引用本文： 任生生, 許亮亮, 張鳴, 徐明清. 體液環狀 RNA 用于疾病診斷的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(5): 611-619. doi: 10.7507/1007-9424.201811022 復制
環狀 RNA 是一類內源性的、經反向剪接后由 3′端及 5′端共價結合形成的環狀 RNA 分子[1]，廣泛存在于多種生物體內，具有結構穩定、序列保守、組織細胞特異性等特點。隨著高通量測序技術等 RNA 研究技術的飛速發展，環狀 RNA 的神秘面紗也在逐漸被人們揭開。環狀 RNA 與人類疾病的密切關系正在被人們證實，目前已有研究發現，環狀 RNA 與各種腫瘤[2]、心血管疾病[3]、神經系統疾病[4]、骨關節炎[5]、自身免疫性疾病[6-8]等多種疾病相關，環狀 RNA 作為生物標志物的潛力也正在被逐步證實。另外，體液檢測由于其取材方便、創傷小等特點已被廣泛應用于臨床。當前已有研究[9]發現，環狀 RNA 能經外泌體等途徑被分泌到體液中，Memczak 等[10]也報道了在人體血液中檢測出了大量環狀 RNA，這些都充分說明了體液環狀 RNA 作為生物標志物用于疾病診斷等的可能性。當前一些研究成果也證實了這一點。關于體液環狀 RNA 檢測在疾病診斷、預后等方面應用的研究正在成為環狀 RNA 研究領域的新星和熱點，筆者現就目前國內外有關體液環狀 RNA 在人類疾病診斷方面的研究作一綜述。
1 環狀 RNA 概述
1.1 環狀 RNA 分類
1.1.1 外顯子環狀 RNA
當前研究發現的大部分環狀 RNA 為外顯子來源的環狀 RNA，即外顯子環狀 RNA。目前研究發現，外顯子環狀 RNA 主要通過直接的反式剪接和外顯子跳讀 2 種機制合成，前者是指外顯子下游的 RNA 序列（即 3′ 末端）與上游的 RNA 序列（即 5′ 末端）相結合而形成環狀 RNA[11]；后者又稱套索驅動環化，是指在轉錄過程中，不均一核 RNA（hnRNA）部分折疊而拉近非相鄰的外顯子，從而發生外顯子跳讀并形成套索結構，套索結構被剪切并發生反向剪接而形成環狀 RNA[12]。
1.1.2 內含子環狀 RNA
內含子環狀 RNA，顧名思義，即來源于內含子的環狀 RNA。由于剪接機制不同，內含子可以分為自我剪接內含子、酶促剪接內含子及核 mRNA 內含子，機體內的內含子環狀 RNA 則主要來源于自我剪接內含子。相較于外顯子環狀 RNA，內含子環狀 RNA 的數量較少，其保守性亦較低，另外在穩定性、豐度、功能等方面，二者亦不盡相同[12]。
1.1.3 外顯子-內含子環狀 RNA
外顯子-內含子環狀 RNA 系指 2 個或 2 個以上外顯子環化時，其間的內含子滯留并同時環化而形成的既包含外顯子又包含內含子的環狀 RNA，主要存在于細胞核中，可調節親本基因表達[13-14]。
1.2 環狀 RNA 的特點
1.2.1 穩定性高
環狀 RNA 因其沒有 3′ 和 5′ 端結構，且其本身為環狀閉合結構，故不易被核酸外切酶作用發生水解[15-16]，所以其在生物體內能穩定存在。研究[12]發現，大多數環狀 RNA 的半衰期超過 48 h。
1.2.2 分布廣泛
自從 19 世紀 70 年代環狀 RNA 在類病毒中被發現，此后的研究分別從真菌、病毒、昆蟲、人類細胞等多種生命體中發現了環狀 RNA 的存在。已經有大量研究[16-20]證實，環狀 RNA 普遍存在于各種原核、真核細胞及病毒中。
1.2.3 具有保守性及組織特異性
已有研究[12, 16]證實，環狀 RNA 在不同物種間亦具有保守性。例如，Jeck 等[12]發現，人類成纖維細胞中的 2 121 種環狀 RNA 能與小鼠基因組相配，其中 457 個被匹配的小鼠基因組可以產生相同的環狀 RNA，這從一個方面體現了環狀 RNA 在不同物種間的保守性。而 Memczak 等[16]則發現，小鼠和人體不僅有 82 種相同的環狀 RNA，更發現了環狀 RNA CDR1as 在腦組織中的表達水平高、而在非神經系統組織中表達水平相對較低的現象，這說明環狀 RNA 除了保守性，更存在組織特異性。
1.2.4 高表達
有研究[12, 20-21]發現，部分環狀 RNA 相對于其相同來源的線性轉錄本而言，其表達量高出了十多倍。
1.3 環狀 RNA 的作用途徑
1.3.1 microRNA 分子的海綿功能
環狀 RNA 分子上存在 microRNA 的結合位點，環狀 RNA 可以通過與 microRNA 的結合調節下游基因表達，進而發揮相應的生物功能[22]。現有的研究已經發現，多種環狀 RNA 具有 microRNA 分子海綿功能，如 CDR1as[23]、circular RNA ITCH[13]等。
1.3.2 調控親本基因轉錄
由于環狀 RNA 可被視作一種剪接異構體，故其可能通過翻譯成功能性蛋白或者減少可被翻譯成功能性蛋白的規范化剪接轉錄本，從而在可變調節水平調節基因轉錄[24]。
1.3.3 與 RNA 結合蛋白相互作用
環狀 RNA 可以與某些功能性蛋白結合，進而發揮生物學功能，例如 RNA 剪切因子 muscleblind-like（MBL）可以促進環狀 RNA Mbl（circ Mbl）的環化，而 circ Mbl 也能與 MBL 結合，降低 MBL 的濃度，從而減少 circ Mbl 的合成[25]。
1.3.4 翻譯成蛋白質或多肽而發揮作用
目前已有研究[26]發現，環狀 RNA 可直接翻譯成蛋白質或多肽而發揮其生物學功能。例如，早在 20 世紀 80 年代，Kos 等[26]就發現，丁型肝炎核心的單股負鏈環狀 RNA 可轉錄翻譯成丁型肝炎核心抗原。
2 體液環狀 RNA 在疾病診斷中的作用
2.1 外周血環狀 RNA 與疾病診斷
外周血血液標本（血漿/血清）采集方便且創傷較小，是目前臨床應用得最多的檢驗標本，血液標本可以提供疾病診斷依據、反映疾病進展過程、輔助判斷疾病預后等。目前，通過檢測血液標本中的環狀 RNA，并判斷環狀 RNA 與疾病診斷及預后相關性的研究亦不在少數。
2.1.1 外周血環狀 RNA 在惡性腫瘤診斷中的作用
2.1.1.1 外周血環狀 RNA 與胃腸道惡性腫瘤
Chen 等[27]通過檢測 104 例胃癌患者及健康對照者的血清環狀 RNA 后發現，胃癌患者血清中 has_circ_0000190 的表達下調，且其表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期及 CA19-9 水平相關，故而推斷 has_circ_0000190 可作為胃癌診斷的生物標志物。且在研究中，Chen 等[27]發現，has_circ_0000190 作為胃癌的診斷標志物，其敏感性和特異性均優于 CEA、CA19-9 等常用標志物。此外，Li 等[28]亦發現，胃癌患者術前血清 has_circ_002059 的表達水平低于術后，差異具有統計學意義，且低表達的 has_circ_002059 與胃癌的遠處轉移及進展分期相關，提示 has_circ_002059 可能為胃癌診斷及預后判斷的潛在生物學標志物。Zhao 等[29]也在研究中發現了可以作為胃癌診斷生物標志物的環狀 RNA，即 has_circ_0000181。他們在研究中發現，胃癌患者血清中 has_circ_0000181 的表達相較于健康對照明顯下降，且低表達的 has_circ_0000181 與腫瘤分化程度及 CEA 水平相關[29]。Huang 等[30]則通過研究發現，相對于健康對照，胃癌患者血漿中的 hsa_circ_0000745 的表達水平明顯降低，證明了 hsa_circ_0000745 作為胃癌診斷標志物的可能性。Sun 等[31]則發現，胃癌患者與健康對照相比，其血漿中 hsa_circ_0000520 的表達明顯下調，推測其具有作為胃癌診斷非侵入性標志物之潛能。此外，被發現可能具有胃癌非侵入性診斷標志物潛力的環狀 RNA 還有 has_circ_00006633，由 Lu 等[32]研究發現。Lu 等[32]發現，胃癌患者血漿中的 has_circ_00006633 的表達水平與正常對照組相比明顯下調。目前已有研究[9]發現，結腸癌細胞外泌體中 circRTN4 呈高表達，該結果提示我們，有可能通過檢測外周血外泌體中的環狀 RNA 來診斷結腸癌。
2.1.1.2 外周血環狀 RNA 與肝細胞肝癌（HCC）
Zhang 等[33]發現，HCC 患者血漿中 has_circ_0001445 的轉錄水平低于肝硬變患者、乙肝患者及健康對照，而且受試者操作特征曲線（ROC）結果亦提示，血漿 has_circ_0001445 可作為一種比較準確的標志物，用以區分 HCC 病例與健康人群、肝硬變或乙肝患者。
2.1.1.3 外周血環狀 RNA 與胰腺癌
