引用本文： 王方華, 吳怡林, 龔建平. KRAS 突變與胰腺癌的發生及治療的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(6): 764-768. doi: 10.7507/1007-9424.201811069 復制
胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤，發病率位居惡性腫瘤前列，同時也是目前惡性程度極高的腫瘤之一。我國癌癥中心（National Central Cancer Registry，NCCR）2017 年發布的數據顯示：胰腺癌的發生率位居第 10 位，癌癥相關死亡率位于第6 位[1]。有學者[2]對歐洲 100 000 例胰腺癌患者的回顧性研究發現：患者診斷時的預期壽命為 4.6 個月，胰腺癌導致 98% 的健康生命損失。然而面對這樣的“癌癥之王”，目前的腫瘤治療效果卻不盡人意，近 30 年來，胰腺癌患者的 5 年生存率一直低于 5%[3]。隨著二代測序的發展，關于胰腺癌的基因組研究發現：在胰腺導管腺癌中存在著 KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、RNF43、ARID1A、TGFβR2、GNAS、RREB1 和 PRM1 突變，KRAS 野生型腫瘤的其他致癌因子也有改變，包括 GNAS、BRAF、CTNB1 和附加的 RAS 通路基因[4]。KRAS 的突變在其中尤為突出。那么，KARS 的突變在胰腺癌的發生發展中究竟是如何發揮作用的？能否有效地轉化為臨床腫瘤分子靶向治療位點，改善胰腺癌的腫瘤治療效果呢？筆者現對 KRAS 的結構功能、KRAS 突變類型及其與胰腺癌的關系、KRAS 下游信號通路以及目前針對胰腺癌 KRAS 突變的治療進行簡要綜述。
1 KRAS 的結構功能概述
KRAS 基因是 RAS 基因家族中的一員，位于人類的第 12 號染色體上，含有 4 個編碼外顯子和1 個 5′ 端非編碼外顯子。其編碼的蛋白質稱為 KRAS 蛋白（包括 K-Ras4A 和 K-Ras4B），由 189 個氨基酸構成，與其他家族成員即 HRAS 和 NRAS 編碼的蛋白質相比，其前 165 位氨基酸序列相同，分子量為 12×103，因此也被稱為 P12 蛋白。KRAS 作為 RAS 家族的一員，在調控細胞的生長、增殖、分化、凋亡等生命活動中發揮著重要作用[5]。KRAS 蛋白是一類小 G 蛋白，與 GDP 的結合狀態是非活性的，然而在鳥苷酸交換因子被募集到 KRAS 后，GDP 釋放、瞬時無核苷酸狀態形成，KRAS 蛋白隨后與 GTP 結合，導致 RAS 的 2 個特定區域 Switch 1（30～40 位氨基酸）和 Switch 2（60～76 位氨基酸）發生顯著的構象改變，從而進行信號整合并將信號傳遞至下游效應器，最后由于 KRAS 內在的酶活性以及 GTP 酶激活蛋白（CTPase-activating proteins，GAPs）的作用，水解 GTPs，終止信號傳遞，如此 KRAS 成為細胞內重要的分子開關[6]。
2 KRAS 突變類型及其與胰腺癌的關系
胰腺癌基因組學證明：胰腺癌患者中最常見的突變類型是 KRAS 突變，KRAS 基因突變在胰腺癌的發生發展中發揮著重大的作用，其突變率高達 90%[7]，而其中最常見的突變密碼子是 12 突變[8]。有研究者[9]從胰腺腫瘤和血漿樣品中提取 DNA，用基因芯片的數字 PCR 方法檢測出 G12D、G12V 和 G12C 突變，其中有 44% 的腫瘤 G12D 陽性，20% 的腫瘤 G12V 陽性，10% 的腫瘤 G12C 陽性。可見在胰腺癌 KRAS 的突變中，G12D 的突變是最常見的。KRAS 的突變往往發生在腫瘤突變的早期[10]，且具有 KRAS 突變的胰腺癌患者的總存活率顯著降低[11]。
