤積時，促炎細胞因子如 TNF-α 和 IFN-γ 刺激膽管上皮細胞產生 NO，NO 則改變某些基因 DNA 的甲基化，導致膽管上皮細胞的加速生長，而膽管上皮細胞的加速增殖促進腫瘤抑制基因的異常 DNA 甲基化，最終導致膽管癌的發生。以上研究也能夠為膽管癌治療的新靶點提供新的思路。
診斷膽管惡性腫瘤的標準方法是通過具有侵入性操作的組織采樣，如內鏡逆行胰膽管造影術（ERCP）下使用刷狀細胞學檢測，但其靈敏度太低。因此，迫切需要用于膽管癌早期診斷的高特異度標志物。Prachayakul 等[45]通過定量甲基化特異性聚合酶鏈反應（QMSP）評估 HOXA1、RASSF1A、p16 和 NEUROG1 啟動子的 DNA 甲基化水平，證明了 HOXA1 和 NEUROG1 啟動子甲基化檢測可顯著提高常規細胞學診斷的靈敏度。膽管癌的診斷方法除常規細胞學分析評估外，目前還可通過共聚焦激光內窺顯微鏡檢查、單人操作膽管鏡靶向活組織檢查（single-operator cholangioscopy with targeted biopsies）以及熒光原位雜交（FISH）進行分析評估。
5 存在的問題及展望
目前，作為膽管癌的診斷標志物主要是 CA19-9、血小板衍生生長因子、癌胚抗原、CA-125 等分子標志物。但這些標志物缺乏針對膽管癌的敏感度和特異度。DNA 啟動子區異常甲基化用于此目的具有可行性。在組織特異性甲基化水平上，膽管癌中甲基化的 p16 和 RASSF1A 基因可以作為早期診斷的潛在分子標志物。然而在全基因組甲基化水平上，這些基因在其他多種上皮癌細胞中也表現出高甲基化，因此在測量血液、尿液、糞便等含有人全部 DNA 樣本的分析物時，p16 和 RASSF1A 基因可能會受到其他多種上皮癌細胞的干擾，使得這些基因對于膽管癌的特異性識別較低，因此，需要新的技術用于鑒定膽管癌特異性甲基化標志物，使其能夠進行評估全基因組的高甲基化啟動子區域。介于檢測全基因組甲基化難度，在膽管癌分子標志物的選擇上，Shin 等[46]開發了一種使用膽汁標本診斷膽管癌的有效方法。這種方法利用 MethyLight 測定法對膽汁中 DNA 樣本的 5 個基因（CCND2、CDH13、GRIN2B、RUNX3 和 TWIST1）進行 DNA 甲基化檢測，其靈敏度為 83%，特異度為 100%。使用這種微創檢查方法獲取膽汁標本，并檢測相關基因甲基化水平進行膽管癌的早期篩查和診斷，不僅排除了部分基因組的干擾，而且能最大程度減小了對患者的傷害。
總之，膽管癌因其細胞的復雜性和生長模式的多樣性，難以得到有效的診療。因此在膽管癌早期階段得到診斷，并實現腫瘤治愈性的治療仍是人類目前面臨的難題。而異常 DNA 甲基化的腫瘤抑制基因和重要分子途徑通路的相關基因可作為膽管癌診斷和治療的生物標志物且 DNA 甲基化抑制劑通過抑制腫瘤細胞有望達到治療的效果。
膽管癌是目前已知的最兇險的惡性腫瘤之一，現有的治療方案對膽管癌的療效有限，使得膽管癌患者的預后較差，隨著發病率在全球范圍內的增高，膽管癌受到越來越多的關注。膽管癌發病的最新分子機制研究進展[1]表明，膽管癌發生過程中除了遺傳變化之外，某些基因啟動子區域甲基化水平的改變也起到了重要的致癌作用。筆者現就 DNA 甲基化相關原理和與膽管癌相關的甲基化基因機制進行綜述、分析，對甲基化基因作為膽管癌治療的研究進展進行討論，并對其研究問題和未來方向予以展望。