Li 等[34]發現，轉移性胰腺癌患者的血漿外泌體中 circ-IARS 的表達明顯上調，且 circ-IARS 高表達與腫瘤血管浸潤、肝轉移及 TNM 分期相關；生存分析結果則表明，circ-IARS 表達與胰腺癌患者的生存時間呈負相關。這提示，血漿外泌體中的 circ-IARS 可能為胰腺癌早期診斷及預后判斷方面的非侵入性生物標志物。此外，Yang 等[35]在其研究中也發現，相對于健康對照來說，胰腺癌患者血漿中 circ-LDLRAD3 的表達顯著上調，且與血管、淋巴浸潤及轉移相關，因而推測 circ-LDLRAD3 可以作為胰腺癌的診斷標志物。Shao 等[36]則發現，對吉西他濱治療無應答的胰腺導管腺癌患者，其血漿 chr14：101402109-101464448+和 chr14：52729603-52780244+相較于應答患者明顯升高；在細胞實驗中，他們亦發現，沉默上述 2 種環狀 RNA 表達的、對吉西他濱耐藥的癌細胞可恢復對吉西他濱的耐藥性，而過度表達則會增加對吉西他濱的耐藥性。這提示血漿 chr14：101402109-101464448+和 chr14：52729603-52780244+可能作為非侵入性生物標志物，在判斷胰腺導管腺癌對吉西他濱耐藥方面具有重要應用價值，也提示了此 2 種環狀 RNA 作為對吉西他濱耐藥的胰腺導管腺癌患者的潛在治療靶點的可能性。
2.1.1.4 外周血環狀 RNA 與乳腺癌
Yin 等[37]通過環狀 RNA 的微陣列分析發現，乳腺癌患者相較于健康對照者其血漿環狀 RNA 有 19 種表達上調，22 種表達下調；經 RT-PCR 驗證發現，has_circ_0001785、has_circ_0108942 和 has_circ_0068033 的表達下調具有統計學意義，其中 has_circ_0001785 的診斷價值優于其他 2 種環狀 RNA，且其表達與腫瘤病理分級、TNM 分期及遠處轉移相關。同時他們[37]發現，has_circ_0001785 的診斷準確性要高于 CEA 和 CA153，且乳腺癌患者術后血清中 has_circ_0001785 的表達水平明顯低于術前，這提示 has_circ_0001785 具有乳腺癌診斷標志物的重要作用。
2.1.1.5 外周血環狀 RNA 與肺癌
Zhu 等[38]發現，肺腺癌患者血漿中 hsa_circ_0013958 的表達水平明顯下調，且與 TNM 分期和淋巴結轉移相關，細胞實驗亦證實了 hsa_circ_0013958 具有促進肺腺癌細胞增殖浸潤和侵襲的作用，并有抑制細胞凋亡的作用。此外，他們的研究[38]還發現，hsa_circ_0013958 是通過作為 mircoRNA-134 海綿并抑制其功能來發揮作用的，而 microRNA-134 則是通過下調細胞周期蛋白 D1（CCND1）來發揮對非小細胞肺癌的抑癌作用，因而，Zhu 等[38]推測，mircoRNA-134 可能是通過 microRNA-134-CCND1 通路來發揮作用的。他們的研究結果顯示了 has_circ_0013958 作為肺腺癌早期診斷及篩查的重要非侵入性生物標志物的可能性。另外，Hang 等[39]研究發現，非小細胞肺癌患者血清中 circFARSA 的表達上調，通過細胞實驗他們還證實了 circFARSA 對細胞侵襲及遷移的促進作用。他們的研究[39]同時也表明，circFARSA 可能通過作為 microRNA-330-5P 和 microRNA-326 海綿，通過減輕二者對癌基因脂肪酸合成酶的抑制作用而發揮作用。這為血漿 circFARSA 作為非小細胞肺癌非侵入性生物標志物提供了證據。
2.1.1.6 外周血環狀 RNA 與子宮內膜癌
Xu 等[40]檢測了 10 例 Ⅲ 期子宮內膜癌患者血漿外泌體中的環狀 RNA，并與健康者對照，發現共有 275 種環狀 RNA 的差異存在統計學意義，其中 209 種表達上調，66 種表達下調。經進一步篩選及驗證發現，hsa_circ_ 0109046 和 hsa_circ_0002577 這 2 種環狀 RNA 的表達水平在子宮內膜癌患者的血清外泌體中顯著上升，提示其作為子宮內膜癌的血液診斷標志物之可能。
2.1.2 外周血環狀 RNA 在心血管疾病診斷中的作用
2.1.2.1 外周血環狀 RNA 與冠心病及心肌梗塞
Zhao 等[41]通過對冠心病患者和健康對照患者血清中的環狀 RNA 進行 RNA 微陣列分析發現，冠心病患者的血清環狀 RNA 相較于健康對照有 12 種上調，10 種下調，隨后經過進一步篩選并擴大樣本量驗證后發現，冠心病患者血清中明顯上調的 hsa_circ_0124644 具有最高的靈敏度和特異度，且其聯合同樣在冠心病患者血清中表達上調的 hsa_circ_0098964 后，對冠心病具有更高的診斷價值。Deng 等[42]通過環狀 RNA 微陣列分析比較了急性心肌梗塞患者與健康對照者的血漿環狀 RNA 譜，共有 7 326 種環狀 RNA 被檢測到，有 160 種環狀 RNA 在急性心肌梗塞患者組與健康對照組之間的差異存在統計學意義，其中 73 種表達上調，87 種表達下調；經過進一步篩選發現，circRNA-081881 在急性心肌梗塞患者血漿標本中的表達水平相較于健康對照組明顯降低了 12.5 倍，提示 circRNA-081881 具有作為急性心肌梗塞診斷標志物的潛力。Salgado-Somoza 等[43]檢測了 472 例急性心肌梗塞患者在心肌再灌注時環狀 RNA MICRA 的表達水平，并用心臟彩超評估了 4 個月后患者的左室射血分數（EF）值，依據歐洲心臟病學會（ESC）心力衰竭指南將患者分為 EF 降低組（rEF 組）、中值 EF 組（mrEF 組）及保留 EF 組（pEF 組），經過分析比較發現，rEF 組患者全血標本中環狀 RNA MICRA 的表達水平較 mrEF 組及 pEF 組明顯降低，而 mrEF 組與 pEF 組之間比較差異無統計學意義。這提示了環狀 RNA MICRA 作為心肌梗塞患者預后生物標志物的重要潛力。
2.1.2.2 外周血環狀 RNA 與心力衰竭
除了前文提及的全血標本環狀 RNA MICRA 可能在預測急性心肌梗塞患者 EF 值降低方面具有重要潛力外，目前尚無其他確切環狀 RNA 在外周血中被發現可作為心力衰竭診斷的標志物，但環狀 RNA 研究整體尚處于初始階段。由于環狀 RNA 的性質穩定等特點，外周血環狀 RNA 作為心力衰竭診斷標志物的研究前景仍光明。
2.1.2.3 外周血環狀 RNA 與高血壓
Bao 等[44]通過微陣列分析比較了原發性高血壓患者與健康對照組全血標本中環狀 RNA 的表達水平，通過驗證篩選并進一步分析發現，在原發性高血壓患者全血標本中 has_circ_0037911 的表達明顯上調，且與血肌酐水平相關，推測 has_circ_0037911 可能在原發性高血壓的發病中起重要作用，且是高血壓臨床預測和診斷的潛在生物標志物。另外，Wu 等[45]通過環狀 RNA 微陣列分析比較了高血壓患者和健康對照者血漿中環狀 RNA 的表達差異，發現高血壓患者血漿中的環狀 RNA 相對于健康對照有 13 種表達下調，46 種表達上調，其中 has_circ_0000437、has_circ_0008139、has_circ_0005870 和 has_circ_0040809 的表達水平在 2 組間的差異有統計學意義；經過進一步驗證發現，has_circ_0005870 在高血壓患者血漿中的表達明顯下調，提示其可能是診斷高血壓的一種新型生物標志物。
2.1.3 外周血環狀 RNA 在神經系統疾病診斷中的作用
Zhao 等[46]使用微陣列分析比較了煙霧病和健康對照者血液標本的環狀 RNA，發現 2 組之間存在差異性表達的環狀 RNA 有 146 種，其中 29 種表達上調，117 種表達下調；經過 RT-PCR 驗證后，他們發現，煙霧病患者相對于健康對照者其血液標本中上調最顯著的 3 種環狀 RNA 分別是：has_circ_062557、has_circ_067130 和 has_circ_067209，下調最顯著的 3 種環狀 RNA 分別是：has_circ_100914、has_circ_089761 和 has_circ_089763，提示這 6 種環狀 RNA 可能是煙霧病診斷的重要生物學標志物。Han 等[47]利用微陣列分析分析了大鼠腦卒中模型腦組織中環狀 RNA 的表達，并且進一步篩選驗證出了表達明顯上調的環狀 RNA Hectd1；之后在人類腦卒中患者血漿中的研究結果也表明，Hectd1 的表達顯著上調。分析機制可能是，Hectd1 作為內源性的 microRNA142 海綿來抑制 microRNA142 的活性，從而抑制了 TCDD 誘導的 ADP 多聚核糖聚合酶（TIPARP）的表達，進而抑制星形膠質細胞的自噬[47]。推測 Hectd1 可能參與腦卒中的發生發展，并可作為其診斷的生物標志物及治療的靶點。