雖然在胰腺癌患者中 KRAS 突變十分常見，但是胰腺癌和 KRAS 突變的關系卻有不同的解釋。最為普遍的觀點是，突變的 KRAS 基因使 KRAS 蛋白失去了分子開關的作用，特別是當 KRAS 蛋白與 GAPs 蛋白結合點發生改變時，GTP 水解障礙，KRAS 蛋白則一直處于活化狀態，影響信號轉導途徑，多個細胞過程如轉化、增殖、侵襲和存活被激活[12]。有學者[13]通過建立一個 KRAS 突變的基因工程小鼠后證明，小鼠出現胰腺上皮內瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasias，PanIN）并最終發展成為胰腺導管腺癌。但即使 KRAS 蛋白與 GTP 結合并激活了下游信號通路，也不一定能使胰腺細胞發生癌變，因為正常人的胰腺組織內仍能找到突變狀態的 KRAS[14]。可見 KRAS 基因突變并不是胰腺腫瘤發生的一個獨立致癌因素，需要與多種因素共同作用，KRAS 突變與胰腺癌的關系十分復雜。
3 KRAS 下游信號通路
通過對 KRAS 下游信號通路的研究，能更加深刻地了解 KRAS 與胰腺癌之間的關系。KRAS 存在多種下游調控，它們通過協同作用促進胰腺癌的發生和發展。現今研究較多的明確的下游信號通路是 Raf（rapidly accelerated fibrosarcoma）-絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）-細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）和 RalGDS-Ral 信號通路。
3.1 Raf-MEK-ERK 信號通路
Ras-Raf-MEK-ERK 信號轉導級聯可能是人類癌癥中最重要的致癌途徑。該信號通路主要調節細胞生長分化、細胞轉移、新陳代謝、神經系統功能以及免疫應答。Raf 家族成員（A-Raf、B-Raf 和 C-Raf）從細胞質溶膠被招募到質膜，在質膜上它們選擇性地直接與活性的 GTP-Ras 結合，與 Ras 結合后誘導 Raf 構象改變，促進 Raf 同源二聚體或異源二聚體的形成，其中常涉及 B-Raf/C-Raf 異源二聚體的變構并介導激酶活化，活化的 Raf 磷酸化 MEK1 和 MEK2 的絲氨酸/蘇氨酸殘基。MEK1 和 MEK2 被稱為雙特異性蛋白激酶，能夠進一步催化 ERK，包括 ERK1 和 ERK2 的磷酸化和活化，而后者催化數十個胞質和核蛋白的磷酸化[15-17]。
使用藥物抑制劑 U0126 能抑制 RAS 激活的 Raf/ERK/MAP 激酶。MEK 抑制導致胰腺癌腫瘤細胞增殖停止，同時伴有 G0～G1 細胞周期阻滯[18]。KRAS 蛋白的激活促進了胰腺腫瘤細胞的侵襲能力，然而這種侵襲能力能夠被 PI3K 抑制劑減弱。有學者[19]建立了一個胰腺癌 Ras 激活的細胞模型，并進行細胞劃傷愈合實驗，結果發現，使用了 PI3K 抑制劑的細胞模型，其活動性下降了 45%～70%。而通過在小鼠胰腺中表達條件突變致癌基因 BrafV600E，選擇性激活 Raf-MEK-ERK 信號通路可誘導 PanIN 和胰腺癌發育，表明 Ras-Raf-MEK-ERK 信號轉導級聯是胰腺癌發生、維持及治療的關鍵[20]。
3.2 PI3K-AKT 信號通路
PI3K-AKT 信號通路被認為在細胞增殖、遷移、侵襲以及在化療耐藥性中起重要作用，該通路受到不同因素的影響，形成了極其復雜的傳導通路[21]。該通路可受 Ras 的激活而發揮效應，被激活的 PI3K 能激活二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2），后者轉化而生成三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），為細胞內含有 PH 結構域的信號蛋白 AKT-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶 1（phospho-inositide dependent kinase 1，PDK1）等在質膜上提供了停泊位點，使 PDK1 磷酸化 AKT 的 Thr308；同時，PDK2 磷酸化 AKT 的 Ser473，從而完全激活 AKT，活化的 AKT 通過磷酸化激活多種下游的酶、轉錄因子等[22]。
