引用本文： 楊桂, 李莊, 張本斯, 卞思源, 張宏榮, 陳波. EphA2 及 EphrinA1 在乳腺浸潤性導管癌中的表達及臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(5): 555-561. doi: 10.7507/1007-9424.201610044 復制
乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年增高，且呈明顯年輕化趨勢，已嚴重威脅婦女身心健康。尋找指導乳腺癌治療和判斷預后的腫瘤分子標志物已成為目前研究的方向。促紅細胞生成素肝細胞（erythropoietin-producing hepato-cellular，Eph） A2受體在多種腫瘤組織中表達，它能夠促進血管內皮細胞的運動，即控制集合和解聚并控制肌動蛋白細胞骨架收縮、細胞粘連[1]。EphA2 與其配體 EphrinA1 結合，可促進內皮細胞和組織形成毛細血管樣結構，在侵襲、轉移及促進腫瘤新生血管的形成中發揮重要作用[2]。本研究通過檢測乳腺浸潤性導管癌組織中 EphA2 及其配體 EphrinA1 的表達，探討其表達在乳腺浸潤性導管癌中發生、發展、預后判斷等方面的意義，希望為其預后判斷、臨床用藥和靶向治療提供新的思路。
1 資料與方法
1.1 病例資料
收集大理大學附屬醫院病理科 2013 年 4 月至 2015 年 4 月期間的乳腺組織標本 160 例，其中乳腺纖維瘤 30 例，乳腺囊性增生 30 例，浸潤性導管癌 100 例。術前均未經放療、化療或其他特殊治療的各民族婦女的乳腺手術切除標本（新鮮組織及石蠟標本）及患者的臨床病理信息。乳腺浸潤性導管癌患者均為女性，年齡 30～75 歲，平均年齡 55.5 歲，中位年齡 57 歲，其中≤45 歲者 36 例，>45 歲者 64 例。腫瘤直徑≤2 cm 者 36 例，>2 cm 者 64 例。有淋巴結轉移者 57 例，無淋巴結轉移者 43 例。組織學分級：Ⅰ級 3 例，Ⅱ級 54 例，Ⅲ級 43 例。TNM 分期：0～Ⅰ期 5 例，Ⅱ期 59 例，Ⅲ～Ⅳ期 36 例。所有標本都經 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，3 μm 厚連續切片，標本分別做免疫組織化學和原位雜交檢測。
1.2 主要試劑
EphA2 兔/羊抗人多克隆抗體購于 Abcam 公司；EphrinA1 兔抗人多克隆抗體購于 Invitrogen 公司；免疫組織化學試劑盒（SP9710）購于福州邁新生物技術有限公司；地高辛標記 EphA2 和 EphrinA1 cRNA 探針購于長沙愛科博生物技術有限公司；通用型原位雜交檢測試劑盒Ⅲ（堿性磷酸酶）購于武漢博士德生物技術有限公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫組織化學 SP 法檢測 脫蠟、水化；PBS 洗 2～3 次各 5 min；將組織玻片在 3% H2O2（80% 甲醇）溶液中室溫靜置 10 min，PBS 洗 2～3 次各 5 min；抗原修復；PBS 洗 2～3 次各 5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫 20 min，甩去余液體；滴加Ⅰ抗 50 μL，室溫靜置 1 h 或 4 ℃ 過夜或 37 ℃ 1 h；4 ℃ 過夜后需在 37 ℃ 復溫 45 min；PBS 洗 3 次，每次 2 min；滴加Ⅱ抗 45～50 μL，室溫靜置或 37 ℃ 1 h； PBS 洗 3 次，每次 5 min；DAB 顯色 5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS 或自來水沖洗 10 min；蘇木精復染 2 min，鹽酸乙醇分化；脫水、透明、封片、鏡檢。用 PBS 液代替一抗作為陰性對照，已知陽性片作為陽性對照。