2.1.4 外周血環狀 RNA 在自身免疫性疾病診斷中的作用
2.1.4.1 外周血環狀 RNA 與系統性紅斑狼瘡（SLE）
Zhang 等[48]在其研究中，首先對 4 例 SLE 患者和 4 例健康對照患者的血漿樣品進行了 circRNA 芯片檢測，共鑒定出 4 763 種環狀 RNA，其中在 2 組之間表達差異具有統計學意義的共有 112 種（53 種表達上調，59 種表達下調）。隨后，他們篩選出了 3 種表達上調或下調最明顯的環狀 RNA，即 has_circRNA_407176、has_circRNA_406567 及 has_circRNA_001308，并利用 122 例 SLE 患者和 102 名健康對照組的血漿樣本，以及 26 例 SLE 患者和 26 名健康對照組的外周血單核細胞樣本對實驗結果進行了驗證，最終發現，SLE 患者血漿標本及外周血單核細胞標本中的 has_circRNA_407176 和 has_circRNA_001308 的表達水平較健康對照均明顯下調，但 has_circRNA_406567 的驗證結果無統計學差異。因而推論，has_circRNA_407176 和 has_circRNA_001308 可能是 SLE 的外周血生物標志物。Li 等[8]則利用環狀 RNA 微陣列技術檢測了 SLE 患者與健康對照者的血清環狀 RNA，鑒定出了 207 種差異表達的環狀 RNA（113 種表達上調，94 種表達下調），經過進一步篩選驗證發現，has_circ_102584、hsa_circ_400011 和 hsa_circ_101471 在 SLE 患者血清中的表達水平顯著下降，而 hsa_circ_100226 的表達則顯著上調。此外，還有研究[49]發現，SLE 患者外周血單核細胞中 hsa_circ_0049224 和 has_circ_0049220 的表達水平顯著低于健康對照，且上述 2 種環狀 RNA 的表達水平與 SLE 活動水平呈負相關。
2.1.4.2 外周血環狀 RNA 與多發性硬化癥
Iparraguirre 等[50]對多發性硬化癥患者的外周血白細胞進行了環狀 RNA 微陣列分析，并與健康者進行對照，確定了多發性硬化癥患者外周血白細胞的環狀 RNA 表達譜，共有 13 617 種環狀 RNA，且發現 2 組之間有 406 種環狀 RNA 存在表達差異；經過進一步篩選驗證，發現 circ0005402 和 circ0035560 在多發性硬化癥患者外周血標本中的表達水平顯著降低，此 2 種環狀 RNA 可作為多發性硬化癥診斷的生物學標志物。
2.1.4.3 外周血環狀 RNA 與類風濕性關節炎
Ouyang 等[51]使用環狀 RNA 微陣列分析分析了 4 例類風濕性關節炎患者及健康對照外周血白細胞的環狀 RNA 表達譜，發現類風濕性關節炎患者中有9 種環狀 RNA 表達上調，3 種表達下調；經進一步篩選并在 30 例類風濕性關節炎患者及 25 份健康對照標本中進行驗證分析，發現 circRNA_104871、circRNA_003524、circRNA_101873 和 circRNA_103047 在類風濕性關節炎及健康對照外周血白細胞中的表達具有顯著差異且有診斷價值，其中 ROC 結果提示 circRNA_104871 的診斷價值最高。此外，Luo 等[52]的研究發現，外周血 has_circ_0044235 可能是類風濕性關節炎的診斷標志物。Zheng 等[7]在其研究中也發現了在類風濕性關節炎患者及健康對照者外周血單核細胞中表達具有顯著差異的 5 種環狀 RNA，其中 4 種表達上調：has_circRNA_104194、has_circRNA_103334、has_circRNA_104593 和 has_circRNA_101407；1 種表達下調：has_circRNA_102594。
2.1.4.4 外周血環狀 RNA 與原發性膽汁性膽管炎
Zheng 等[53]使用環狀 RNA 微陣列分析鑒定了 6 例原發性膽汁性膽管炎患者及 6 位健康對照者血漿標本的環狀 RNA 表達譜，共有 7 344 種環狀 RNA 被鑒定出，其中 2 組間差異有統計學意義的共有 22 種（18 種表達上調，4 種表達下調）；隨后他們進行進一步篩選、增加樣本量并使用 RT-PCR 進行驗證以及進行 ROC 分析，最終確定了曲線下面積（AUC）較高、P值較低且表達水平較高的 hsa_circ_402458，作為原發性膽汁性膽管炎的最佳生物標志物。
2.1.5 外周血環狀 RNA 在糖尿病及糖尿病相關性疾病診斷中的作用
2.1.5.1 外周血環狀 RNA 與糖尿病
Zhao 等[54]在其研究中使用微陣列分析對 6 例 2 型糖尿病患者及 6 例健康對照的血漿標本進行了環狀 RNA 微陣列分析，共發現 489 種在 2 組之間表達差異具有統計學意義的環狀 RNA，其中有 78 種表達上調，411 種表達下調；隨后經過篩選，在擴大樣本量的 2 型糖尿病患者、糖尿病前期人群及健康對照組 3 組中進行了驗證及分析，發現 has_circ_0054633 對糖尿病前期及 2 型糖尿病具有一定的診斷能力，具有作為二者血漿診斷標志物的潛力。此外，Li 等[55]則在其研究中通過分析冠心病患者、糖尿病患者、糖尿病合并冠心病患者及健康對照者的血漿環狀 RNA，發現在上述 3 種患者血漿中顯著下調的 has_circRNA_11783-2 與糖尿病及冠心病關系密切。
2.1.5.2 外周血環狀 RNA 與糖尿病視網膜病變
Zhang 等[56]首先鑒定了糖尿病視網膜病變患者和非糖尿病個體視網膜的環狀 RNA 表達譜，然后進一步篩選并分析驗證得出，circ_0005015 在糖尿病視網膜病變患者的病變視網膜組織中表達明顯上升，且對糖尿病視網膜病變具有一定的診斷價值。隨后他們檢測了正常人、白內障患者及糖尿病視網膜病變患者血漿中 circ-0005015 的表達水平，發現糖尿病視網膜病變患者血漿中 circ-0005015 的表達水平明顯高于其他 2 組；另外他們還發現，circ_0005015 可能通過調控人視網膜微血管內皮細胞（HRVEC）的功能參與糖尿病視網膜病變的發病機制[56]。他們的研究證明了，circ_0005015 是一種很有前途的可以用于糖尿病視網膜病變診斷和預后的生物標志物，并且可以促進視網膜內皮血管生成。而在另一項研究中，Gu 等[57]則直接鑒定了糖尿病視網膜病變患者、單純糖尿病無視網膜病變患者及健康對照者的環狀 RNA 表達譜，發現糖尿病視網膜病變患者與單純糖尿病患者及健康對照之間共有 32 種環狀 RNA 的表達差異具有統計學意義，且這 32 種環狀 RNA 在糖尿病視網膜患者血清中的表達均上調。
2.1.5.3 外周血環狀 RNA 與 2 型糖尿病患者慢性感染
Fang 等[58]在其研究中鑒定了 2 型糖尿病患者與健康對照者外周血白細胞的環狀 RNA 表達譜，發現 2 組之間有 220 種環狀 RNA 的表達存在差異，其中 107 種表達上調，113 種表達下調。經過篩選驗證，發現 2 型糖尿病患者外周血白細胞中 circANKRD36 的表達水平相對于健康對照明顯上升，且其表達水平與糖化血紅蛋白及白介素 6 水平呈正相關，因而推論，circANKRD36 可以作為篩查 2 型糖尿病患者慢性炎癥的潛在生物標志物。
2.1.5.4 外周血環狀 RNA 與 2 型糖尿病合并抑郁癥
當前已有研究[59-61]發現，2 型糖尿病和抑郁癥之間有密切聯系。基于此，Jiang 等[62]利用環狀 RNA 微陣列分析檢測了合并抑郁癥的 2 型糖尿病患者及單純 2 型糖尿病患者全血標本的環狀 RNA 表達譜，結果發現，合并抑郁癥的 2 型糖尿病患者與單純2 型糖尿病患者相比，其血液標本中有 183 種環狀 RNA 表達上調，64 種表達下調；經過進一步篩選驗證，確定了 4 種在 2 組之間表達具有顯著差異且經 QT-PCR 驗證與微陣列分析結果一致的環狀 RNA，分別是 has_circRNA_003251、has_circRNA_015115、has_circRNA_100918 和 has_circRNA_001520；其后，他們進一步篩選了以上 4 種環狀 RNA 可以靶向調節的 microRNA，并研究了其可能的作用通路，結果顯示，以上 4 種環狀 RNA 可能通過參與甲狀腺激素、Wnt、ErbB 和絲裂原活化蛋白激酶信號通路而發揮作用。
2.1.6 外周血環狀 RNA 在其他疾病診斷中的作用
2.1.6.1 外周血環狀 RNA 與活動性肺結核
