引用本文： 鄭鵬, 馮濤, 趙鑫, 考曉明, 嵇武. 阻塞性黃疸患者結腸菌群失衡的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(10): 1209-1213. doi: 10.7507/1007-9424.20150313 復制
人體消化道內微生物是一個極其復雜的微生物群落，所含細菌數量及種類繁多，每種細菌特性也不相同。當阻塞性黃疸發生時，肝腸循環被打斷，進入消化道的膽汁酸鹽減少，對腸道微生物的抑制作用減弱，腸道微生物的過度繁殖和消化道黏膜屏障的損害以及腸道對微生物產物的抵抗敏感性下降，最終細菌易位發生[1]。文獻[2]指出，黃疸程度越重越易發生應激性黏膜病變。相關動物實驗[3]也表明，膽總管結扎大鼠腸道菌群多樣性及結構發生了改變。
本研究使用微生態領域經典的分析群落結構的實驗方法即變性梯度凝膠電泳（denaturing grad-ient gel electrophoresis，DGGE）來觀察阻塞性黃疸患者結腸菌群結構的變化，以探討其結腸菌群的變化規律。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取筆者所在醫院2013年2月至2014年8月期間連續性20例阻塞性黃疸患者及同期10例健康體檢人員作為研究對象。留取阻塞性黃疸患者入院后晨起第1次糞便，標本置于-80℃冰箱保存。正常對照組處理方法同上。
1.2 主要試劑、材料、設備
1.2.1 試劑
糞便DNA抽提試劑盒（QIAGEN Hilden，德國），PCR試劑（南京百思凱科技有限公司）：5μL 10×PCR緩沖液、上游及下游引物、1μL脫氧核糖核苷三磷酸混合液（dNTP mixture, 各濃度均為2.5 mmol/L）、0.5μL反式Taq TDNA聚合酶（5 U/μL），瓊脂糖（BIOWEST西班牙），溴化乙錠溶液（Amresco，美國），TAE電泳緩沖液（Amresco，美國），DL2000 DNA Marker及6×上樣緩沖液（寶生物工程有限公司），過硫酸銨（APS）〔10%（W/V），Amresco美國〕，四甲基二乙胺（TEMED，Sigma美國），SYBR GreenΙ（Invitrogen，美國）。
1.2.2 主要設備與耗材
滅菌EP管（Eppendorf，德國），臺式離心機（Biofuge frescoHeraeus，德國），恒溫水浴鍋（杭州匯爾儀器設備有限公司），紫外分光光度計（DU 800 Beckman，德國），PCR儀（2720 ThermalCyclerApplied Biosystems，美國），紫外照相儀（Chemi-Doc XRS CameraBio-Rad，美國），變形梯度凝膠電泳儀（DCode Universal Mutation Detection System, Bio-Rad，美國），測序儀（3730 DNA Analyzer, Applied Bios-ystems，美國）。
1.3 方法
1.3.1 提取腸道細菌總DNA
使用糞便DNA抽提試劑盒并按其操作說明提取健康對照組及阻塞性黃疸患者糞便中的總微生物DNA，-20℃凍存。
1.3.2 聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）分析