大約有 50% 的胰腺癌表現出活化的 PI3K 信號通路，與 AKT 磷酸化有關，通常與未分化的腫瘤狀態和預后不良有關[23]。此外，使用原發性胰腺轉移瘤細胞、人 PDAC 早期傳代細胞和正常胰腺細胞，都驗證了 PI3K 通路在人體胰腺癌中被激活。有數據[24]表明，PI3K-AKT 信號在腫瘤演化的早期被激活，并能控制胰腺細胞的可塑性和致癌作用。有學者[25]通過免疫組化檢查發現，AKT 在胰腺癌組織標本中過表達；同時通過體外實驗發現，抑制 PI3K-AKT 通路可降低細胞增殖速度并誘導胰腺癌細胞凋亡。相應地，建立不同的小鼠模型，使小鼠胰腺特異性表達致癌基因 p110aH1047R ，可使 PI3K-AKT 途徑被選擇性激活，能夠誘導 PanIN 和胰腺癌形成，證實 PI3K/PDK1 參與了 KRAS 突變下的胰腺癌的發生[24]。
3.3 RalGDS-Ral 信號通路
RalGDS 是 RAS 家族的小 GTP 酶 Ral 的 GTP/GDP 交換因子（guanine nucleotide exchange factor，RalGEFs），從而調節依賴于 Ral（RAS-like）的細胞內事件，如胞吐作用、內吞作用、重組調節細胞膜轉運和細胞骨架重塑。RalGDS 從細胞質轉運到質膜，這是 Ral 活化所必需的。多種細胞外信號分子包括表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）能激活 RAS 的 GEF，然后 GDP-Ras 在質膜上轉化為 GTP-Ras。RAS 分子發生的結構改變加強了 RAS 與其下游效應分子結合的能力[26]。Ral 與 KRAS、HRAS 及 NRAS 這 3 個 RAS 基因具有高度的序列相似性，故命名為 Ral。Ral 蛋白介導多種細胞活動，包括絲狀偽足形成/膜皺、糖酵解、自噬、分泌、極性維持及細胞凋亡轉錄。這些活動的改變可以導致腫瘤侵襲轉移、細胞能量水平改變和對細胞死亡的抵抗[27]。Ral 由 RalA 和 RalB 2 種亞型組成，具有較高的序列同源性，在這 2 種亞型氨基酸序列中，有約 85% 的氨基酸序列是相同的。盡管 RalA 和 RalB 含有重要的氨基酸序列同源性，它們也有一些不同的細胞功能。RalA 對腫瘤的生長是重要的，然而 RalB 對腫瘤的轉移和侵襲具有重要作用[28]。
RalGDS 的致癌活性是通過底物 RalA 的激活而傳播的，但是能被另一個密切相關的基底物 RalB 減弱，而 RalA 在胰腺癌細胞系中處于激活狀態[29]。有研究者[29]使用免疫印跡測定 14 個胰腺癌細胞系中總 RalA 的水平，數據顯示，所有這些細胞中均存在不同程度的 RalA 蛋白；最令人驚訝的是，在這些癌細胞系中，RalA 與其他主要 RAS 效應通路相比更容易被激活；ERK 在 11 類細胞系中被磷酸化，但只有三分之一細胞系的 ERK 磷酸化水平較高，同樣 AKT 在所有細胞系中被弱激活，但僅在3 個細胞系中檢測到高水平的磷酸化 AKT[29]。
4 胰腺癌 KRAS 突變相關的治療
胰腺癌是一種高度致命的疾病，其主要治療方法是外科手術。然而，只有 15%～20% 的患者在疾病診斷時是手術的候選者；另一方面，接受手術的患者的存活率低于 30%[30]。幸而化療方案的最新進展不僅提高了我們治療轉移性疾病的能力，而且在新輔助治療環境中也顯示出了良好的結果。目前認為，FOLFIRINOX ［氟尿嘧啶、亞葉酸（亮葉酸）、伊立替康和奧沙利鉑］ 和吉西他濱+納米粒白蛋白結合紫杉醇（nab-紫杉醇）是治療無法手術但具有良好表現狀態的患者的首選方法[31]。影像技術的進步以及對胰腺癌發病機制的更好理解，使得早期診斷和早期積極處理潛在的癌前病變成為可能，但是我們仍舊需要進一步了解導致腫瘤發生的遺傳和分子因素，以及開發更有針對性和毒性更小的全身療法[32]。
4.1 作用于 Kras 靶向治療胰腺癌
RNA 干擾（RNAi）原則上可以應用于可逆沉默任何靶基因，RNAi 為小分子和基于抗體的治療提供了新的治療方向。但 RNAi 治療必須結合有效的小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）載體與可靠的體內遞送以有效靶向抑制，而由于胰腺的解剖位置因素，很難通過電穿孔和生物聚合物將 RNAi 傳遞至腫瘤組織[33]。因此直接以 KRAS 作為靶向進行胰腺癌治療一直處于發展的瓶頸階段。但是隨著外泌體（iExosomes）的研究進展，有學者[34]發現，在多個胰腺癌小鼠模型中外泌體能抑制癌癥，并顯著提高了整體存活率；從正常成纖維細胞樣間充質細胞中衍生的外泌體，經工程化攜帶短干擾 RNA 或短發夾，可靶向治療胰腺癌中的 KRAS 突變。