Huang 等[63]鑒定了 3 例活動性肺結核患者及 3 例健康對照者外周血單核細胞的環狀 RNA 表達譜，發現共有 37 種差異表達的環狀 RNA，其中 13 種表達上調，24 種表達下調。隨后在表達上調和下調的環狀 RNA 中分別選擇了最顯著的 3 種：即 hsa_circRNA_001937、hsa_circRNA_009024、hsa_circRNA_005086 和 hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_104964、hsa_circRNA_104296；之后擴大樣本量進行驗證，并檢測了其診斷價值及診斷的敏感性及特異性，結果提示，hsa_circRNA_001937的診斷敏感性及特異性最高，最具診斷價值，且其與 hsa_circRNA_009024 聯合時診斷的準確性更高。該研究結果提示，外周血 hsa_circRNA_001937 是一個很有潛力的活動性肺結核的診斷標志物。外周血環狀 RNA 在活動性肺結核診斷中的重要潛力在 Qian 等[64]的研究中亦得到了證實。此外，Zhang 等[65]利用全轉錄組測序分析了 3 例肺結核患者及 3 例健康對照者的外周血環狀 RNA 的表達情況，共鑒定出 16 288 種環狀 RNA，其中 170 種環狀 RNA 表達在 2 組之間存在顯著差異（有 102 種環狀 RNA 在肺結核患者外周血中表達上調，68 種表達下調），進一步篩選出的 hsa_circRNA_14623、hsa_circ_09585、hsa_circ_005538、hsa_circ_09993、hsa_circ_13478 和 hsa_circ_00074 經 QT-PCR 驗證結果與測序結果一致，可能的信號通路也在該研究中被分析。這提示環狀 RNA 作為肺結核血液標志物的重要潛能及其在肺結核病理生理中可能發揮重要作用。
2.1.6.2 外周血環狀 RNA 與子癇前期
Jiang 等[66]首次通過環狀 RNA 微陣列分析鑒定了子癇前期孕婦和健康對照孕婦外周血細胞的環狀 RNA 譜，結果發現，子癇前期孕婦和健康對照孕婦外周血細胞中共有 5 396 種環狀 RNA 被鑒定，其中有顯著差異的環狀 RNA 有 2 178 種（子癇前期孕婦外周血相對于健康對照者表達上調的環狀 RNA 有 1 294 種，表達下調的有 884 種）；經篩選及進一步驗證，他們確定了在子癇前期孕婦外周血中表達顯著上調的2 種環狀 RNA，即 has_circ_0004904 和 has_circ_0001855，提示此 2 種環狀 RNA 對于子癇前期具有診斷價值；此外，他們還發現，上述 2 種環狀 RNA 可能上調妊娠相關血漿蛋白 A（PAPP-A）的表達水平，且上述 2 種環狀 RNA 合并 PAPP-A 對子癇前期具有更好的診斷價值。
2.1.6.3 外周血環狀 RNA 與慢性髓系白血病
Liu 等[67]在其研究中利用高通量測序技術鑒定了慢性髓系白血病患者及健康對照者的外周血環狀 RNA 表達譜，且經篩選驗證分析發現，相較于健康對照，慢性髓系白血病患者外周血中 has_circ_0080145 的表達水平明顯上調，且功能實驗等結果證明，敲低 has_circ_0080145 會顯著抑制慢性髓系白血病細胞增殖，且其可能是通過作為 microRNA-29b 海綿來發揮作用的。他們的研究提示，has_circ_0080145 可能是慢性髓系白血病重要的診斷和預后標志物及潛在的治療靶點。
2.2 唾液中的環狀 RNA 與疾病診斷
唾液因其取材方便、快捷、廉價、取材過程無創等優點，近年來越來越被視作疾病研究中的理想的體液標本。關于唾液中的疾病標志物的研究越來越多，唾液中環狀 RNA 的研究也正在興起，環狀 RNA 因其穩定性高等特點正被越來越多的研究證實其作為疾病生物標志物的重要作用。
Zhao 等[68]通過微陣列分析方法鑒定了 3 例口腔鱗狀細胞癌患者和 3 例健康對照者唾液中的環狀 RNA 表達譜，發現有 32 種環狀 RNA 在 2 組之間的表達存在差異，其中有 12 種環狀 RNA 在口腔鱗癌患者唾液中的表達相對于健康對照上調，20 種下調。隨后他們選擇了上調最顯著的 3 種環狀 RNA（hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971 和 hsa_circ_0008068）和下調最顯著的 3 種（hsa_circ_0000140、hsa_circ_0002632 和 hsa_circ_0008792）進行進一步驗證分析，發現 qRT-PCR 驗證結果與微陣列分析結果一致。ROC 分析則顯示，上述 6 種環狀 RNA 均對口腔鱗癌具有診斷價值，其中 hsa_circ_0001874 的AUC值最高，且 hsa_circ_0001874 與 hsa_circ_0001971 聯合后的診斷準確度更高。在對以上 6 種環狀 RNA 與口腔鱗癌患者的臨床特征進行分析后發現，has-circ-0001874 與腫瘤 TNM 及病理分級相關，has-circ-0001971 與 TNM 分期相關，其余環狀 RNA 與臨床特征無關。此外，研究者還對比了口腔鱗癌患者術前 1 個月與術后 1 個月唾液中 hsa_circ_0001874 與 hsa_circ_0001971 的表達水平，發現術后 1 個月上述 2 種環狀 RNA 在口腔鱗癌患者唾液中的表達水平較術前 1 個月明顯減低。Zhao 等[68]通過上述研究向人們證實了唾液環狀 RNA 在口腔鱗癌的診斷及預后中的重要潛力。這也為更多的關于唾液環狀 RNA 與人類疾病關系的研究奠定了基礎。
2.3 尿液中的環狀 RNA 與疾病診斷
尿液是人體的重要排泄物，泌尿系統的多種疾病都會在尿液中有所體現，而尿液本身因其取材方便快捷、方法簡單廉價等優點在臨床應用廣泛。除了尿液臨床指標檢測有助于泌尿系統疾病的診斷和病情判斷外，尿液中的非編碼 RNA 這類重要的生物分子，目前業已有研究[69]發現其具有疾病診斷及預后相關的潛力。
Chen 等[69]利用環狀 RNA 微陣列分析方法鑒定了膀胱尿路上皮癌和癌旁組織中的環狀 RNA 表達譜，經過分析驗證發現，環狀 RNA circPRMT5 的表達在癌組織中顯著上調；隨后又檢測了膀胱尿路上皮癌患者血清及尿液外泌體中的 circPRMT5，發現與健康對照相比，膀胱尿路上皮癌患者的血清及尿液外泌體中 circPRMT5 的表達顯著上調，且與腫瘤淋巴結轉移及進展相關，提示血清及尿液中的外泌體環狀 RNA circPRMT5 具有作為膀胱尿路上皮癌診斷及預后生物標志物的重要潛能。
2.4 胃液中的環狀 RNA 與疾病診斷
Shao 等[70]在其研究中，利用環狀 RNA 微陣列分析鑒定了胃癌及癌旁組織中的環狀 RNA 譜，經進一步研究發現，hsa_circ_0014717 在胃癌組織中的表達水平明顯下調，且與胃癌腫瘤分期、遠處轉移、CEA 水平及 CA19-9 水平相關，但與淋巴結轉移等其他臨床特征無關。同時他們發現，hsa_circ_0014717 可以在胃液中穩定存在，但是在比較了胃癌患者、胃潰瘍患者、慢性萎縮性胃炎患者及健康對照者胃液中的 has_circ_0014717 水平后發現，此環狀 RNA 的表達水平在胃癌、胃潰瘍及健康對照組胃液中的差異并無統計學意義，僅在慢性萎縮性胃炎患者的胃液中表達顯著下調[70]。雖然 Shao 等[70]的研究未成功證明胃液中環狀 RNA has_circ_0014717 可作為胃癌的診斷標志物，但卻成功證實了環狀 RNA 可以穩定在胃液中存在，且可能與慢性萎縮性胃炎的診斷有關，但具體還需進一步研究證實。
2.5 精漿中的環狀 RNA 與疾病診斷
Dong 等[71]利用高通量測序鑒定了人類睪丸組織的環狀 RNA 表達譜，總共發現 15 996 種環狀 RNA，隨后他們利用基因分析篩選了與生殖相關的環狀 RNA，并在健康成年男性的精漿中也發現了這些與生殖相關的環狀 RNA。同時他們發現，精漿中的這些環狀 RNA 與蛋白結合形成復合物且性質十分穩定，提示精漿中的相關環狀 RNA 可能具有作為生殖相關疾病的生物標志物的潛能，但是尚無與相應疾病相關的確切研究，所以還需要進一步研究。但無論如何，他們的研究為今后男性不育疾病的無創生物標志物的開發奠定了基礎。
3 小結與展望
無創的、可以早期診斷疾病或判斷疾病病情的診斷手段是目前臨床疾病診療中所迫切需要的，環狀 RNA 因其性質穩定、高表達、可被分泌至體液中等特點，在疾病診斷及預后中具有重要潛力，研究前景廣闊。如前述，目前已經有相關研究結果發表，但由于目前關于環狀 RNA 的研究尚處于起始階段，關于體液環狀 RNA 與疾病的研究數量少，研究病種單一，有些體液環狀 RNA 的研究更是尚無人涉足，目前尚有許多空白需要填補，如尿液中是否有合適的環狀 RNA 與泌尿系統各種惡性腫瘤或者慢性腎臟病等疾病的診斷相關、腦脊液中的環狀 RNA 檢測是否可輔助診斷神經系統疾病、關節液中的環狀 RNA 與骨關節疾病的診斷有何關系等。此外，當前已發表的研究也需要繼續深入研究，以便成果能夠早日應用于臨床。