1.3.2 原位雜交檢測 石蠟切片經常規脫蠟至水；3% H2O2 室溫處理 10 min。雙蒸水洗滌 2 次；暴露 mRNA 核酸片段，滴加 3% 檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶 40 μL，37 ℃ 消化 15 min；0.5 mol/L TBS（三乙醇胺緩沖鹽水溶液）洗 3 次×5 min，蒸餾水洗1 次；預雜交：按每張切片 40 μL 加預雜交液。恒溫箱 37～40 ℃ 2～4 h。吸取多余液體，不洗；雜交：用地高辛標記探針，濃度一般為 0.5～2 μg/mL。按每張切片加 40 μL 雜交液。將雜交液專用蓋玻片蓋在玻片上，放于 56 ℃ 烤箱中 90 min，然后于恒溫箱 37 ℃ 雜交過夜；雜交后洗滌：去除蓋玻片，30～37 ℃ 左右水溫 2×檸檬酸鈉緩沖液（SSC）洗滌 5 min×2 次；0.5×SSC 洗滌 15 min 1 次；0.2×SSC 洗滌 15 min×2 次；滴加封閉液：37 ℃ 20 min。甩掉多余液體，不洗；滴加堿性磷酸酶標記小鼠抗地高辛：用 0.5 mol/L TBS 按 1∶200 稀釋，每張切片加 40 μL，37 ℃ 60 min。0.5 mol/L TBS 洗（5～10 min）×4次，切忌勿用其他緩沖液和蒸餾水洗滌；BCIP/NBT 顯色：20×BCIP 按 1∶20 的比例用 0.01 mol/L TBS 稀釋，混勻，每張切片 50 μL，一般 30～37 ℃ 顯色 30～60 min 或室溫放到顯色滿意為止。充分水洗；必要時核固紅復染 10～15 s；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。
1.4 結果判定
每張切片隨機選擇 5～6 個高倍視野，計數 500 個以上細胞，在高倍鏡下觀察全片，按陽性細胞所占總體細胞的百分比及其著色程度進行結果判定[3]。① 在免疫組織化學染色中，EphA2 陽性評判標準為細胞膜及細胞質染成棕褐色細胞，凡 5 個高倍視野>20% 者為陽性，否則為陰性；EphrinA1 以細胞膜和細胞質共同染成棕褐色細胞，凡 5 個高倍視野>10% 者為陽性，否則為陰性[4]。② 在原位雜交中，EphA2 陽性評判標準為細胞膜及細胞質染成藍紫色細胞，凡 5 個高倍視野>20% 者為陽性，否則為陰性；EphrinA1 以細胞膜和細胞質共同染成藍色或紫藍色細胞，凡 5 個高倍視野>10% 者為陽性，否則為陰性[5]。結果由兩名高年資病理科醫生統一核準。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件對數據進行分析。數據采用χ2 檢驗或秩和檢驗，相關性分析采用 Spearman 分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EphA2 及其配體 EphrinA1 在不同乳腺病變組織中的表達
2.1.1 EphA2 及其配體 EphrinA1 蛋白在不同乳腺病變組織中的表達結果 免疫組織化學染色檢測 EphA2 及其配體 EphrinA1 蛋白表達結果見圖 1、2，其陽性表達于細胞漿和細胞膜，呈棕褐色。在乳腺浸潤性導管癌組織中，EphA2 蛋白表達陽性率明顯高于其在乳腺纖維瘤組織（χ2=91.000，P<0.001）和乳腺囊性增生組織（χ2=64.418，P<0.001）中的表達陽性率，EphrinA1 蛋白表達陽性率也明顯高于其在乳腺囊性增生組織（χ2=60.229，P<0.001）和乳腺纖維瘤組織（χ2=89.419，P<0.001）中的表達陽性率，見表 1。
圖1
EphA2 蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中表達的免疫組織化學染色結果（SP ×400） a：蛋白陽性表達；b：蛋白陰性表達
圖2
EphrinA1 蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中表達的免疫組織化學染色結果（SP ×400） a：蛋白陽性表達；b：蛋白陰性表達
表1
EphA2 和 EphrinA1 蛋白在乳腺纖維瘤、乳腺囊性增生和乳腺浸潤性導管癌組織中的表達結果