為擴增細菌的16S rRNA gene的V3可變區設計上下引物，上游引物（GC357f，5'-GCCCGG-GGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG-GGATTACCGCGGCTGCTGG-3'）和下游引物（518r，5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）。添加富含GC的夾子（富含GC的片段）是為了防止DNA雙鏈在凝膠中發生完全解鏈。50μL PCR反應體系：1μL DNA模板，5μL 10×PCR緩沖液，1μL dNTP mixture（各濃度均為2.5 mmol/L），上、下游引物各1μL（10 pmol/L），0.5μL Taq聚合酶（Taq-Polymerase，5 U/μL），40.5μL滅菌水。使用PCR儀進行PCR擴增（聚合酶鏈式反應）。94℃初始變性5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s（每個循環降低0.5℃），68℃延伸30 s，共20個循環。再加10個如下循環：94℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s, 最后68℃延伸7 min。每次進行PCR擴增，其中有1管不加入任何DNA模板，只加入1μL無菌水做陰性對照。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳〔1.5 g瓊脂糖，100 mL 1×TAE溶液（加入10μL溴化乙錠溶液）〕。在1×TAE溶液里，電壓設置110 V，電泳15 min，并用Bio-Rad紫外照相儀記錄結果。40%聚丙烯酰胺溶液〔丙烯酰胺/雙丙烯酰胺為37.5/1（W/V）〕。變性梯度凝膠母液（8%），變性梯度為35%～52.5%（100%變性劑為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺），PCR產物的上樣量為10μL（樣品：50μL糞便DNA擴增后產物+20μL 6×上樣緩沖液混勻）。使用變形梯度凝膠電泳儀在1×TAE緩沖液內200 V電泳10 min，再120 V電泳7.5 h，水浴恒溫60℃。電泳結束后，凝膠在SYBR GreenΙ核酸染料中染色。（1×TAE 1 : 100稀釋）染色30 min，1×TAE洗1遍以后，在紫外照相機（BIO-R AD）下拍照。
1.4 數據分析
使用Adobe Photoshop CS5，根據每張凝膠圖片兩端的Marker泳道來拼接3張凝膠照片為1張圖片，再用Quantity One software（version 4.6）打開并分析該圖片。自動識別圖片上的每一條泳道，以及泳道上的每一個條帶，選擇配對容許度為0.5%。然后再手動識別使其中條帶選擇更加合理。細菌的數量對應此條帶的亮暗強度占所在泳道所有條帶強度總和的百分比。每個樣品中的每個條帶的條帶相對強度構成1個二維矩陣。Quantity One（version 4.6）使用上述矩陣，運用Dice Coefficient計算樣品的相似性。使用非加權配對算術平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）進行聚類分析構建聚類簇。用ImageJ軟件對DGGE膠圖進行采點計算，然后使用Canoco（version 4.5）軟件做主成分分析。香農多樣性指數（Shannon's diversity index）H=-∑（Pi）（lnPi）其中H：樣品的多樣性指數，Pi=樣品中第i種細菌的數量占總細菌數量的比例，如樣品中細菌總個數為N，第i種細菌個數為ni，Pi=ni/N。
1.5 統計學方法
分析使用SPSS（version 19.0）軟件。每組的菌種數、均勻性和多樣性的數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 DGGE指紋圖譜
在DGGE圖譜中，每一個垂直的泳道表示單個樣品的總的菌群結構，而每一個泳道里的每一個條帶都代表了一種結構細菌，條帶的亮暗強度表示該細菌的總的菌量。在同一水平方向的不同樣本的條我們認為是同一種類細菌。如圖 1所示，圖中1～10為正常對照組，11～20為輕度阻塞性黃疸組，21～30為中度阻塞性黃疸組，A1代表 1例患者的結腸菌群結構，D3、E3各代表 1種細菌，E3的強度明顯高于D3，說明E3對應的細菌數量明顯多于D3，D3與E3在同一水平，故認為D3與E3是同一種細菌。