突變 KRAS 蛋白與正常蛋白相似，具有非常相似的 GDP/GTP 結合結構域，但缺乏用于結合小分子抑制劑的深口袋，使得特定的治療十分困難[35]。鑒于 RAS 致癌活性與質膜結合密切相關，人們初步嘗試開發 RAS 抑制劑。通過抑制與質膜內表面關聯功能上起關鍵作用的法尼基轉移酶（FTase），而達到靶向 KRAS 抑制的作用。然而，實驗[6]證明，其對 HRAS 有效，但 KRAS 和 NRAS 的膜定位不受 FTase 抑制劑的影響。
4.2 作用于 Kras 下游通路靶向治療胰腺癌
直接作用于 KRAS 存在著諸多問題，人們便把目光轉向單獨或者聯合作用于 KRAS 下游通路。
Raf 作為 KRAS 的直接下游信號通路，是分子靶向的首選位點。美國食品和藥物管理局（FDA）批準的第 2 代 Raf 抑制劑威羅非尼（vemurafenib）和達拉非尼（dabrafenib）對 BrafV600E黑色素瘤患者有顯著療效，并能提高患者的生存率。除了黑色素瘤，目前的 Raf 抑制劑在結直腸和甲狀腺 BrafV600E腫瘤的臨床治療中也顯示出中等療效[36]。然而這 2 種選擇性 Braf 抑制劑在 KRAS 突變瘤中是禁忌使用的，因為它們可以通過 Braf-Craf 二聚反應引起反常的下游信號激活[37]。但 Y3009120 是 Raf 二聚體抑制劑，能抑制所有 Raf 異構體，并能有效抑制 Braf-Craf 異源二聚體的激酶活性，是治療 KRAS 突變體腫瘤的更好的替代物[38]。此外，有學者[39]研究發現，結合 Yes 相關蛋白（yes-associated protein，YAP）抑制劑 Vistopern 可以顯著增強 LY3009120 的抗腫瘤作用。
在 KRAS 突變腫瘤中單獨的 Raf 抑制劑表現出很低的功效。因此有研究[40]通過篩選聯合用藥，發現 MEK 和 PI3K 抑制劑與 Raf 抑制劑具有協同作用，在 KRAS 突變體和野生型腫瘤中，Raf/MEK 抑制劑組合顯示出了協同作用。
司美替尼（AZD-6244，Selumetinib）是一種有效的選擇性 MEK 抑制劑，在多種腫瘤模型中均有效。有研究[41]比較了司美替尼和卡培他濱治療晚期或轉移性胰腺癌患者的療效，發現司美替尼的耐受性良好，安全性良好。同時有學者[42]發現，PDMP（D, L-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol）是一種糖鞘磷脂生物合成抑制劑，能顯著提高胰腺癌細胞對司美替尼的敏感性。這涉及持續的神經酰胺產生以及 ERK 和 AKT-雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號的同時阻斷。司美替尼能誘導胰腺癌細胞產生神經酰胺，但過量的神經酰胺在較長時間后（24～48 h）被代謝清除，PDMP 能促進司美替尼誘導的神經酰胺生成，至 48 h 時神經酰胺水平仍保持在較高水平[42]。
胰腺癌進展和化療不敏感與 PI3K/mTOR/MEK 信號異常有關。有學者[43]的實驗證明，與單獨使用 PI3K/mTOR 雙重抑制劑 PF5212384（PF384）和 MEK 抑制劑 PD325901（PD901）2 種藥物相比，聯合使用能更有效地誘導胰腺腫瘤細胞的凋亡，而與 KRAS 突變狀態無關，這表明 PF384/PD901 聯合治療在野生型或 KRAS 突變型胰腺腫瘤細胞中激活了相同的凋亡機制。同時，索拉非尼聯合白樺酸可抑制胰腺腫瘤細胞的存活和增殖，而不誘導細胞凋亡。該增殖抑制也可能與抑制 PI3k/AKT 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路有關，即低濃度索拉非尼和白樺酸聯合治療能夠抑制胰腺腫瘤細胞的增殖[44]。
5 小結與展望
無數研究者力求降低胰腺癌的病死率，但是無論胰腺癌手術術式如何進展，胰腺癌一直維持以較高的病死率，術后 5 年生存率約 20%[45]。隨著對 KRAS 下游通路研究的深入以及胰腺癌特異性靶向治療的開展，逐漸看到了提高胰腺癌生存率的曙光。