1 膽管癌概述與危險因素
膽管癌是膽管不同位置上的上皮細胞的惡性腫瘤。從解剖學上它可以分為肝內膽管癌、肝門周圍膽管癌和遠端膽管癌 3 種亞型[2]。這些亞型不僅在解剖位置上有所不同，其流行病學、起源、病因、發病機理和治療方面也存在顯著不同。盡管全世界的膽管癌發病率和病因存在差異，但在過去的幾十年中，在全球范圍內其發病率在逐年增加。已確定的膽管癌危險因素包括：年齡增長、吸煙、原發性硬化性膽管炎、糖尿病[3]、膽總管囊腫等。近年，肝硬變、丙型和乙型病毒性肝炎也被認為是膽管癌的危險因素，在西方國家和亞洲國家之間，丙型肝炎和乙型肝炎對腫瘤生長的作用有所區別。在西方國家，丙型肝炎更具有流行性，但在亞洲國家乙型肝炎更具流行性。美國和歐洲的研究[4-5]表明，肝內膽管癌的危險因素與丙型肝炎具有相關性；韓國[6]和中國[7]的研究表明，乙型肝炎是造成肝內膽管癌的重要危險因素之一。在東南亞以及南亞地區，膽管癌的發病率相對較高，這與肝吸蟲、華支睪吸蟲有關[8-9]。膽管癌早期診斷困難，包括計算機斷層掃描（CT）和磁共振成像（MRI）在內的影像學方法，以及低特異性和缺乏絕對診斷標準的血清 CA19-9 的血清學檢測都不足以用于膽管癌的診斷[10]。目前來說，對于少數早期膽管癌患者，手術是唯一的治療選擇。因此迫切需要一種能夠快速、精準的診斷、檢測膽管癌的生物標志物。DNA 異常甲基化是腫瘤公認的表觀遺傳特征并且已經在大多類型腫瘤中被發現，是一種在哺乳動物基因組中發生最頻繁的表觀遺傳學事件，因此被更多人作為了潛在的生物標志物[11-13]。
2 DNA 甲基化
表觀遺傳學研究基因活性或功能的可遺傳變化，而這與 DNA 序列本身的任何變化無關。DNA 甲基化作為共價化學修飾是表觀遺傳機制的一種。DNA 甲基轉移酶（DNMTS）催化 S-腺苷甲硫氨酸，使其成為甲基的直接供體，將甲基轉移到 DNA 分子的堿基上。甲基與 DNA 中胞嘧啶上的第 5 碳原子共價結合，胞嘧啶由此成為 5-甲基胞嘧啶。異常 DNA 甲基化在腫瘤中的作用主要包括 DNA 低甲基化、DNA 高甲基化以及 5mC 突變。DNA 低甲基化能夠使癌基因轉錄激活[14]，而抑癌基因的失活突變大多是其啟動子高甲基化造成的。
CpG 二核苷酸是發生 DNA 甲基化的主要位點。在人類的基因體中，甲基化的 CpG 二核苷酸主要有兩種分布位置，其中一種位于 CpG 島區。在基因啟動子的轉錄調控區附近常成簇存在著富含 CpG 的 DNA 片段，約每 10 bp 就出現 1 個 CpG 位點，通常長度在 1～2 kb 左右，G 和 C 含量占核苷酸至少 50%，實測/預期的 CpG 比率>0.6，稱為 CpG 島[15]，其在進化中具有保守性。CpG 島在人類基因體中十分常見，50% 的基因都包含有 CpG 島。基因的啟動子一般含有 CpG 島，尤其是管家基因的啟動子區[15]，有時也位于基因 5’端的外顯子和內含子。DNA 上 CpG 島甲基化水平常在腫瘤細胞中發生改變，正常細胞的 CpG 島一般不發生甲基化，但在細胞發生癌變時，有些抑癌基因的啟動子甲基化，使得基因表達下調或沉默，細胞出現無限制生長。除了 CpG 島之外，位于島嶼周圍的較低 CpG 密度的區域，稱為“CpG 海岸”（距離 CpG 島最多 2 kb）和“CpG 架”（距離 CpG 島 2～4 kb），遠離 CpG 島的區域（距離 CpG 島最少 4 kb）被一些作者命名為“大海”。盡管CpG密度降低，但已證明這些區域對于基因表達調節具有功能上的重要性。