2.1.2 EphA2 及其配體 EphrinA1 mRNA 在不同乳腺病變組織中的表達結果 原位雜交檢測 EphA2 及其配體 EphrinA1 mRNA 表達結果見圖 3、4，其 mRNA 陽性表達于細胞漿和細胞膜，呈紫色或紫藍色。在乳腺浸潤性導管癌組織中，EphA2 mRNA 表達陽性率明顯高于其在乳腺纖維瘤組織（χ2=42.774，P<0.001）和乳腺囊性增生組織（χ2=27.909，P<0.001）中的表達陽性率，EphrinA1 mRNA 表達陽性率也明顯高于其在乳腺囊性增生組織（χ2=20.973，P<0.001）和乳腺纖維瘤組織（χ2=34.478，P<0.001）中的表達陽性率，見表 2。
圖3
EphA2 mRNA在乳腺浸潤性導管癌組織中表達的原位雜交檢測結果（ ×400） a：mRNA 陽性表達；b：mRNA 陰性表達
圖4
EphrinA1 mRNA在乳腺浸潤性導管癌組織中表達的原位雜交檢測結果（ ×400） a：mRNA 陽性表達；b：mRNA 陰性表達
表2
EphA2 和 EphrinA1 mRNA 在乳腺纖維瘤、乳腺囊性增生和乳腺浸潤性導管癌組織中的表達結果
2.2 EphA2 及其配體 EphrinA1 的表達與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理特征的關系
EphA2 和 EphrinA1 蛋白和 mRNA 的表達均與乳腺浸潤性導管癌患者的年齡和腫瘤直徑無關（P>0.05），而與淋巴結轉移、組織學分級和 TNM 分期有關（P<0.05），即在有淋巴結轉移、組織學分級較高及TNM 分期較晚的乳腺浸潤性導管癌患者中 EphA2 和 EphrinA1 蛋白和 mRNA 表達陽性率均較高。見表 3、4。
表3
EphA2 和 EphrinA1 蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系（例）
表4
EphA2 和 EphrinA1 mRNA 在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系（例）
2.3 乳腺浸潤性導管癌中 EphA2 和 EphrinA1 表達的關系
經 Spearman 相關性分析結果顯示，在乳腺浸潤性導管癌組織中 EphA2 與 EphrinA1 蛋白表達陽性率呈正相關性（rs =0.999，P<0.01），EphA2 與 EphrinA1 mRNA 表達陽性率也呈正相關（rs =0.942，P<0.01），見表 5、6。
表5
乳腺浸潤性導管癌癌組織中 EphA2 和 EphrinA1 蛋白表達的相關性分析結果
表6
乳腺浸潤性導管癌癌組織中 EphA2 和 EphrinA1 mRNA 表達的相關性分析結果
3 討論
乳腺浸潤性導管癌是乳腺癌主要的病理類型，它的發生受多種因素的影響，與無孕激素拮抗的雌激素長期刺激緊密相關，但是其確切的發生機制目前并不是很明確，其發展的重要特征仍是腫瘤血管生成與肌層細胞浸潤[6]。因此，針對血管生成的相關基因和蛋白的研究，可能為乳腺浸潤性導管癌侵襲、轉移的早期診斷和靶向治療提供依據。
受體酪氨酸激酶是信息刺激細胞傳遞到細胞核進而組成能夠產生細胞效應轉導通路中的關鍵分子，它在細胞的分化、胚胎發育、增殖和細胞內信號轉導中起重要作用[7]。
EphA2 是 16 個受體酪氨酸激酶亞家族成員中第 2 個被發現的基因[8-10]。人類 EphA2 在染色體中定位于 lp36.1，含 17 個外顯子，編碼 1 個含 976 個氨基酸殘基的多肽，為膜結合Ⅰ型糖蛋白，包括 1 個胞內酶結構域、1 個跨膜結構域和 1 個氨基末端胞外配體結合域，其中胞內區中還包含具有酪氨酸激酶活性的結構域。
EphrinA1 是 Eph 受體亞家族中的第一配體，是人臍靜脈內皮細胞從腫瘤壞死因子-α 誘導中被克隆出來的，相對分子質量為 28×103[11]。
EphA2 受體與 8 種中任何一種細胞膜上的配體（Ephrins）特異性結合，特別是 EphrinA1，其產生的信號轉導能直接參與各種生理活動，包括血管形成、神經系統的發育、參與腫瘤的侵襲和轉移以及細胞與細胞之間的黏附狀態的調節[12]。
近年來，EphA2 及 EphrinA1 在腫瘤中的表達越來越受到人們的重視，已成為研究腫瘤發生、發展及其耐藥機制的研究熱點之一[13]。