環狀 RNA 是一類內源性的、經反向剪接后由 3′端及 5′端共價結合形成的環狀 RNA 分子[1]，廣泛存在于多種生物體內，具有結構穩定、序列保守、組織細胞特異性等特點。隨著高通量測序技術等 RNA 研究技術的飛速發展，環狀 RNA 的神秘面紗也在逐漸被人們揭開。環狀 RNA 與人類疾病的密切關系正在被人們證實，目前已有研究發現，環狀 RNA 與各種腫瘤[2]、心血管疾病[3]、神經系統疾病[4]、骨關節炎[5]、自身免疫性疾病[6-8]等多種疾病相關，環狀 RNA 作為生物標志物的潛力也正在被逐步證實。另外，體液檢測由于其取材方便、創傷小等特點已被廣泛應用于臨床。當前已有研究[9]發現，環狀 RNA 能經外泌體等途徑被分泌到體液中，Memczak 等[10]也報道了在人體血液中檢測出了大量環狀 RNA，這些都充分說明了體液環狀 RNA 作為生物標志物用于疾病診斷等的可能性。當前一些研究成果也證實了這一點。關于體液環狀 RNA 檢測在疾病診斷、預后等方面應用的研究正在成為環狀 RNA 研究領域的新星和熱點，筆者現就目前國內外有關體液環狀 RNA 在人類疾病診斷方面的研究作一綜述。
1 環狀 RNA 概述
1.1 環狀 RNA 分類
1.1.1 外顯子環狀 RNA
當前研究發現的大部分環狀 RNA 為外顯子來源的環狀 RNA，即外顯子環狀 RNA。目前研究發現，外顯子環狀 RNA 主要通過直接的反式剪接和外顯子跳讀 2 種機制合成，前者是指外顯子下游的 RNA 序列（即 3′ 末端）與上游的 RNA 序列（即 5′ 末端）相結合而形成環狀 RNA[11]；后者又稱套索驅動環化，是指在轉錄過程中，不均一核 RNA（hnRNA）部分折疊而拉近非相鄰的外顯子，從而發生外顯子跳讀并形成套索結構，套索結構被剪切并發生反向剪接而形成環狀 RNA[12]。
1.1.2 內含子環狀 RNA
內含子環狀 RNA，顧名思義，即來源于內含子的環狀 RNA。由于剪接機制不同，內含子可以分為自我剪接內含子、酶促剪接內含子及核 mRNA 內含子，機體內的內含子環狀 RNA 則主要來源于自我剪接內含子。相較于外顯子環狀 RNA，內含子環狀 RNA 的數量較少，其保守性亦較低，另外在穩定性、豐度、功能等方面，二者亦不盡相同[12]。
1.1.3 外顯子-內含子環狀 RNA
外顯子-內含子環狀 RNA 系指 2 個或 2 個以上外顯子環化時，其間的內含子滯留并同時環化而形成的既包含外顯子又包含內含子的環狀 RNA，主要存在于細胞核中，可調節親本基因表達[13-14]。
1.2 環狀 RNA 的特點
1.2.1 穩定性高
環狀 RNA 因其沒有 3′ 和 5′ 端結構，且其本身為環狀閉合結構，故不易被核酸外切酶作用發生水解[15-16]，所以其在生物體內能穩定存在。研究[12]發現，大多數環狀 RNA 的半衰期超過 48 h。
1.2.2 分布廣泛
自從 19 世紀 70 年代環狀 RNA 在類病毒中被發現，此后的研究分別從真菌、病毒、昆蟲、人類細胞等多種生命體中發現了環狀 RNA 的存在。已經有大量研究[16-20]證實，環狀 RNA 普遍存在于各種原核、真核細胞及病毒中。
1.2.3 具有保守性及組織特異性
已有研究[12, 16]證實，環狀 RNA 在不同物種間亦具有保守性。例如，Jeck 等[12]發現，人類成纖維細胞中的 2 121 種環狀 RNA 能與小鼠基因組相配，其中 457 個被匹配的小鼠基因組可以產生相同的環狀 RNA，這從一個方面體現了環狀 RNA 在不同物種間的保守性。而 Memczak 等[16]則發現，小鼠和人體不僅有 82 種相同的環狀 RNA，更發現了環狀 RNA CDR1as 在腦組織中的表達水平高、而在非神經系統組織中表達水平相對較低的現象，這說明環狀 RNA 除了保守性，更存在組織特異性。
1.2.4 高表達
有研究[12, 20-21]發現，部分環狀 RNA 相對于其相同來源的線性轉錄本而言，其表達量高出了十多倍。
1.3 環狀 RNA 的作用途徑
1.3.1 microRNA 分子的海綿功能
環狀 RNA 分子上存在 microRNA 的結合位點，環狀 RNA 可以通過與 microRNA 的結合調節下游基因表達，進而發揮相應的生物功能[22]。現有的研究已經發現，多種環狀 RNA 具有 microRNA 分子海綿功能，如 CDR1as[23]、circular RNA ITCH[13]等。
1.3.2 調控親本基因轉錄
由于環狀 RNA 可被視作一種剪接異構體，故其可能通過翻譯成功能性蛋白或者減少可被翻譯成功能性蛋白的規范化剪接轉錄本，從而在可變調節水平調節基因轉錄[24]。
1.3.3 與 RNA 結合蛋白相互作用
環狀 RNA 可以與某些功能性蛋白結合，進而發揮生物學功能，例如 RNA 剪切因子 muscleblind-like（MBL）可以促進環狀 RNA Mbl（circ Mbl）的環化，而 circ Mbl 也能與 MBL 結合，降低 MBL 的濃度，從而減少 circ Mbl 的合成[25]。
1.3.4 翻譯成蛋白質或多肽而發揮作用
目前已有研究[26]發現，環狀 RNA 可直接翻譯成蛋白質或多肽而發揮其生物學功能。例如，早在 20 世紀 80 年代，Kos 等[26]就發現，丁型肝炎核心的單股負鏈環狀 RNA 可轉錄翻譯成丁型肝炎核心抗原。
2 體液環狀 RNA 在疾病診斷中的作用
2.1 外周血環狀 RNA 與疾病診斷
外周血血液標本（血漿/血清）采集方便且創傷較小，是目前臨床應用得最多的檢驗標本，血液標本可以提供疾病診斷依據、反映疾病進展過程、輔助判斷疾病預后等。目前，通過檢測血液標本中的環狀 RNA，并判斷環狀 RNA 與疾病診斷及預后相關性的研究亦不在少數。
2.1.1 外周血環狀 RNA 在惡性腫瘤診斷中的作用
2.1.1.1 外周血環狀 RNA 與胃腸道惡性腫瘤
Chen 等[27]通過檢測 104 例胃癌患者及健康對照者的血清環狀 RNA 后發現，胃癌患者血清中 has_circ_0000190 的表達下調，且其表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期及 CA19-9 水平相關，故而推斷 has_circ_0000190 可作為胃癌診斷的生物標志物。且在研究中，Chen 等[27]發現，has_circ_0000190 作為胃癌的診斷標志物，其敏感性和特異性均優于 CEA、CA19-9 等常用標志物。此外，Li 等[28]亦發現，胃癌患者術前血清 has_circ_002059 的表達水平低于術后，差異具有統計學意義，且低表達的 has_circ_002059 與胃癌的遠處轉移及進展分期相關，提示 has_circ_002059 可能為胃癌診斷及預后判斷的潛在生物學標志物。Zhao 等[29]也在研究中發現了可以作為胃癌診斷生物標志物的環狀 RNA，即 has_circ_0000181。他們在研究中發現，胃癌患者血清中 has_circ_0000181 的表達相較于健康對照明顯下降，且低表達的 has_circ_0000181 與腫瘤分化程度及 CEA 水平相關[29]。Huang 等[30]則通過研究發現，相對于健康對照，胃癌患者血漿中的 hsa_circ_0000745 的表達水平明顯降低，證明了 hsa_circ_0000745 作為胃癌診斷標志物的可能性。Sun 等[31]則發現，胃癌患者與健康對照相比，其血漿中 hsa_circ_0000520 的表達明顯下調，推測其具有作為胃癌診斷非侵入性標志物之潛能。此外，被發現可能具有胃癌非侵入性診斷標志物潛力的環狀 RNA 還有 has_circ_00006633，由 Lu 等[32]研究發現。Lu 等[32]發現，胃癌患者血漿中的 has_circ_00006633 的表達水平與正常對照組相比明顯下調。目前已有研究[9]發現，結腸癌細胞外泌體中 circRTN4 呈高表達，該結果提示我們，有可能通過檢測外周血外泌體中的環狀 RNA 來診斷結腸癌。
2.1.1.2 外周血環狀 RNA 與肝細胞肝癌（HCC）
Zhang 等[33]發現，HCC 患者血漿中 has_circ_0001445 的轉錄水平低于肝硬變患者、乙肝患者及健康對照，而且受試者操作特征曲線（ROC）結果亦提示，血漿 has_circ_0001445 可作為一種比較準確的標志物，用以區分 HCC 病例與健康人群、肝硬變或乙肝患者。
2.1.1.3 外周血環狀 RNA 與胰腺癌