在胰腺癌的診斷和治療中，應該推進胰腺癌的早期發現，盡可能地運用外科手術切除腫瘤組織。積極推進更多的分子靶向藥物由基礎實驗階段轉化為藥物臨床試驗階段，同時考慮藥物的安全性和靶向性，促進靶向藥物的精準化、個體化以及規范化，解決在分子靶向治療中出現的耐藥現象。
胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤，發病率位居惡性腫瘤前列，同時也是目前惡性程度極高的腫瘤之一。我國癌癥中心（National Central Cancer Registry，NCCR）2017 年發布的數據顯示：胰腺癌的發生率位居第 10 位，癌癥相關死亡率位于第6 位[1]。有學者[2]對歐洲 100 000 例胰腺癌患者的回顧性研究發現：患者診斷時的預期壽命為 4.6 個月，胰腺癌導致 98% 的健康生命損失。然而面對這樣的“癌癥之王”，目前的腫瘤治療效果卻不盡人意，近 30 年來，胰腺癌患者的 5 年生存率一直低于 5%[3]。隨著二代測序的發展，關于胰腺癌的基因組研究發現：在胰腺導管腺癌中存在著 KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、RNF43、ARID1A、TGFβR2、GNAS、RREB1 和 PRM1 突變，KRAS 野生型腫瘤的其他致癌因子也有改變，包括 GNAS、BRAF、CTNB1 和附加的 RAS 通路基因[4]。KRAS 的突變在其中尤為突出。那么，KARS 的突變在胰腺癌的發生發展中究竟是如何發揮作用的？能否有效地轉化為臨床腫瘤分子靶向治療位點，改善胰腺癌的腫瘤治療效果呢？筆者現對 KRAS 的結構功能、KRAS 突變類型及其與胰腺癌的關系、KRAS 下游信號通路以及目前針對胰腺癌 KRAS 突變的治療進行簡要綜述。
1 KRAS 的結構功能概述
KRAS 基因是 RAS 基因家族中的一員，位于人類的第 12 號染色體上，含有 4 個編碼外顯子和1 個 5′ 端非編碼外顯子。其編碼的蛋白質稱為 KRAS 蛋白（包括 K-Ras4A 和 K-Ras4B），由 189 個氨基酸構成，與其他家族成員即 HRAS 和 NRAS 編碼的蛋白質相比，其前 165 位氨基酸序列相同，分子量為 12×103，因此也被稱為 P12 蛋白。KRAS 作為 RAS 家族的一員，在調控細胞的生長、增殖、分化、凋亡等生命活動中發揮著重要作用[5]。KRAS 蛋白是一類小 G 蛋白，與 GDP 的結合狀態是非活性的，然而在鳥苷酸交換因子被募集到 KRAS 后，GDP 釋放、瞬時無核苷酸狀態形成，KRAS 蛋白隨后與 GTP 結合，導致 RAS 的 2 個特定區域 Switch 1（30～40 位氨基酸）和 Switch 2（60～76 位氨基酸）發生顯著的構象改變，從而進行信號整合并將信號傳遞至下游效應器，最后由于 KRAS 內在的酶活性以及 GTP 酶激活蛋白（CTPase-activating proteins，GAPs）的作用，水解 GTPs，終止信號傳遞，如此 KRAS 成為細胞內重要的分子開關[6]。
2 KRAS 突變類型及其與胰腺癌的關系
胰腺癌基因組學證明：胰腺癌患者中最常見的突變類型是 KRAS 突變，KRAS 基因突變在胰腺癌的發生發展中發揮著重大的作用，其突變率高達 90%[7]，而其中最常見的突變密碼子是 12 突變[8]。有研究者[9]從胰腺腫瘤和血漿樣品中提取 DNA，用基因芯片的數字 PCR 方法檢測出 G12D、G12V 和 G12C 突變，其中有 44% 的腫瘤 G12D 陽性，20% 的腫瘤 G12V 陽性，10% 的腫瘤 G12C 陽性。可見在胰腺癌 KRAS 的突變中，G12D 的突變是最常見的。KRAS 的突變往往發生在腫瘤突變的早期[10]，且具有 KRAS 突變的胰腺癌患者的總存活率顯著降低[11]。
雖然在胰腺癌患者中 KRAS 突變十分常見，但是胰腺癌和 KRAS 突變的關系卻有不同的解釋。最為普遍的觀點是，突變的 KRAS 基因使 KRAS 蛋白失去了分子開關的作用，特別是當 KRAS 蛋白與 GAPs 蛋白結合點發生改變時，GTP 水解障礙，KRAS 蛋白則一直處于活化狀態，影響信號轉導途徑，多個細胞過程如轉化、增殖、侵襲和存活被激活[12]。有學者[13]通過建立一個 KRAS 突變的基因工程小鼠后證明，小鼠出現胰腺上皮內瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasias，PanIN）并最終發展成為胰腺導管腺癌。但即使 KRAS 蛋白與 GTP 結合并激活了下游信號通路，也不一定能使胰腺細胞發生癌變，因為正常人的胰腺組織內仍能找到突變狀態的 KRAS[14]。可見 KRAS 基因突變并不是胰腺腫瘤發生的一個獨立致癌因素，需要與多種因素共同作用，KRAS 突變與胰腺癌的關系十分復雜。