本研究中發現，EphA2 及 EphrinA1 蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達陽性率分別為 91.0% 和 89.0%，其 mRNA 表達陽性率分別為 68.0% 和 61.0%，結果提示，似乎在乳腺癌中最具特征性的 Eph 受體是 EphA2。有研究[14]表明，EphA2 過度表達可使正常乳腺上皮細胞（MCF-10A）向惡性轉化且具有致瘤潛能。EphA2 和 EphrinA1 在許多腫瘤組織中都有過度表達的現象，這種高表達看似惡性腫瘤進程中的一個普通現象，尤其在高侵襲性的腫瘤細胞或腫瘤組織中高表達，包括食管癌、前列腺癌、結腸癌、侵襲性黑色素瘤[15]和非小細胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌[16]等。Choik 等[17]推測，EphA2 在腫瘤中過度表達，其主要原因是 EphA2 磷酸化的降低甚至缺失。韓麗萍等[18]研究發現，EphA2 和 EphrinA1 自身微環境的改變是造成其在乳腺癌組織中高表達的主要原因之一。Kaenel 等[19]報道，EphA2 及 EphrinAl 在惡性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、血管內皮系統及胃癌組織中均有普遍表達，配體和受體的結合可以激發下游信號，進而促進腫瘤血管的形成。
有進一步研究發現，EphA2 及 EphrinA1 共同表達于許多惡性腫瘤中的血管內皮細胞中[20]，其結合協助腫瘤血管內皮的遷移、基質或細胞黏附、細胞骨架而促進內皮細胞和組織形成毛細血管樣結構[21]。而惡性腫瘤的增殖依賴血液供應，故血管的生成是腫瘤的侵襲、轉移和生長的必要性，若遏制 EphA2 的活化可削弱腫瘤的血管形成，進而對抑制腫瘤的侵襲、轉移和生長有重要意義。EphA2 和 EphrinA1 在許多惡性腫瘤組織和腫瘤相關血管內皮細胞中共同表達，其結合調節細胞的黏附能力、運動能力，細胞的形態、分化能力、增殖及協助傳導下游信號[22]。
本研究結果表明，EphA2 及配體 EphrinA1 的蛋白表達染色定位大致在相同的腫瘤區域及腫瘤的血管內皮細胞內，EphA2 和 EphrinA1 mRNA 陽性表達也呈現類似特征，表明兩者在乳腺癌組織中的分布基本一致，這與統計學分析中，EphA2 和 EphrinA1 的蛋白表達陽性率之間及 EphA2 和 EphrinA1 的 mRNA 表達陽性率之間呈正相關不謀而合，結果提示，EphA2 及 EphrinA1 在乳腺癌細胞共同協調信號的傳導，可能通過自分泌或旁分泌方式傳導有絲分裂信號、活化 Eph 酪氨酸激酶，進而促進腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤血管生成。
不同的惡性組織或即使在同一惡性組織中，EphA2 及 EphrinA1 的表達與其各臨床病理因素的研究結果也不盡相同[23]。本研究結果顯示，EphA2 受體及其配體 EphrinA1 蛋白和 mRNA 在乳腺浸潤性導管癌中的表達陽性率與患者的年齡和腫瘤直徑無關（P>0.05），而與淋巴結轉移、組織學分級和臨床TNM分期有關（P<0.05），組織學分級較高、有淋巴結轉移和臨床TNM分期較晚的患者，其 EphA2 和 EphrinA1 蛋白及 mRNA 表達陽性率明顯高于組織學分級較低、無淋巴結轉移和臨床TNM分期較早的患者。其他研究者中也有相似的結果，如 Huang 等[24]發現，EphA2 在胃癌組織中表達水平升高，與其轉移呈正相關；Miyazaki 等[25]發現，EphA2 和 EphrinA1 在胃癌組織中的表達水平升高與胃癌的進展有關，包括淋巴結轉移、浸潤深度、病理分期和復發。關于 EphA2 和 EphrinA1 在乳腺癌中與臨床病理因素的關系說明，檢查 EphA2 及其配體 EphrinA1 的表達水平可以作為預測腫瘤惡性程度、預后指標及生存質量的一種指標，有望成為乳腺浸潤性導管癌基因治療的一個新靶點。
綜上所述，EphA2 和 EphrinA1 的表達可能與乳腺浸潤性導管癌的發生、發展有關，對其聯合檢測可能對乳腺浸潤性導管癌的生物學特征和預后判斷具有一定的指導性意義，可能為乳腺浸潤性導管癌今后的臨床用藥、預測預后和靶向治療提供新的靶點。但是由于本研究的數據、地區等各方面的原因，不能確切地證實這些指標作為乳腺癌預后和用藥的指標的價值，還需要大量樣本進一步考證。
乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年增高，且呈明顯年輕化趨勢，已嚴重威脅婦女身心健康。尋找指導乳腺癌治療和判斷預后的腫瘤分子標志物已成為目前研究的方向。促紅細胞生成素肝細胞（erythropoietin-producing hepato-cellular，Eph） A2受體在多種腫瘤組織中表達，它能夠促進血管內皮細胞的運動，即控制集合和解聚并控制肌動蛋白細胞骨架收縮、細胞粘連[1]。EphA2 與其配體 EphrinA1 結合，可促進內皮細胞和組織形成毛細血管樣結構，在侵襲、轉移及促進腫瘤新生血管的形成中發揮重要作用[2]。本研究通過檢測乳腺浸潤性導管癌組織中 EphA2 及其配體 EphrinA1 的表達，探討其表達在乳腺浸潤性導管癌中發生、發展、預后判斷等方面的意義，希望為其預后判斷、臨床用藥和靶向治療提供新的思路。
1 資料與方法
1.1 病例資料
收集大理大學附屬醫院病理科 2013 年 4 月至 2015 年 4 月期間的乳腺組織標本 160 例，其中乳腺纖維瘤 30 例，乳腺囊性增生 30 例，浸潤性導管癌 100 例。術前均未經放療、化療或其他特殊治療的各民族婦女的乳腺手術切除標本（新鮮組織及石蠟標本）及患者的臨床病理信息。乳腺浸潤性導管癌患者均為女性，年齡 30～75 歲，平均年齡 55.5 歲，中位年齡 57 歲，其中≤45 歲者 36 例，>45 歲者 64 例。腫瘤直徑≤2 cm 者 36 例，>2 cm 者 64 例。有淋巴結轉移者 57 例，無淋巴結轉移者 43 例。組織學分級：Ⅰ級 3 例，Ⅱ級 54 例，Ⅲ級 43 例。TNM 分期：0～Ⅰ期 5 例，Ⅱ期 59 例，Ⅲ～Ⅳ期 36 例。所有標本都經 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，3 μm 厚連續切片，標本分別做免疫組織化學和原位雜交檢測。
1.2 主要試劑
EphA2 兔/羊抗人多克隆抗體購于 Abcam 公司；EphrinA1 兔抗人多克隆抗體購于 Invitrogen 公司；免疫組織化學試劑盒（SP9710）購于福州邁新生物技術有限公司；地高辛標記 EphA2 和 EphrinA1 cRNA 探針購于長沙愛科博生物技術有限公司；通用型原位雜交檢測試劑盒Ⅲ（堿性磷酸酶）購于武漢博士德生物技術有限公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫組織化學 SP 法檢測 脫蠟、水化；PBS 洗 2～3 次各 5 min；將組織玻片在 3% H2O2（80% 甲醇）溶液中室溫靜置 10 min，PBS 洗 2～3 次各 5 min；抗原修復；PBS 洗 2～3 次各 5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫 20 min，甩去余液體；滴加Ⅰ抗 50 μL，室溫靜置 1 h 或 4 ℃ 過夜或 37 ℃ 1 h；4 ℃ 過夜后需在 37 ℃ 復溫 45 min；PBS 洗 3 次，每次 2 min；滴加Ⅱ抗 45～50 μL，室溫靜置或 37 ℃ 1 h； PBS 洗 3 次，每次 5 min；DAB 顯色 5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS 或自來水沖洗 10 min；蘇木精復染 2 min，鹽酸乙醇分化；脫水、透明、封片、鏡檢。用 PBS 液代替一抗作為陰性對照，已知陽性片作為陽性對照。