Li 等[34]發現，轉移性胰腺癌患者的血漿外泌體中 circ-IARS 的表達明顯上調，且 circ-IARS 高表達與腫瘤血管浸潤、肝轉移及 TNM 分期相關；生存分析結果則表明，circ-IARS 表達與胰腺癌患者的生存時間呈負相關。這提示，血漿外泌體中的 circ-IARS 可能為胰腺癌早期診斷及預后判斷方面的非侵入性生物標志物。此外，Yang 等[35]在其研究中也發現，相對于健康對照來說，胰腺癌患者血漿中 circ-LDLRAD3 的表達顯著上調，且與血管、淋巴浸潤及轉移相關，因而推測 circ-LDLRAD3 可以作為胰腺癌的診斷標志物。Shao 等[36]則發現，對吉西他濱治療無應答的胰腺導管腺癌患者，其血漿 chr14：101402109-101464448+和 chr14：52729603-52780244+相較于應答患者明顯升高；在細胞實驗中，他們亦發現，沉默上述 2 種環狀 RNA 表達的、對吉西他濱耐藥的癌細胞可恢復對吉西他濱的耐藥性，而過度表達則會增加對吉西他濱的耐藥性。這提示血漿 chr14：101402109-101464448+和 chr14：52729603-52780244+可能作為非侵入性生物標志物，在判斷胰腺導管腺癌對吉西他濱耐藥方面具有重要應用價值，也提示了此 2 種環狀 RNA 作為對吉西他濱耐藥的胰腺導管腺癌患者的潛在治療靶點的可能性。
2.1.1.4 外周血環狀 RNA 與乳腺癌
Yin 等[37]通過環狀 RNA 的微陣列分析發現，乳腺癌患者相較于健康對照者其血漿環狀 RNA 有 19 種表達上調，22 種表達下調；經 RT-PCR 驗證發現，has_circ_0001785、has_circ_0108942 和 has_circ_0068033 的表達下調具有統計學意義，其中 has_circ_0001785 的診斷價值優于其他 2 種環狀 RNA，且其表達與腫瘤病理分級、TNM 分期及遠處轉移相關。同時他們[37]發現，has_circ_0001785 的診斷準確性要高于 CEA 和 CA153，且乳腺癌患者術后血清中 has_circ_0001785 的表達水平明顯低于術前，這提示 has_circ_0001785 具有乳腺癌診斷標志物的重要作用。
2.1.1.5 外周血環狀 RNA 與肺癌
Zhu 等[38]發現，肺腺癌患者血漿中 hsa_circ_0013958 的表達水平明顯下調，且與 TNM 分期和淋巴結轉移相關，細胞實驗亦證實了 hsa_circ_0013958 具有促進肺腺癌細胞增殖浸潤和侵襲的作用，并有抑制細胞凋亡的作用。此外，他們的研究[38]還發現，hsa_circ_0013958 是通過作為 mircoRNA-134 海綿并抑制其功能來發揮作用的，而 microRNA-134 則是通過下調細胞周期蛋白 D1（CCND1）來發揮對非小細胞肺癌的抑癌作用，因而，Zhu 等[38]推測，mircoRNA-134 可能是通過 microRNA-134-CCND1 通路來發揮作用的。他們的研究結果顯示了 has_circ_0013958 作為肺腺癌早期診斷及篩查的重要非侵入性生物標志物的可能性。另外，Hang 等[39]研究發現，非小細胞肺癌患者血清中 circFARSA 的表達上調，通過細胞實驗他們還證實了 circFARSA 對細胞侵襲及遷移的促進作用。他們的研究[39]同時也表明，circFARSA 可能通過作為 microRNA-330-5P 和 microRNA-326 海綿，通過減輕二者對癌基因脂肪酸合成酶的抑制作用而發揮作用。這為血漿 circFARSA 作為非小細胞肺癌非侵入性生物標志物提供了證據。
2.1.1.6 外周血環狀 RNA 與子宮內膜癌
Xu 等[40]檢測了 10 例 Ⅲ 期子宮內膜癌患者血漿外泌體中的環狀 RNA，并與健康者對照，發現共有 275 種環狀 RNA 的差異存在統計學意義，其中 209 種表達上調，66 種表達下調。經進一步篩選及驗證發現，hsa_circ_ 0109046 和 hsa_circ_0002577 這 2 種環狀 RNA 的表達水平在子宮內膜癌患者的血清外泌體中顯著上升，提示其作為子宮內膜癌的血液診斷標志物之可能。
2.1.2 外周血環狀 RNA 在心血管疾病診斷中的作用
2.1.2.1 外周血環狀 RNA 與冠心病及心肌梗塞
Zhao 等[41]通過對冠心病患者和健康對照患者血清中的環狀 RNA 進行 RNA 微陣列分析發現，冠心病患者的血清環狀 RNA 相較于健康對照有 12 種上調，10 種下調，隨后經過進一步篩選并擴大樣本量驗證后發現，冠心病患者血清中明顯上調的 hsa_circ_0124644 具有最高的靈敏度和特異度，且其聯合同樣在冠心病患者血清中表達上調的 hsa_circ_0098964 后，對冠心病具有更高的診斷價值。Deng 等[42]通過環狀 RNA 微陣列分析比較了急性心肌梗塞患者與健康對照者的血漿環狀 RNA 譜，共有 7 326 種環狀 RNA 被檢測到，有 160 種環狀 RNA 在急性心肌梗塞患者組與健康對照組之間的差異存在統計學意義，其中 73 種表達上調，87 種表達下調；經過進一步篩選發現，circRNA-081881 在急性心肌梗塞患者血漿標本中的表達水平相較于健康對照組明顯降低了 12.5 倍，提示 circRNA-081881 具有作為急性心肌梗塞診斷標志物的潛力。Salgado-Somoza 等[43]檢測了 472 例急性心肌梗塞患者在心肌再灌注時環狀 RNA MICRA 的表達水平，并用心臟彩超評估了 4 個月后患者的左室射血分數（EF）值，依據歐洲心臟病學會（ESC）心力衰竭指南將患者分為 EF 降低組（rEF 組）、中值 EF 組（mrEF 組）及保留 EF 組（pEF 組），經過分析比較發現，rEF 組患者全血標本中環狀 RNA MICRA 的表達水平較 mrEF 組及 pEF 組明顯降低，而 mrEF 組與 pEF 組之間比較差異無統計學意義。這提示了環狀 RNA MICRA 作為心肌梗塞患者預后生物標志物的重要潛力。
2.1.2.2 外周血環狀 RNA 與心力衰竭
除了前文提及的全血標本環狀 RNA MICRA 可能在預測急性心肌梗塞患者 EF 值降低方面具有重要潛力外，目前尚無其他確切環狀 RNA 在外周血中被發現可作為心力衰竭診斷的標志物，但環狀 RNA 研究整體尚處于初始階段。由于環狀 RNA 的性質穩定等特點，外周血環狀 RNA 作為心力衰竭診斷標志物的研究前景仍光明。
2.1.2.3 外周血環狀 RNA 與高血壓
Bao 等[44]通過微陣列分析比較了原發性高血壓患者與健康對照組全血標本中環狀 RNA 的表達水平，通過驗證篩選并進一步分析發現，在原發性高血壓患者全血標本中 has_circ_0037911 的表達明顯上調，且與血肌酐水平相關，推測 has_circ_0037911 可能在原發性高血壓的發病中起重要作用，且是高血壓臨床預測和診斷的潛在生物標志物。另外，Wu 等[45]通過環狀 RNA 微陣列分析比較了高血壓患者和健康對照者血漿中環狀 RNA 的表達差異，發現高血壓患者血漿中的環狀 RNA 相對于健康對照有 13 種表達下調，46 種表達上調，其中 has_circ_0000437、has_circ_0008139、has_circ_0005870 和 has_circ_0040809 的表達水平在 2 組間的差異有統計學意義；經過進一步驗證發現，has_circ_0005870 在高血壓患者血漿中的表達明顯下調，提示其可能是診斷高血壓的一種新型生物標志物。
2.1.3 外周血環狀 RNA 在神經系統疾病診斷中的作用
Zhao 等[46]使用微陣列分析比較了煙霧病和健康對照者血液標本的環狀 RNA，發現 2 組之間存在差異性表達的環狀 RNA 有 146 種，其中 29 種表達上調，117 種表達下調；經過 RT-PCR 驗證后，他們發現，煙霧病患者相對于健康對照者其血液標本中上調最顯著的 3 種環狀 RNA 分別是：has_circ_062557、has_circ_067130 和 has_circ_067209，下調最顯著的 3 種環狀 RNA 分別是：has_circ_100914、has_circ_089761 和 has_circ_089763，提示這 6 種環狀 RNA 可能是煙霧病診斷的重要生物學標志物。Han 等[47]利用微陣列分析分析了大鼠腦卒中模型腦組織中環狀 RNA 的表達，并且進一步篩選驗證出了表達明顯上調的環狀 RNA Hectd1；之后在人類腦卒中患者血漿中的研究結果也表明，Hectd1 的表達顯著上調。分析機制可能是，Hectd1 作為內源性的 microRNA142 海綿來抑制 microRNA142 的活性，從而抑制了 TCDD 誘導的 ADP 多聚核糖聚合酶（TIPARP）的表達，進而抑制星形膠質細胞的自噬[47]。推測 Hectd1 可能參與腦卒中的發生發展，并可作為其診斷的生物標志物及治療的靶點。
2.1.4 外周血環狀 RNA 在自身免疫性疾病診斷中的作用