3 KRAS 下游信號通路
通過對 KRAS 下游信號通路的研究，能更加深刻地了解 KRAS 與胰腺癌之間的關系。KRAS 存在多種下游調控，它們通過協同作用促進胰腺癌的發生和發展。現今研究較多的明確的下游信號通路是 Raf（rapidly accelerated fibrosarcoma）-絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）-細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）和 RalGDS-Ral 信號通路。
3.1 Raf-MEK-ERK 信號通路
Ras-Raf-MEK-ERK 信號轉導級聯可能是人類癌癥中最重要的致癌途徑。該信號通路主要調節細胞生長分化、細胞轉移、新陳代謝、神經系統功能以及免疫應答。Raf 家族成員（A-Raf、B-Raf 和 C-Raf）從細胞質溶膠被招募到質膜，在質膜上它們選擇性地直接與活性的 GTP-Ras 結合，與 Ras 結合后誘導 Raf 構象改變，促進 Raf 同源二聚體或異源二聚體的形成，其中常涉及 B-Raf/C-Raf 異源二聚體的變構并介導激酶活化，活化的 Raf 磷酸化 MEK1 和 MEK2 的絲氨酸/蘇氨酸殘基。MEK1 和 MEK2 被稱為雙特異性蛋白激酶，能夠進一步催化 ERK，包括 ERK1 和 ERK2 的磷酸化和活化，而后者催化數十個胞質和核蛋白的磷酸化[15-17]。
使用藥物抑制劑 U0126 能抑制 RAS 激活的 Raf/ERK/MAP 激酶。MEK 抑制導致胰腺癌腫瘤細胞增殖停止，同時伴有 G0～G1 細胞周期阻滯[18]。KRAS 蛋白的激活促進了胰腺腫瘤細胞的侵襲能力，然而這種侵襲能力能夠被 PI3K 抑制劑減弱。有學者[19]建立了一個胰腺癌 Ras 激活的細胞模型，并進行細胞劃傷愈合實驗，結果發現，使用了 PI3K 抑制劑的細胞模型，其活動性下降了 45%～70%。而通過在小鼠胰腺中表達條件突變致癌基因 BrafV600E，選擇性激活 Raf-MEK-ERK 信號通路可誘導 PanIN 和胰腺癌發育，表明 Ras-Raf-MEK-ERK 信號轉導級聯是胰腺癌發生、維持及治療的關鍵[20]。
3.2 PI3K-AKT 信號通路
PI3K-AKT 信號通路被認為在細胞增殖、遷移、侵襲以及在化療耐藥性中起重要作用，該通路受到不同因素的影響，形成了極其復雜的傳導通路[21]。該通路可受 Ras 的激活而發揮效應，被激活的 PI3K 能激活二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2），后者轉化而生成三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），為細胞內含有 PH 結構域的信號蛋白 AKT-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶 1（phospho-inositide dependent kinase 1，PDK1）等在質膜上提供了停泊位點，使 PDK1 磷酸化 AKT 的 Thr308；同時，PDK2 磷酸化 AKT 的 Ser473，從而完全激活 AKT，活化的 AKT 通過磷酸化激活多種下游的酶、轉錄因子等[22]。
大約有 50% 的胰腺癌表現出活化的 PI3K 信號通路，與 AKT 磷酸化有關，通常與未分化的腫瘤狀態和預后不良有關[23]。此外，使用原發性胰腺轉移瘤細胞、人 PDAC 早期傳代細胞和正常胰腺細胞，都驗證了 PI3K 通路在人體胰腺癌中被激活。有數據[24]表明，PI3K-AKT 信號在腫瘤演化的早期被激活，并能控制胰腺細胞的可塑性和致癌作用。有學者[25]通過免疫組化檢查發現，AKT 在胰腺癌組織標本中過表達；同時通過體外實驗發現，抑制 PI3K-AKT 通路可降低細胞增殖速度并誘導胰腺癌細胞凋亡。相應地，建立不同的小鼠模型，使小鼠胰腺特異性表達致癌基因 p110aH1047R ，可使 PI3K-AKT 途徑被選擇性激活，能夠誘導 PanIN 和胰腺癌形成，證實 PI3K/PDK1 參與了 KRAS 突變下的胰腺癌的發生[24]。