1.3.2 原位雜交檢測 石蠟切片經常規脫蠟至水；3% H2O2 室溫處理 10 min。雙蒸水洗滌 2 次；暴露 mRNA 核酸片段，滴加 3% 檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶 40 μL，37 ℃ 消化 15 min；0.5 mol/L TBS（三乙醇胺緩沖鹽水溶液）洗 3 次×5 min，蒸餾水洗1 次；預雜交：按每張切片 40 μL 加預雜交液。恒溫箱 37～40 ℃ 2～4 h。吸取多余液體，不洗；雜交：用地高辛標記探針，濃度一般為 0.5～2 μg/mL。按每張切片加 40 μL 雜交液。將雜交液專用蓋玻片蓋在玻片上，放于 56 ℃ 烤箱中 90 min，然后于恒溫箱 37 ℃ 雜交過夜；雜交后洗滌：去除蓋玻片，30～37 ℃ 左右水溫 2×檸檬酸鈉緩沖液（SSC）洗滌 5 min×2 次；0.5×SSC 洗滌 15 min 1 次；0.2×SSC 洗滌 15 min×2 次；滴加封閉液：37 ℃ 20 min。甩掉多余液體，不洗；滴加堿性磷酸酶標記小鼠抗地高辛：用 0.5 mol/L TBS 按 1∶200 稀釋，每張切片加 40 μL，37 ℃ 60 min。0.5 mol/L TBS 洗（5～10 min）×4次，切忌勿用其他緩沖液和蒸餾水洗滌；BCIP/NBT 顯色：20×BCIP 按 1∶20 的比例用 0.01 mol/L TBS 稀釋，混勻，每張切片 50 μL，一般 30～37 ℃ 顯色 30～60 min 或室溫放到顯色滿意為止。充分水洗；必要時核固紅復染 10～15 s；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。
1.4 結果判定
每張切片隨機選擇 5～6 個高倍視野，計數 500 個以上細胞，在高倍鏡下觀察全片，按陽性細胞所占總體細胞的百分比及其著色程度進行結果判定[3]。① 在免疫組織化學染色中，EphA2 陽性評判標準為細胞膜及細胞質染成棕褐色細胞，凡 5 個高倍視野>20% 者為陽性，否則為陰性；EphrinA1 以細胞膜和細胞質共同染成棕褐色細胞，凡 5 個高倍視野>10% 者為陽性，否則為陰性[4]。② 在原位雜交中，EphA2 陽性評判標準為細胞膜及細胞質染成藍紫色細胞，凡 5 個高倍視野>20% 者為陽性，否則為陰性；EphrinA1 以細胞膜和細胞質共同染成藍色或紫藍色細胞，凡 5 個高倍視野>10% 者為陽性，否則為陰性[5]。結果由兩名高年資病理科醫生統一核準。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件對數據進行分析。數據采用χ2 檢驗或秩和檢驗，相關性分析采用 Spearman 分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EphA2 及其配體 EphrinA1 在不同乳腺病變組織中的表達
2.1.1 EphA2 及其配體 EphrinA1 蛋白在不同乳腺病變組織中的表達結果 免疫組織化學染色檢測 EphA2 及其配體 EphrinA1 蛋白表達結果見圖 1、2，其陽性表達于細胞漿和細胞膜，呈棕褐色。在乳腺浸潤性導管癌組織中，EphA2 蛋白表達陽性率明顯高于其在乳腺纖維瘤組織（χ2=91.000，P<0.001）和乳腺囊性增生組織（χ2=64.418，P<0.001）中的表達陽性率，EphrinA1 蛋白表達陽性率也明顯高于其在乳腺囊性增生組織（χ2=60.229，P<0.001）和乳腺纖維瘤組織（χ2=89.419，P<0.001）中的表達陽性率，見表 1。
圖1
EphA2 蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中表達的免疫組織化學染色結果（SP ×400） a：蛋白陽性表達；b：蛋白陰性表達
圖2
EphrinA1 蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中表達的免疫組織化學染色結果（SP ×400） a：蛋白陽性表達；b：蛋白陰性表達
表1
EphA2 和 EphrinA1 蛋白在乳腺纖維瘤、乳腺囊性增生和乳腺浸潤性導管癌組織中的表達結果
2.1.2 EphA2 及其配體 EphrinA1 mRNA 在不同乳腺病變組織中的表達結果 原位雜交檢測 EphA2 及其配體 EphrinA1 mRNA 表達結果見圖 3、4，其 mRNA 陽性表達于細胞漿和細胞膜，呈紫色或紫藍色。在乳腺浸潤性導管癌組織中，EphA2 mRNA 表達陽性率明顯高于其在乳腺纖維瘤組織（χ2=42.774，P<0.001）和乳腺囊性增生組織（χ2=27.909，P<0.001）中的表達陽性率，EphrinA1 mRNA 表達陽性率也明顯高于其在乳腺囊性增生組織（χ2=20.973，P<0.001）和乳腺纖維瘤組織（χ2=34.478，P<0.001）中的表達陽性率，見表 2。