另外一種甲基化的 CpG 二核苷酸分布散亂，70%～90% 的 CpG 被甲基化修飾，當其甲基化狀態變化時，導致染色體穩定性降低、基因表達非正常，是發生腫瘤的重要誘因[16]。分布散亂的 CpG 二核苷酸存在于基因間區域以及基因體中。基因間區域存在大量甲基化沉默的轉座子和病毒元件。它們的復制或插入可導致基因破壞和 DNA 突變，因此絕大多數通過 DNA 甲基化或 5mC 脫氨突變失活。所以在基因間區域中，DNA 甲基化的主要作用之一便是抑制潛在危險遺傳元件的表達。在植物中基因體中的甲基化經常發生，但在哺乳動物細胞中，基因體甲基化與表達之間的關系尚未明確。在基因體中各個區域 DNA 甲基化的結果是不同的。Brenet 等[17]研究表明，高密度的外顯子甲基化的發生較過去所認知或預期統計的更加頻繁。與更下游的外顯子和內含子相比，第 1 外顯子甲基化發生相對較少，但第 1 外顯子的甲基化對轉錄沉默至關重要。
除 CpG 甲基化外，還有一種非 CpG 甲基化（mCH，其中 H=A，C，T）。Lister 等[18]研究證實了這種 DNA 修飾的存在，出現在多種人類細胞和組織中，包括不同的多能細胞、雌性生殖細胞、神經元和神經膠質。由于 mCH 發現不久，因此其具體作用仍不清楚，在此不詳述。
3 異常 DNA 甲基化作為膽管癌的生物標志物
發生膽管癌的分子途徑包括抑癌基因突變失活、致癌基因的過度激活以及異常 DNA 甲基化改變導致的重要分子途徑失調。通過在基因組和表觀基因組內積累遺傳變化，逐漸發展成膽管癌。可信的生物標志物能夠早期篩查膽管癌，提高早期診斷率，改善預后，預測治療反應復發風險。
Lee 等[19]在肝內膽管細胞癌中檢測的基因座甲基化頻率 14-3-3sigma 為 59.5%、APC 為 26.6%、E-cadherin 為 21.5%、p16 為 17.7%、MGMT 為 11.4%、THBS1 為 11.4%、p14 為 8.9%、TIMP 為 38.9%、DAP 激酶為 7.6%、GSTP1 為 6.3%、COX-2 為 5.1%、MINT12 為 50.6%、MINT1 為 40.5%、MINT25 為 15.4%、MINT32 為 35.4%以及 MINT31 為 1.3%。這些結果表明，異常 DNA 甲基化在膽管癌中的發生頻率非常高，并且與膽管癌的發生密切相關。
不同膽管癌亞型中的 DNA 甲基化水平存在異同。Yang 等[11]研究發現，大多數腫瘤抑制基因在肝內和肝外膽管癌之間具有相似的甲基化頻率，例如 APC、E-cadherin/CDH1、p15 INK4b、p16 INK4a 和 MGMT 的甲基化。但在肝外膽管癌中，RASSF1A 的甲基化（30/36）發生頻率高于肝內膽管癌（17/36，83% 比 47%，P=0.003）。在肝內膽管細胞癌中，GSTP 啟動子甲基化比在肝外膽管癌中更常見，并且這種差異具有統計學意義（31% 比 6%，P=0.012）。