3.3 RalGDS-Ral 信號通路
RalGDS 是 RAS 家族的小 GTP 酶 Ral 的 GTP/GDP 交換因子（guanine nucleotide exchange factor，RalGEFs），從而調節依賴于 Ral（RAS-like）的細胞內事件，如胞吐作用、內吞作用、重組調節細胞膜轉運和細胞骨架重塑。RalGDS 從細胞質轉運到質膜，這是 Ral 活化所必需的。多種細胞外信號分子包括表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）能激活 RAS 的 GEF，然后 GDP-Ras 在質膜上轉化為 GTP-Ras。RAS 分子發生的結構改變加強了 RAS 與其下游效應分子結合的能力[26]。Ral 與 KRAS、HRAS 及 NRAS 這 3 個 RAS 基因具有高度的序列相似性，故命名為 Ral。Ral 蛋白介導多種細胞活動，包括絲狀偽足形成/膜皺、糖酵解、自噬、分泌、極性維持及細胞凋亡轉錄。這些活動的改變可以導致腫瘤侵襲轉移、細胞能量水平改變和對細胞死亡的抵抗[27]。Ral 由 RalA 和 RalB 2 種亞型組成，具有較高的序列同源性，在這 2 種亞型氨基酸序列中，有約 85% 的氨基酸序列是相同的。盡管 RalA 和 RalB 含有重要的氨基酸序列同源性，它們也有一些不同的細胞功能。RalA 對腫瘤的生長是重要的，然而 RalB 對腫瘤的轉移和侵襲具有重要作用[28]。
RalGDS 的致癌活性是通過底物 RalA 的激活而傳播的，但是能被另一個密切相關的基底物 RalB 減弱，而 RalA 在胰腺癌細胞系中處于激活狀態[29]。有研究者[29]使用免疫印跡測定 14 個胰腺癌細胞系中總 RalA 的水平，數據顯示，所有這些細胞中均存在不同程度的 RalA 蛋白；最令人驚訝的是，在這些癌細胞系中，RalA 與其他主要 RAS 效應通路相比更容易被激活；ERK 在 11 類細胞系中被磷酸化，但只有三分之一細胞系的 ERK 磷酸化水平較高，同樣 AKT 在所有細胞系中被弱激活，但僅在3 個細胞系中檢測到高水平的磷酸化 AKT[29]。
4 胰腺癌 KRAS 突變相關的治療
胰腺癌是一種高度致命的疾病，其主要治療方法是外科手術。然而，只有 15%～20% 的患者在疾病診斷時是手術的候選者；另一方面，接受手術的患者的存活率低于 30%[30]。幸而化療方案的最新進展不僅提高了我們治療轉移性疾病的能力，而且在新輔助治療環境中也顯示出了良好的結果。目前認為，FOLFIRINOX ［氟尿嘧啶、亞葉酸（亮葉酸）、伊立替康和奧沙利鉑］ 和吉西他濱+納米粒白蛋白結合紫杉醇（nab-紫杉醇）是治療無法手術但具有良好表現狀態的患者的首選方法[31]。影像技術的進步以及對胰腺癌發病機制的更好理解，使得早期診斷和早期積極處理潛在的癌前病變成為可能，但是我們仍舊需要進一步了解導致腫瘤發生的遺傳和分子因素，以及開發更有針對性和毒性更小的全身療法[32]。
4.1 作用于 Kras 靶向治療胰腺癌
RNA 干擾（RNAi）原則上可以應用于可逆沉默任何靶基因，RNAi 為小分子和基于抗體的治療提供了新的治療方向。但 RNAi 治療必須結合有效的小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）載體與可靠的體內遞送以有效靶向抑制，而由于胰腺的解剖位置因素，很難通過電穿孔和生物聚合物將 RNAi 傳遞至腫瘤組織[33]。因此直接以 KRAS 作為靶向進行胰腺癌治療一直處于發展的瓶頸階段。但是隨著外泌體（iExosomes）的研究進展，有學者[34]發現，在多個胰腺癌小鼠模型中外泌體能抑制癌癥，并顯著提高了整體存活率；從正常成纖維細胞樣間充質細胞中衍生的外泌體，經工程化攜帶短干擾 RNA 或短發夾，可靶向治療胰腺癌中的 KRAS 突變。