圖3
EphA2 mRNA在乳腺浸潤性導管癌組織中表達的原位雜交檢測結果（ ×400） a：mRNA 陽性表達；b：mRNA 陰性表達
圖4
EphrinA1 mRNA在乳腺浸潤性導管癌組織中表達的原位雜交檢測結果（ ×400） a：mRNA 陽性表達；b：mRNA 陰性表達
表2
EphA2 和 EphrinA1 mRNA 在乳腺纖維瘤、乳腺囊性增生和乳腺浸潤性導管癌組織中的表達結果
2.2 EphA2 及其配體 EphrinA1 的表達與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理特征的關系
EphA2 和 EphrinA1 蛋白和 mRNA 的表達均與乳腺浸潤性導管癌患者的年齡和腫瘤直徑無關（P>0.05），而與淋巴結轉移、組織學分級和 TNM 分期有關（P<0.05），即在有淋巴結轉移、組織學分級較高及TNM 分期較晚的乳腺浸潤性導管癌患者中 EphA2 和 EphrinA1 蛋白和 mRNA 表達陽性率均較高。見表 3、4。
表3
EphA2 和 EphrinA1 蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系（例）
表4
EphA2 和 EphrinA1 mRNA 在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達與其臨床病理特征的關系（例）
2.3 乳腺浸潤性導管癌中 EphA2 和 EphrinA1 表達的關系
經 Spearman 相關性分析結果顯示，在乳腺浸潤性導管癌組織中 EphA2 與 EphrinA1 蛋白表達陽性率呈正相關性（rs =0.999，P<0.01），EphA2 與 EphrinA1 mRNA 表達陽性率也呈正相關（rs =0.942，P<0.01），見表 5、6。
表5
乳腺浸潤性導管癌癌組織中 EphA2 和 EphrinA1 蛋白表達的相關性分析結果
表6
乳腺浸潤性導管癌癌組織中 EphA2 和 EphrinA1 mRNA 表達的相關性分析結果
3 討論
乳腺浸潤性導管癌是乳腺癌主要的病理類型，它的發生受多種因素的影響，與無孕激素拮抗的雌激素長期刺激緊密相關，但是其確切的發生機制目前并不是很明確，其發展的重要特征仍是腫瘤血管生成與肌層細胞浸潤[6]。因此，針對血管生成的相關基因和蛋白的研究，可能為乳腺浸潤性導管癌侵襲、轉移的早期診斷和靶向治療提供依據。
受體酪氨酸激酶是信息刺激細胞傳遞到細胞核進而組成能夠產生細胞效應轉導通路中的關鍵分子，它在細胞的分化、胚胎發育、增殖和細胞內信號轉導中起重要作用[7]。
EphA2 是 16 個受體酪氨酸激酶亞家族成員中第 2 個被發現的基因[8-10]。人類 EphA2 在染色體中定位于 lp36.1，含 17 個外顯子，編碼 1 個含 976 個氨基酸殘基的多肽，為膜結合Ⅰ型糖蛋白，包括 1 個胞內酶結構域、1 個跨膜結構域和 1 個氨基末端胞外配體結合域，其中胞內區中還包含具有酪氨酸激酶活性的結構域。
EphrinA1 是 Eph 受體亞家族中的第一配體，是人臍靜脈內皮細胞從腫瘤壞死因子-α 誘導中被克隆出來的，相對分子質量為 28×103[11]。
EphA2 受體與 8 種中任何一種細胞膜上的配體（Ephrins）特異性結合，特別是 EphrinA1，其產生的信號轉導能直接參與各種生理活動，包括血管形成、神經系統的發育、參與腫瘤的侵襲和轉移以及細胞與細胞之間的黏附狀態的調節[12]。
近年來，EphA2 及 EphrinA1 在腫瘤中的表達越來越受到人們的重視，已成為研究腫瘤發生、發展及其耐藥機制的研究熱點之一[13]。