Borger 等[20]研究發現，在肝內膽管癌 IDH1 和 IDH2 的突變率很高（9/40，23%），但在肝外膽管癌中未發現（0/22）。Kipp 等[21] 對 94 例甲醛固定、石蠟包埋的膽管癌（67 例肝內、27 例肝外）進行測序，發現在肝內膽管癌中 IDH1/2 突變頻率高于肝外膽管癌（28% 比 7%，P=0.03）。IDH1 和 IDH2 蛋白酶活性的產物是 2-羥戊二酸，而突變的 IDH1 和 IDH2 蛋白使 α-酮戊二酸減少并積累 α-酮戊二酸拮抗劑 2-羥戊二酸，導致 DNA 甲基化[22]。不僅如此，血清中存在 2-羥戊二酸易于檢測，可作為生物標志物。部分基因甲基化已在前期文獻中報告[23-24]，因此以下例舉一些近年來與膽管癌有關的甲基化基因。
3.1 OPCML 和 SFRP1
阿片肽結合蛋白（OPCML）屬于細胞黏附分子中的一員，由 OPCML 基因所編碼，該蛋白質定位于質膜中并且可能在阿片受體功能中具有輔助作用。分泌型卷曲相關蛋白 1 （SFRP1）基因位于染色體 8p12-p11.1，編碼 SFRP1，可充當 Wnt 信號傳導的可溶性調節劑，抑制 Wnt 活性，導致細胞異常增殖[25]。Dicer 是 RNase Ⅲ 內切核糖核酸酶家族的成員之一，在調節哺乳動物癌細胞 CpG 島的甲基化中起到重要作用。Cheng 等[26]證明，Dicer 通過促進 SFRP1 啟動子的 DNA 甲基化，導致 SFRP1 表達下調，促進膽管癌細胞增殖和侵襲。Amornpisutt 等[27]通過應用甲基化敏感的高分辨率熔解（MS-HRM）等方法表明，OPCML 的敏感度、特異度和準確率分別為 89.04%、100% 和 90.36%，SFRP1 的敏感度、特異度和準確率分別為 83.56%、100% 和 85.54%，提示 OPCML 和 SFRP1 的 DNA 甲基化水平是診斷膽管癌的潛在生物標志物，具有高特異度、靈敏度和準確性。
3.2 人半胱氨酸雙加氧酶 1（CDO1）
CDO1 基因位于 5 號染色體長臂 23 區 2 亞帶（5q23.2）上，其編碼的蛋白是一種非血紅素結構的含鐵金屬酶，參與半胱氨酸向半胱氨酸亞磺酸鹽的轉化，在牛磺酸生物合成中起關鍵作用。目前，通過研究發現 CDO1 基因啟動子區 DNA 甲基化能夠導致多種腫瘤的發生[28]。因此，CDO1 啟動子區異常 DNA 甲基化是多種腫瘤中的診斷和（或）預后的生物標志物，例如結直腸癌、膽囊癌、胃癌等[29-31]。Nakamoto 等[32]在膽管癌患者中研究 CDO1 基因啟動子甲基化和預后的相關性，研究結果表明，CDO1 基因表現優異（AUC=0.93），甚至作為單一甲基化標志物的 COD1 基因與組合分析（AUC=0.94）表現相當，證明了 CDO1 基因的啟動子 DNA 甲基化是原發性肝外膽管細胞癌（EHCC）有效的分子診斷和預后生物標志物。
3.3 DLEC1