圖1
示阻塞性黃疸患者和對照組健康人結腸菌群糞便標本的DGGE條帶。A1～A10：正常對照組；B1～B10：輕度阻塞性黃疸組；C1～C10：中度阻塞性黃疸組??圖 2??示阻塞性黃疸患者和正常對照組人群結腸菌群相似性分析結果。1～10：正常對照組；11～20：輕度阻塞性黃疸組；21～30：中度阻塞性黃疸組；上方標尺表示DGGE條帶間的相似性
2.2 相似性分析結果
運用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行數字化處理，對菌群結構運用Dice coefficient計算其相似性和UPGMA構建聚類樹，進行相似性分析，其結果見圖 2。如圖 2所示，其中標尺長度代表泳道相似程度，線段長度代表相鄰的樣品或者聚類簇內的樣品相似性。所有條帶分為3大組（C、E、F組），F組中有10個條帶，為正常對照組的條帶；E組有9個條帶，全部是輕度阻塞性黃疸組的條帶，由此可以看出，輕度阻塞性黃疸患者和健康人群的結腸菌群存在一定的相似性；C組有10個條帶，均為中度阻塞性黃疸組的條帶。
相似性分析顯示：全圖主要有3個聚類簇即C、E、F。最上端有1個單獨聚成的A簇，說明這個樣本的菌群與其他所有樣本均不一樣（A簇與B簇間相似性為37%）。B簇由C、D 2個主要的簇組成（C簇與D簇間相似性為41%），D簇由E、F 2個主要的簇組成，說明E、F 2個簇之間存在一定的相似性（E簇與F簇間相似性為51%）。
綜上，阻塞性黃疸患者結腸菌群輕度阻塞性黃疸組與正常對照組之間存在一定的相似性，而中度阻塞性黃疸組與正常對照組和輕度阻塞性黃疸組存在一定差異，隨著梗阻時間延長及程度的加重，結腸菌群存在明顯的改變，梗阻時間越長，部分條帶的顏色加深及數量的減少，即結腸菌群的多樣性、豐富度發生改變。
2.3 主成分分析結果
上述UPGMA聚類分析法能比較直觀地反映幾簇菌群結構的相似性，但也存在局限性，它僅僅能夠說明聚類圖上相鄰的菌群或者相近的聚類簇整體的相似性。對最終的實驗結果的詮釋存在一定誤差。因此，本研究又進行了主成分分析（PCA），30個彩色圖標對應30個實驗樣本的菌群結構，任意2個圖標之間的直線距離說明菌群間的差異程度，值越大，差異程度越大。這樣就可以反映所有樣本菌群間的相似程度。
如圖 3所示，PCA分析結果也同樣驗證了聚類分析的結果：正常對照組1～9，這幾個圖標相對集中；輕度阻塞性黃疸組10～20，這幾個圖標距離這個區域較近；中度阻塞性黃疸組21～30，這幾個圖標距離這個區域較近，其他的條帶都遠離這個區域。與前面相似性分析的結果大致相同，說明輕度阻塞性黃疸組、中度阻塞性黃疸組與正常對照組之間均存在明顯差異。
圖3
示阻塞性黃疸患者與健康對照組人結腸菌群主成分分析結果。■：健康對照組；▲：輕度阻塞性黃疸組；2.4 多樣性分析結果
阻塞性黃疸可導致患者結腸菌群多樣性降低，正常對照組香濃指數（Shannon's diversity index）為3.34±0.23，輕度阻塞性黃疸患者組香濃指數為2.77±0.28，中度阻塞性黃疸組香濃指數為2.26±0.25，提示：輕、中度阻塞性黃疸患者結腸菌群多樣性明顯小于正常對照組（P < 0.01），這個趨勢和菌群數（species richness）的變化規律是一致的。
3 討論