本研究中發現，EphA2 及 EphrinA1 蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達陽性率分別為 91.0% 和 89.0%，其 mRNA 表達陽性率分別為 68.0% 和 61.0%，結果提示，似乎在乳腺癌中最具特征性的 Eph 受體是 EphA2。有研究[14]表明，EphA2 過度表達可使正常乳腺上皮細胞（MCF-10A）向惡性轉化且具有致瘤潛能。EphA2 和 EphrinA1 在許多腫瘤組織中都有過度表達的現象，這種高表達看似惡性腫瘤進程中的一個普通現象，尤其在高侵襲性的腫瘤細胞或腫瘤組織中高表達，包括食管癌、前列腺癌、結腸癌、侵襲性黑色素瘤[15]和非小細胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌[16]等。Choik 等[17]推測，EphA2 在腫瘤中過度表達，其主要原因是 EphA2 磷酸化的降低甚至缺失。韓麗萍等[18]研究發現，EphA2 和 EphrinA1 自身微環境的改變是造成其在乳腺癌組織中高表達的主要原因之一。Kaenel 等[19]報道，EphA2 及 EphrinAl 在惡性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、血管內皮系統及胃癌組織中均有普遍表達，配體和受體的結合可以激發下游信號，進而促進腫瘤血管的形成。
有進一步研究發現，EphA2 及 EphrinA1 共同表達于許多惡性腫瘤中的血管內皮細胞中[20]，其結合協助腫瘤血管內皮的遷移、基質或細胞黏附、細胞骨架而促進內皮細胞和組織形成毛細血管樣結構[21]。而惡性腫瘤的增殖依賴血液供應，故血管的生成是腫瘤的侵襲、轉移和生長的必要性，若遏制 EphA2 的活化可削弱腫瘤的血管形成，進而對抑制腫瘤的侵襲、轉移和生長有重要意義。EphA2 和 EphrinA1 在許多惡性腫瘤組織和腫瘤相關血管內皮細胞中共同表達，其結合調節細胞的黏附能力、運動能力，細胞的形態、分化能力、增殖及協助傳導下游信號[22]。
本研究結果表明，EphA2 及配體 EphrinA1 的蛋白表達染色定位大致在相同的腫瘤區域及腫瘤的血管內皮細胞內，EphA2 和 EphrinA1 mRNA 陽性表達也呈現類似特征，表明兩者在乳腺癌組織中的分布基本一致，這與統計學分析中，EphA2 和 EphrinA1 的蛋白表達陽性率之間及 EphA2 和 EphrinA1 的 mRNA 表達陽性率之間呈正相關不謀而合，結果提示，EphA2 及 EphrinA1 在乳腺癌細胞共同協調信號的傳導，可能通過自分泌或旁分泌方式傳導有絲分裂信號、活化 Eph 酪氨酸激酶，進而促進腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤血管生成。
不同的惡性組織或即使在同一惡性組織中，EphA2 及 EphrinA1 的表達與其各臨床病理因素的研究結果也不盡相同[23]。本研究結果顯示，EphA2 受體及其配體 EphrinA1 蛋白和 mRNA 在乳腺浸潤性導管癌中的表達陽性率與患者的年齡和腫瘤直徑無關（P>0.05），而與淋巴結轉移、組織學分級和臨床TNM分期有關（P<0.05），組織學分級較高、有淋巴結轉移和臨床TNM分期較晚的患者，其 EphA2 和 EphrinA1 蛋白及 mRNA 表達陽性率明顯高于組織學分級較低、無淋巴結轉移和臨床TNM分期較早的患者。其他研究者中也有相似的結果，如 Huang 等[24]發現，EphA2 在胃癌組織中表達水平升高，與其轉移呈正相關；Miyazaki 等[25]發現，EphA2 和 EphrinA1 在胃癌組織中的表達水平升高與胃癌的進展有關，包括淋巴結轉移、浸潤深度、病理分期和復發。關于 EphA2 和 EphrinA1 在乳腺癌中與臨床病理因素的關系說明，檢查 EphA2 及其配體 EphrinA1 的表達水平可以作為預測腫瘤惡性程度、預后指標及生存質量的一種指標，有望成為乳腺浸潤性導管癌基因治療的一個新靶點。
綜上所述，EphA2 和 EphrinA1 的表達可能與乳腺浸潤性導管癌的發生、發展有關，對其聯合檢測可能對乳腺浸潤性導管癌的生物學特征和預后判斷具有一定的指導性意義，可能為乳腺浸潤性導管癌今后的臨床用藥、預測預后和靶向治療提供新的靶點。但是由于本研究的數據、地區等各方面的原因，不能確切地證實這些指標作為乳腺癌預后和用藥的指標的價值，還需要大量樣本進一步考證。