DLEC1 基因位于染色體上的 3p21.3-22，全長 59 kb，包含 37 個外顯子。DLEC1 蛋白主要存在于細胞質中，但細胞核中存在相對少量的 DLEC1 蛋白，其具有抑制細胞集落形成、誘導細胞 G1 期停滯、抑制細胞遷移等功能，以此抑制腫瘤發育生長。其與多種惡性腫瘤的發生有關，包括腎細胞癌，非小細胞肺癌和前列腺癌[33-34]，而目前該基因在膽管癌細胞中研究較少。Kim 等[35]通過對 10 例肝內膽管癌和正常囊性導管標本使用 MethyLight 檢測，篩選出 113 個啟動子 CpG 島位點，并從中選擇 30 個與腫瘤相關的高甲基化 CpG 島位點，用來分析 172 個肝內膽管癌的甲基化狀態。在小管型肝內膽管細胞癌患者（n=68）中發現 DLEC1 甲基化 26 例（38.2%），并與腫瘤相關生存率和無復發生存率的臨床結果相關，DLEC1 甲基化可作為小管型肝內膽管細胞癌患者的預后標志物。
3.4 GATA5
GATA5 基因位于 20q13.2-q13.3 上，其編碼的蛋白屬于鋅指轉錄因子（GATA1-6）家族，對共有 DNA 序列（A/T）GATA（A/G）具有高親和力。研究表明，GATA5 CpG 島甲基化和轉錄失活涉及結直腸癌、胃癌、肺癌和腎癌[36-38]。然而鮮有人研究膽管癌中的 GATA5 CpG 島甲基化。Liu 等[39]通過綜合分析 152 例膽管癌患者組織樣本，表明甲基化介導的 GATA5 基因沉默抑制膽管癌細胞增殖和轉移及 GATA5 通過失活 Wnt/β-連環蛋白信號傳導來抑制膽管癌增殖和轉移，從而在膽管癌細胞中起負面作用。GATA5 在膽管癌發展中的作用仍需進一步闡明。拋開其他表觀遺傳調控機制如組蛋白乙酰化，GATA5 結合位點的下游基因在癌細胞中通過高甲基化而表觀遺傳沉默以及 VHL/HIF 信號傳導的潛在相互作用也是未來研究的方向。
異常 DNA 甲基化作為生物標志物通常不是某種腫瘤的特性，因此難以找到膽管癌中特異 DNA 甲基化基因。然而甲基化標志物的組合分析能夠更好地診斷和治療膽管癌，彌補了獨立分析特異性不高的缺點。
4 DNA 甲基化在診斷和治療膽管癌中的作用
DNA 甲基化具有可逆性，一些位點可根據細胞活性發生去甲基化，因此通過使用甲基化抑制劑重新激活腫瘤抑制基因成為新型的腫瘤治療療法，Zebularine 便是一種甲基化抑制劑。Zebularine 是一種新型的 DNMT 抑制胞嘧啶核苷類似物。研究表明，相較于正常細胞，Zebularine 對癌細胞具有更高的選擇性[40]，但其臨床效益尚需進一步的評估。Zebularine 通過降低 DNMT1 水平和 DNA 去甲基化，誘導某些基因的激活，包括原鈣粘蛋白、轉錄調節因子和 Wnt 信號傳導相關基因，以此誘導膽管癌細胞的凋亡。Zebularine 可降低不同類型癌細胞中的 DNMT 亞型。Nakamura 等[41]研究表明，Zebularine 可降低 TFK-1 和 HuCCT1 細胞中 DNMT3A、DNMT3B 尤其是 DNMT1 的水平，導致 TFK-1 和 HuCCT1 細胞活力降低。
綜上所述，可知在各種類型的腫瘤中 Wnt 信號通路的激活與腫瘤發生和進展密切相關，Nakamura 等[41]證明 Zebularine 可誘導 Wnt 信號通路相關基因的 DNA 去甲基化，并降低膽管癌細胞中 β-連環蛋白的水平。其中“Wnt 信號通路”中的 31 個基因出現去甲基化，包括 Wnt 信號增強基因和阻遏基因。總之，腫瘤抑制基因去甲基化可能是治療膽管癌的高效生物標志物。利用 DNA 甲基化抑制劑進行的表觀遺傳治療通過腫瘤抑制基因的再激活，使得膽管癌的治療具有相當大的希望。