2.1.4.1 外周血環狀 RNA 與系統性紅斑狼瘡（SLE）
Zhang 等[48]在其研究中，首先對 4 例 SLE 患者和 4 例健康對照患者的血漿樣品進行了 circRNA 芯片檢測，共鑒定出 4 763 種環狀 RNA，其中在 2 組之間表達差異具有統計學意義的共有 112 種（53 種表達上調，59 種表達下調）。隨后，他們篩選出了 3 種表達上調或下調最明顯的環狀 RNA，即 has_circRNA_407176、has_circRNA_406567 及 has_circRNA_001308，并利用 122 例 SLE 患者和 102 名健康對照組的血漿樣本，以及 26 例 SLE 患者和 26 名健康對照組的外周血單核細胞樣本對實驗結果進行了驗證，最終發現，SLE 患者血漿標本及外周血單核細胞標本中的 has_circRNA_407176 和 has_circRNA_001308 的表達水平較健康對照均明顯下調，但 has_circRNA_406567 的驗證結果無統計學差異。因而推論，has_circRNA_407176 和 has_circRNA_001308 可能是 SLE 的外周血生物標志物。Li 等[8]則利用環狀 RNA 微陣列技術檢測了 SLE 患者與健康對照者的血清環狀 RNA，鑒定出了 207 種差異表達的環狀 RNA（113 種表達上調，94 種表達下調），經過進一步篩選驗證發現，has_circ_102584、hsa_circ_400011 和 hsa_circ_101471 在 SLE 患者血清中的表達水平顯著下降，而 hsa_circ_100226 的表達則顯著上調。此外，還有研究[49]發現，SLE 患者外周血單核細胞中 hsa_circ_0049224 和 has_circ_0049220 的表達水平顯著低于健康對照，且上述 2 種環狀 RNA 的表達水平與 SLE 活動水平呈負相關。
2.1.4.2 外周血環狀 RNA 與多發性硬化癥
Iparraguirre 等[50]對多發性硬化癥患者的外周血白細胞進行了環狀 RNA 微陣列分析，并與健康者進行對照，確定了多發性硬化癥患者外周血白細胞的環狀 RNA 表達譜，共有 13 617 種環狀 RNA，且發現 2 組之間有 406 種環狀 RNA 存在表達差異；經過進一步篩選驗證，發現 circ0005402 和 circ0035560 在多發性硬化癥患者外周血標本中的表達水平顯著降低，此 2 種環狀 RNA 可作為多發性硬化癥診斷的生物學標志物。
2.1.4.3 外周血環狀 RNA 與類風濕性關節炎
Ouyang 等[51]使用環狀 RNA 微陣列分析分析了 4 例類風濕性關節炎患者及健康對照外周血白細胞的環狀 RNA 表達譜，發現類風濕性關節炎患者中有9 種環狀 RNA 表達上調，3 種表達下調；經進一步篩選并在 30 例類風濕性關節炎患者及 25 份健康對照標本中進行驗證分析，發現 circRNA_104871、circRNA_003524、circRNA_101873 和 circRNA_103047 在類風濕性關節炎及健康對照外周血白細胞中的表達具有顯著差異且有診斷價值，其中 ROC 結果提示 circRNA_104871 的診斷價值最高。此外，Luo 等[52]的研究發現，外周血 has_circ_0044235 可能是類風濕性關節炎的診斷標志物。Zheng 等[7]在其研究中也發現了在類風濕性關節炎患者及健康對照者外周血單核細胞中表達具有顯著差異的 5 種環狀 RNA，其中 4 種表達上調：has_circRNA_104194、has_circRNA_103334、has_circRNA_104593 和 has_circRNA_101407；1 種表達下調：has_circRNA_102594。
2.1.4.4 外周血環狀 RNA 與原發性膽汁性膽管炎
Zheng 等[53]使用環狀 RNA 微陣列分析鑒定了 6 例原發性膽汁性膽管炎患者及 6 位健康對照者血漿標本的環狀 RNA 表達譜，共有 7 344 種環狀 RNA 被鑒定出，其中 2 組間差異有統計學意義的共有 22 種（18 種表達上調，4 種表達下調）；隨后他們進行進一步篩選、增加樣本量并使用 RT-PCR 進行驗證以及進行 ROC 分析，最終確定了曲線下面積（AUC）較高、P值較低且表達水平較高的 hsa_circ_402458，作為原發性膽汁性膽管炎的最佳生物標志物。
2.1.5 外周血環狀 RNA 在糖尿病及糖尿病相關性疾病診斷中的作用
2.1.5.1 外周血環狀 RNA 與糖尿病
Zhao 等[54]在其研究中使用微陣列分析對 6 例 2 型糖尿病患者及 6 例健康對照的血漿標本進行了環狀 RNA 微陣列分析，共發現 489 種在 2 組之間表達差異具有統計學意義的環狀 RNA，其中有 78 種表達上調，411 種表達下調；隨后經過篩選，在擴大樣本量的 2 型糖尿病患者、糖尿病前期人群及健康對照組 3 組中進行了驗證及分析，發現 has_circ_0054633 對糖尿病前期及 2 型糖尿病具有一定的診斷能力，具有作為二者血漿診斷標志物的潛力。此外，Li 等[55]則在其研究中通過分析冠心病患者、糖尿病患者、糖尿病合并冠心病患者及健康對照者的血漿環狀 RNA，發現在上述 3 種患者血漿中顯著下調的 has_circRNA_11783-2 與糖尿病及冠心病關系密切。
2.1.5.2 外周血環狀 RNA 與糖尿病視網膜病變
Zhang 等[56]首先鑒定了糖尿病視網膜病變患者和非糖尿病個體視網膜的環狀 RNA 表達譜，然后進一步篩選并分析驗證得出，circ_0005015 在糖尿病視網膜病變患者的病變視網膜組織中表達明顯上升，且對糖尿病視網膜病變具有一定的診斷價值。隨后他們檢測了正常人、白內障患者及糖尿病視網膜病變患者血漿中 circ-0005015 的表達水平，發現糖尿病視網膜病變患者血漿中 circ-0005015 的表達水平明顯高于其他 2 組；另外他們還發現，circ_0005015 可能通過調控人視網膜微血管內皮細胞（HRVEC）的功能參與糖尿病視網膜病變的發病機制[56]。他們的研究證明了，circ_0005015 是一種很有前途的可以用于糖尿病視網膜病變診斷和預后的生物標志物，并且可以促進視網膜內皮血管生成。而在另一項研究中，Gu 等[57]則直接鑒定了糖尿病視網膜病變患者、單純糖尿病無視網膜病變患者及健康對照者的環狀 RNA 表達譜，發現糖尿病視網膜病變患者與單純糖尿病患者及健康對照之間共有 32 種環狀 RNA 的表達差異具有統計學意義，且這 32 種環狀 RNA 在糖尿病視網膜患者血清中的表達均上調。
2.1.5.3 外周血環狀 RNA 與 2 型糖尿病患者慢性感染
Fang 等[58]在其研究中鑒定了 2 型糖尿病患者與健康對照者外周血白細胞的環狀 RNA 表達譜，發現 2 組之間有 220 種環狀 RNA 的表達存在差異，其中 107 種表達上調，113 種表達下調。經過篩選驗證，發現 2 型糖尿病患者外周血白細胞中 circANKRD36 的表達水平相對于健康對照明顯上升，且其表達水平與糖化血紅蛋白及白介素 6 水平呈正相關，因而推論，circANKRD36 可以作為篩查 2 型糖尿病患者慢性炎癥的潛在生物標志物。
2.1.5.4 外周血環狀 RNA 與 2 型糖尿病合并抑郁癥
當前已有研究[59-61]發現，2 型糖尿病和抑郁癥之間有密切聯系。基于此，Jiang 等[62]利用環狀 RNA 微陣列分析檢測了合并抑郁癥的 2 型糖尿病患者及單純 2 型糖尿病患者全血標本的環狀 RNA 表達譜，結果發現，合并抑郁癥的 2 型糖尿病患者與單純2 型糖尿病患者相比，其血液標本中有 183 種環狀 RNA 表達上調，64 種表達下調；經過進一步篩選驗證，確定了 4 種在 2 組之間表達具有顯著差異且經 QT-PCR 驗證與微陣列分析結果一致的環狀 RNA，分別是 has_circRNA_003251、has_circRNA_015115、has_circRNA_100918 和 has_circRNA_001520；其后，他們進一步篩選了以上 4 種環狀 RNA 可以靶向調節的 microRNA，并研究了其可能的作用通路，結果顯示，以上 4 種環狀 RNA 可能通過參與甲狀腺激素、Wnt、ErbB 和絲裂原活化蛋白激酶信號通路而發揮作用。
2.1.6 外周血環狀 RNA 在其他疾病診斷中的作用
2.1.6.1 外周血環狀 RNA 與活動性肺結核