消化液是重塑腸道菌群的主要因素，而膽汁酸作為膽汁的主要成分在調節腸道菌群結構中起到了的決定性的作用[4]，尤其是在高蛋白、高脂飲食中，這些發現為我們研究腸道菌群與疾病提供了一個新的視角，以了解部分代謝性疾病（包括肥胖）、炎癥性腸病、結腸直腸癌、慢性肝病等的病因與生態失調之間的關系[5]。膽汁酸不僅能夠乳化經胃腸道吸收的脂性物質促進脂質的消化和吸收，防止膽固醇結石的形成[6]，膽汁酸的另外一個重要特征是具有較強的抗菌活性，可以通過與微生物細胞膜上的磷脂成分作用破壞細胞膜的完整性，從而起到抑菌的作用[7]。雙歧桿菌與乳酸菌對膽汁酸相對敏感，然而大腸桿菌卻可以耐受高濃度的膽汁酸，所以膽汁酸的缺乏勢必會影響整個腸道微生物的結構變化，由此可見益生菌必須克服對人體腸道內膽汁酸的敏感性和抗性，才能補充人體優勢菌群，才能從真正意義上促進益生菌在日常乳品產業的生產及利用[8]。
膽汁能刺激腸道蠕動[9]，缺乏膽汁會引起腸道蠕動減弱，使食物停滯在腸道內，這樣就給腸道微生物營造了一個良好的時間與空間進行增殖，進而導致原有優勢菌群多樣性減少、細菌密度減少，就會出現另外一種菌群結構。另外膽紅素、膽汁酸鹽、經腸道吸收的內毒素等入血影響微循環及腸黏膜的通透性，進一步加重了腸道的負擔及肝功能的損害[10]。國外研究[11]報道，肥胖會影響腸道菌群的多樣性，肥胖者刻意的調節菌群結果可能有利于調節能量平衡。飲食干預可以部分抵消腸道致癌基因的敏感性[12]。膽汁酸與腸道微生物相互作用，調節機體的病理生理。國內文獻[13]報道，在部分肝臟疾病患者糞便中，膽汁酸含量及膽素原較健康人明顯減少, 溶血磷脂酰膽堿反而明顯增高, 進一步實驗研究發現膽汁酸下降水平與肝臟疾病程度呈一定線性關系，以肝癌病患中含量為最低, 降低最顯著, 肝硬變次之。肝臟與腸道作為人體兩大器官，在解剖結構和生理功能上存在著密切關聯[14]。腸道疾病和肝臟疾病共患的現象及其相互關聯的發病機理使我們對于腸道和肝臟之間的密切關系有了新的認識，而不應該僅僅只是關注靶器官本身的疾病防治[15]。關注腸道治療也可以使肝臟疾病的治療有所獲益；反過來關注肝臟疾病治療也可能使腸道疾病的治療獲得更多有益進展。消化道是人體和外界環境交換的直接場所，正常生理功能的腸黏膜上皮細胞及細胞間緊密連接、胃腸道消化系統及肝臟免疫防御系統和胃腸道微生物的組成在維持“腸-肝軸”的內環境穩態和平衡中起了舉足輕重的作用[16]，一些因素誘發的肝臟疾病（如肝炎、肝硬變、肝癌、肝內外膽管結石等）可以引起腸到黏膜屏障的破壞，促進腸道內微生物發生易位并誘發感染等，進一步加重肝臟損傷[17]。人體消化道內，微生物較集聚且爭奪資源激烈，很小的敏感差異都有可能破壞整個平衡[18]。
近年來，對不同程度的阻塞性黃疸患者進行分析發現，隨著血清膽紅素水平的增高，術后感染及出血等并發癥的發生率也有增高趨勢[19]。有學者[20]指出，術前膽道引流并不影響阻塞性黃疸患者術后死亡率，但阻塞性黃疸患者的腸源性感染及胃腸道出血率明顯高于無阻塞性黃疸者。
高膽紅素血癥、手術創傷、內毒素血癥、手術麻醉、術中大出血和輸血等是造成患者術后腸黏膜缺血再灌注損傷及腸黏膜功能紊亂的主要原因，但其系統變化規律還不清楚[21]。但是，高膽紅素水平仍然是導致阻塞性黃疸患者圍手術期感染的重要危險因素之一[22]，因此圍手術期通過檢測阻塞性黃疸患者腸道功能的變化，及時發現患者各種腸道菌群的異常并迅速補充膽汁酸鹽及優勢菌，改善其腸道功能是降低患者圍手術期感染的主要舉措[23]。
4 結論
本研究通過糞便樣本中特定菌群的分析，探討膽汁酸在重塑人腸道菌群中的重要性[24]。本研究運用PCR-DGGE對不同程度阻塞性黃疸患者和健康人群結腸菌群進行分析，評估了不同程度的阻塞性黃疸患者腸道菌群結構的紊亂特征，從相似性分析和主成分分析的結果可以看出：黃疸患者結腸菌群存在結構的紊亂及優勢菌群的改變，輕、中度黃疸患者與正常對照組有明顯差異，輕、中度阻塞性黃疸組患者結腸優勢菌群多樣性較正常對照組明顯降低, 說明正常與病理狀態下的腸道菌群結構有截然不同的特點及區分度。