最新研究[42]表明，一氧化氮（NO）通過改變表觀遺傳酶來改變 DNA 甲基化和組蛋白修飾，能夠直接或間接的影響表觀遺傳機制。Spirlì等[43]證明了促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）通過誘導一氧化氮合酶 2（NOS2）刺激膽管上皮細胞產生 NO。持續性炎癥通過損傷 DNA 以及激活細胞因子和其他生長因子來促進腫瘤發生[44]。當肝損傷引起慢性炎癥和膽汁淤積時，促炎細胞因子如 TNF-α 和 IFN-γ 刺激膽管上皮細胞產生 NO，NO 則改變某些基因 DNA 的甲基化，導致膽管上皮細胞的加速生長，而膽管上皮細胞的加速增殖促進腫瘤抑制基因的異常 DNA 甲基化，最終導致膽管癌的發生。以上研究也能夠為膽管癌治療的新靶點提供新的思路。
診斷膽管惡性腫瘤的標準方法是通過具有侵入性操作的組織采樣，如內鏡逆行胰膽管造影術（ERCP）下使用刷狀細胞學檢測，但其靈敏度太低。因此，迫切需要用于膽管癌早期診斷的高特異度標志物。Prachayakul 等[45]通過定量甲基化特異性聚合酶鏈反應（QMSP）評估 HOXA1、RASSF1A、p16 和 NEUROG1 啟動子的 DNA 甲基化水平，證明了 HOXA1 和 NEUROG1 啟動子甲基化檢測可顯著提高常規細胞學診斷的靈敏度。膽管癌的診斷方法除常規細胞學分析評估外，目前還可通過共聚焦激光內窺顯微鏡檢查、單人操作膽管鏡靶向活組織檢查（single-operator cholangioscopy with targeted biopsies）以及熒光原位雜交（FISH）進行分析評估。
5 存在的問題及展望
目前，作為膽管癌的診斷標志物主要是 CA19-9、血小板衍生生長因子、癌胚抗原、CA-125 等分子標志物。但這些標志物缺乏針對膽管癌的敏感度和特異度。DNA 啟動子區異常甲基化用于此目的具有可行性。在組織特異性甲基化水平上，膽管癌中甲基化的 p16 和 RASSF1A 基因可以作為早期診斷的潛在分子標志物。然而在全基因組甲基化水平上，這些基因在其他多種上皮癌細胞中也表現出高甲基化，因此在測量血液、尿液、糞便等含有人全部 DNA 樣本的分析物時，p16 和 RASSF1A 基因可能會受到其他多種上皮癌細胞的干擾，使得這些基因對于膽管癌的特異性識別較低，因此，需要新的技術用于鑒定膽管癌特異性甲基化標志物，使其能夠進行評估全基因組的高甲基化啟動子區域。介于檢測全基因組甲基化難度，在膽管癌分子標志物的選擇上，Shin 等[46]開發了一種使用膽汁標本診斷膽管癌的有效方法。這種方法利用 MethyLight 測定法對膽汁中 DNA 樣本的 5 個基因（CCND2、CDH13、GRIN2B、RUNX3 和 TWIST1）進行 DNA 甲基化檢測，其靈敏度為 83%，特異度為 100%。使用這種微創檢查方法獲取膽汁標本，并檢測相關基因甲基化水平進行膽管癌的早期篩查和診斷，不僅排除了部分基因組的干擾，而且能最大程度減小了對患者的傷害。
總之，膽管癌因其細胞的復雜性和生長模式的多樣性，難以得到有效的診療。因此在膽管癌早期階段得到診斷，并實現腫瘤治愈性的治療仍是人類目前面臨的難題。而異常 DNA 甲基化的腫瘤抑制基因和重要分子途徑通路的相關基因可作為膽管癌診斷和治療的生物標志物且 DNA 甲基化抑制劑通過抑制腫瘤細胞有望達到治療的效果。