Huang 等[63]鑒定了 3 例活動性肺結核患者及 3 例健康對照者外周血單核細胞的環狀 RNA 表達譜，發現共有 37 種差異表達的環狀 RNA，其中 13 種表達上調，24 種表達下調。隨后在表達上調和下調的環狀 RNA 中分別選擇了最顯著的 3 種：即 hsa_circRNA_001937、hsa_circRNA_009024、hsa_circRNA_005086 和 hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_104964、hsa_circRNA_104296；之后擴大樣本量進行驗證，并檢測了其診斷價值及診斷的敏感性及特異性，結果提示，hsa_circRNA_001937的診斷敏感性及特異性最高，最具診斷價值，且其與 hsa_circRNA_009024 聯合時診斷的準確性更高。該研究結果提示，外周血 hsa_circRNA_001937 是一個很有潛力的活動性肺結核的診斷標志物。外周血環狀 RNA 在活動性肺結核診斷中的重要潛力在 Qian 等[64]的研究中亦得到了證實。此外，Zhang 等[65]利用全轉錄組測序分析了 3 例肺結核患者及 3 例健康對照者的外周血環狀 RNA 的表達情況，共鑒定出 16 288 種環狀 RNA，其中 170 種環狀 RNA 表達在 2 組之間存在顯著差異（有 102 種環狀 RNA 在肺結核患者外周血中表達上調，68 種表達下調），進一步篩選出的 hsa_circRNA_14623、hsa_circ_09585、hsa_circ_005538、hsa_circ_09993、hsa_circ_13478 和 hsa_circ_00074 經 QT-PCR 驗證結果與測序結果一致，可能的信號通路也在該研究中被分析。這提示環狀 RNA 作為肺結核血液標志物的重要潛能及其在肺結核病理生理中可能發揮重要作用。
2.1.6.2 外周血環狀 RNA 與子癇前期
Jiang 等[66]首次通過環狀 RNA 微陣列分析鑒定了子癇前期孕婦和健康對照孕婦外周血細胞的環狀 RNA 譜，結果發現，子癇前期孕婦和健康對照孕婦外周血細胞中共有 5 396 種環狀 RNA 被鑒定，其中有顯著差異的環狀 RNA 有 2 178 種（子癇前期孕婦外周血相對于健康對照者表達上調的環狀 RNA 有 1 294 種，表達下調的有 884 種）；經篩選及進一步驗證，他們確定了在子癇前期孕婦外周血中表達顯著上調的2 種環狀 RNA，即 has_circ_0004904 和 has_circ_0001855，提示此 2 種環狀 RNA 對于子癇前期具有診斷價值；此外，他們還發現，上述 2 種環狀 RNA 可能上調妊娠相關血漿蛋白 A（PAPP-A）的表達水平，且上述 2 種環狀 RNA 合并 PAPP-A 對子癇前期具有更好的診斷價值。
2.1.6.3 外周血環狀 RNA 與慢性髓系白血病
Liu 等[67]在其研究中利用高通量測序技術鑒定了慢性髓系白血病患者及健康對照者的外周血環狀 RNA 表達譜，且經篩選驗證分析發現，相較于健康對照，慢性髓系白血病患者外周血中 has_circ_0080145 的表達水平明顯上調，且功能實驗等結果證明，敲低 has_circ_0080145 會顯著抑制慢性髓系白血病細胞增殖，且其可能是通過作為 microRNA-29b 海綿來發揮作用的。他們的研究提示，has_circ_0080145 可能是慢性髓系白血病重要的診斷和預后標志物及潛在的治療靶點。
2.2 唾液中的環狀 RNA 與疾病診斷
唾液因其取材方便、快捷、廉價、取材過程無創等優點，近年來越來越被視作疾病研究中的理想的體液標本。關于唾液中的疾病標志物的研究越來越多，唾液中環狀 RNA 的研究也正在興起，環狀 RNA 因其穩定性高等特點正被越來越多的研究證實其作為疾病生物標志物的重要作用。
Zhao 等[68]通過微陣列分析方法鑒定了 3 例口腔鱗狀細胞癌患者和 3 例健康對照者唾液中的環狀 RNA 表達譜，發現有 32 種環狀 RNA 在 2 組之間的表達存在差異，其中有 12 種環狀 RNA 在口腔鱗癌患者唾液中的表達相對于健康對照上調，20 種下調。隨后他們選擇了上調最顯著的 3 種環狀 RNA（hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971 和 hsa_circ_0008068）和下調最顯著的 3 種（hsa_circ_0000140、hsa_circ_0002632 和 hsa_circ_0008792）進行進一步驗證分析，發現 qRT-PCR 驗證結果與微陣列分析結果一致。ROC 分析則顯示，上述 6 種環狀 RNA 均對口腔鱗癌具有診斷價值，其中 hsa_circ_0001874 的AUC值最高，且 hsa_circ_0001874 與 hsa_circ_0001971 聯合后的診斷準確度更高。在對以上 6 種環狀 RNA 與口腔鱗癌患者的臨床特征進行分析后發現，has-circ-0001874 與腫瘤 TNM 及病理分級相關，has-circ-0001971 與 TNM 分期相關，其余環狀 RNA 與臨床特征無關。此外，研究者還對比了口腔鱗癌患者術前 1 個月與術后 1 個月唾液中 hsa_circ_0001874 與 hsa_circ_0001971 的表達水平，發現術后 1 個月上述 2 種環狀 RNA 在口腔鱗癌患者唾液中的表達水平較術前 1 個月明顯減低。Zhao 等[68]通過上述研究向人們證實了唾液環狀 RNA 在口腔鱗癌的診斷及預后中的重要潛力。這也為更多的關于唾液環狀 RNA 與人類疾病關系的研究奠定了基礎。
2.3 尿液中的環狀 RNA 與疾病診斷
尿液是人體的重要排泄物，泌尿系統的多種疾病都會在尿液中有所體現，而尿液本身因其取材方便快捷、方法簡單廉價等優點在臨床應用廣泛。除了尿液臨床指標檢測有助于泌尿系統疾病的診斷和病情判斷外，尿液中的非編碼 RNA 這類重要的生物分子，目前業已有研究[69]發現其具有疾病診斷及預后相關的潛力。
Chen 等[69]利用環狀 RNA 微陣列分析方法鑒定了膀胱尿路上皮癌和癌旁組織中的環狀 RNA 表達譜，經過分析驗證發現，環狀 RNA circPRMT5 的表達在癌組織中顯著上調；隨后又檢測了膀胱尿路上皮癌患者血清及尿液外泌體中的 circPRMT5，發現與健康對照相比，膀胱尿路上皮癌患者的血清及尿液外泌體中 circPRMT5 的表達顯著上調，且與腫瘤淋巴結轉移及進展相關，提示血清及尿液中的外泌體環狀 RNA circPRMT5 具有作為膀胱尿路上皮癌診斷及預后生物標志物的重要潛能。
2.4 胃液中的環狀 RNA 與疾病診斷
Shao 等[70]在其研究中，利用環狀 RNA 微陣列分析鑒定了胃癌及癌旁組織中的環狀 RNA 譜，經進一步研究發現，hsa_circ_0014717 在胃癌組織中的表達水平明顯下調，且與胃癌腫瘤分期、遠處轉移、CEA 水平及 CA19-9 水平相關，但與淋巴結轉移等其他臨床特征無關。同時他們發現，hsa_circ_0014717 可以在胃液中穩定存在，但是在比較了胃癌患者、胃潰瘍患者、慢性萎縮性胃炎患者及健康對照者胃液中的 has_circ_0014717 水平后發現，此環狀 RNA 的表達水平在胃癌、胃潰瘍及健康對照組胃液中的差異并無統計學意義，僅在慢性萎縮性胃炎患者的胃液中表達顯著下調[70]。雖然 Shao 等[70]的研究未成功證明胃液中環狀 RNA has_circ_0014717 可作為胃癌的診斷標志物，但卻成功證實了環狀 RNA 可以穩定在胃液中存在，且可能與慢性萎縮性胃炎的診斷有關，但具體還需進一步研究證實。
2.5 精漿中的環狀 RNA 與疾病診斷
Dong 等[71]利用高通量測序鑒定了人類睪丸組織的環狀 RNA 表達譜，總共發現 15 996 種環狀 RNA，隨后他們利用基因分析篩選了與生殖相關的環狀 RNA，并在健康成年男性的精漿中也發現了這些與生殖相關的環狀 RNA。同時他們發現，精漿中的這些環狀 RNA 與蛋白結合形成復合物且性質十分穩定，提示精漿中的相關環狀 RNA 可能具有作為生殖相關疾病的生物標志物的潛能，但是尚無與相應疾病相關的確切研究，所以還需要進一步研究。但無論如何，他們的研究為今后男性不育疾病的無創生物標志物的開發奠定了基礎。
3 小結與展望
無創的、可以早期診斷疾病或判斷疾病病情的診斷手段是目前臨床疾病診療中所迫切需要的，環狀 RNA 因其性質穩定、高表達、可被分泌至體液中等特點，在疾病診斷及預后中具有重要潛力，研究前景廣闊。如前述，目前已經有相關研究結果發表，但由于目前關于環狀 RNA 的研究尚處于起始階段，關于體液環狀 RNA 與疾病的研究數量少，研究病種單一，有些體液環狀 RNA 的研究更是尚無人涉足，目前尚有許多空白需要填補，如尿液中是否有合適的環狀 RNA 與泌尿系統各種惡性腫瘤或者慢性腎臟病等疾病的診斷相關、腦脊液中的環狀 RNA 檢測是否可輔助診斷神經系統疾病、關節液中的環狀 RNA 與骨關節疾病的診斷有何關系等。此外，當前已發表的研究也需要繼續深入研究，以便成果能夠早日應用于臨床。