突變 KRAS 蛋白與正常蛋白相似，具有非常相似的 GDP/GTP 結合結構域，但缺乏用于結合小分子抑制劑的深口袋，使得特定的治療十分困難[35]。鑒于 RAS 致癌活性與質膜結合密切相關，人們初步嘗試開發 RAS 抑制劑。通過抑制與質膜內表面關聯功能上起關鍵作用的法尼基轉移酶（FTase），而達到靶向 KRAS 抑制的作用。然而，實驗[6]證明，其對 HRAS 有效，但 KRAS 和 NRAS 的膜定位不受 FTase 抑制劑的影響。
4.2 作用于 Kras 下游通路靶向治療胰腺癌
直接作用于 KRAS 存在著諸多問題，人們便把目光轉向單獨或者聯合作用于 KRAS 下游通路。
Raf 作為 KRAS 的直接下游信號通路，是分子靶向的首選位點。美國食品和藥物管理局（FDA）批準的第 2 代 Raf 抑制劑威羅非尼（vemurafenib）和達拉非尼（dabrafenib）對 BrafV600E黑色素瘤患者有顯著療效，并能提高患者的生存率。除了黑色素瘤，目前的 Raf 抑制劑在結直腸和甲狀腺 BrafV600E腫瘤的臨床治療中也顯示出中等療效[36]。然而這 2 種選擇性 Braf 抑制劑在 KRAS 突變瘤中是禁忌使用的，因為它們可以通過 Braf-Craf 二聚反應引起反常的下游信號激活[37]。但 Y3009120 是 Raf 二聚體抑制劑，能抑制所有 Raf 異構體，并能有效抑制 Braf-Craf 異源二聚體的激酶活性，是治療 KRAS 突變體腫瘤的更好的替代物[38]。此外，有學者[39]研究發現，結合 Yes 相關蛋白（yes-associated protein，YAP）抑制劑 Vistopern 可以顯著增強 LY3009120 的抗腫瘤作用。
在 KRAS 突變腫瘤中單獨的 Raf 抑制劑表現出很低的功效。因此有研究[40]通過篩選聯合用藥，發現 MEK 和 PI3K 抑制劑與 Raf 抑制劑具有協同作用，在 KRAS 突變體和野生型腫瘤中，Raf/MEK 抑制劑組合顯示出了協同作用。
司美替尼（AZD-6244，Selumetinib）是一種有效的選擇性 MEK 抑制劑，在多種腫瘤模型中均有效。有研究[41]比較了司美替尼和卡培他濱治療晚期或轉移性胰腺癌患者的療效，發現司美替尼的耐受性良好，安全性良好。同時有學者[42]發現，PDMP（D, L-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol）是一種糖鞘磷脂生物合成抑制劑，能顯著提高胰腺癌細胞對司美替尼的敏感性。這涉及持續的神經酰胺產生以及 ERK 和 AKT-雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號的同時阻斷。司美替尼能誘導胰腺癌細胞產生神經酰胺，但過量的神經酰胺在較長時間后（24～48 h）被代謝清除，PDMP 能促進司美替尼誘導的神經酰胺生成，至 48 h 時神經酰胺水平仍保持在較高水平[42]。
胰腺癌進展和化療不敏感與 PI3K/mTOR/MEK 信號異常有關。有學者[43]的實驗證明，與單獨使用 PI3K/mTOR 雙重抑制劑 PF5212384（PF384）和 MEK 抑制劑 PD325901（PD901）2 種藥物相比，聯合使用能更有效地誘導胰腺腫瘤細胞的凋亡，而與 KRAS 突變狀態無關，這表明 PF384/PD901 聯合治療在野生型或 KRAS 突變型胰腺腫瘤細胞中激活了相同的凋亡機制。同時，索拉非尼聯合白樺酸可抑制胰腺腫瘤細胞的存活和增殖，而不誘導細胞凋亡。該增殖抑制也可能與抑制 PI3k/AKT 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路有關，即低濃度索拉非尼和白樺酸聯合治療能夠抑制胰腺腫瘤細胞的增殖[44]。
5 小結與展望
無數研究者力求降低胰腺癌的病死率，但是無論胰腺癌手術術式如何進展，胰腺癌一直維持以較高的病死率，術后 5 年生存率約 20%[45]。隨著對 KRAS 下游通路研究的深入以及胰腺癌特異性靶向治療的開展，逐漸看到了提高胰腺癌生存率的曙光。
在胰腺癌的診斷和治療中，應該推進胰腺癌的早期發現，盡可能地運用外科手術切除腫瘤組織。積極推進更多的分子靶向藥物由基礎實驗階段轉化為藥物臨床試驗階段，同時考慮藥物的安全性和靶向性，促進靶向藥物的精準化、個體化以及規范化，解決在分子靶向治療中出現的耐藥現象。