膽汁酸實際上作為一個重要的決定因素重塑了腸道菌群[25]，尤其是在阻塞性黃疸發生時。本研究描述了輕、中度阻塞性黃疸患者結腸菌群結構的變化特征，黃疸患者優勢菌群結構的改變提示結腸菌群可能在黃疸患者圍手術期感染的發生發展中起到一定的作用。為黃疸在圍手術期感染的發生和發展中起到的作用提供了新的認識，并可能給阻塞性黃疸圍手術期感染的預防與治療提供新的方向。
人體消化道內微生物是一個極其復雜的微生物群落，所含細菌數量及種類繁多，每種細菌特性也不相同。當阻塞性黃疸發生時，肝腸循環被打斷，進入消化道的膽汁酸鹽減少，對腸道微生物的抑制作用減弱，腸道微生物的過度繁殖和消化道黏膜屏障的損害以及腸道對微生物產物的抵抗敏感性下降，最終細菌易位發生[1]。文獻[2]指出，黃疸程度越重越易發生應激性黏膜病變。相關動物實驗[3]也表明，膽總管結扎大鼠腸道菌群多樣性及結構發生了改變。
本研究使用微生態領域經典的分析群落結構的實驗方法即變性梯度凝膠電泳（denaturing grad-ient gel electrophoresis，DGGE）來觀察阻塞性黃疸患者結腸菌群結構的變化，以探討其結腸菌群的變化規律。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取筆者所在醫院2013年2月至2014年8月期間連續性20例阻塞性黃疸患者及同期10例健康體檢人員作為研究對象。留取阻塞性黃疸患者入院后晨起第1次糞便，標本置于-80℃冰箱保存。正常對照組處理方法同上。
1.2 主要試劑、材料、設備
1.2.1 試劑
糞便DNA抽提試劑盒（QIAGEN Hilden，德國），PCR試劑（南京百思凱科技有限公司）：5μL 10×PCR緩沖液、上游及下游引物、1μL脫氧核糖核苷三磷酸混合液（dNTP mixture, 各濃度均為2.5 mmol/L）、0.5μL反式Taq TDNA聚合酶（5 U/μL），瓊脂糖（BIOWEST西班牙），溴化乙錠溶液（Amresco，美國），TAE電泳緩沖液（Amresco，美國），DL2000 DNA Marker及6×上樣緩沖液（寶生物工程有限公司），過硫酸銨（APS）〔10%（W/V），Amresco美國〕，四甲基二乙胺（TEMED，Sigma美國），SYBR GreenΙ（Invitrogen，美國）。
1.2.2 主要設備與耗材
滅菌EP管（Eppendorf，德國），臺式離心機（Biofuge frescoHeraeus，德國），恒溫水浴鍋（杭州匯爾儀器設備有限公司），紫外分光光度計（DU 800 Beckman，德國），PCR儀（2720 ThermalCyclerApplied Biosystems，美國），紫外照相儀（Chemi-Doc XRS CameraBio-Rad，美國），變形梯度凝膠電泳儀（DCode Universal Mutation Detection System, Bio-Rad，美國），測序儀（3730 DNA Analyzer, Applied Bios-ystems，美國）。
1.3 方法
1.3.1 提取腸道細菌總DNA
使用糞便DNA抽提試劑盒并按其操作說明提取健康對照組及阻塞性黃疸患者糞便中的總微生物DNA，-20℃凍存。
1.3.2 聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）分析
為擴增細菌的16S rRNA gene的V3可變區設計上下引物，上游引物（GC357f，5'-GCCCGG-GGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG-GGATTACCGCGGCTGCTGG-3'）和下游引物（518r，5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）。添加富含GC的夾子（富含GC的片段）是為了防止DNA雙鏈在凝膠中發生完全解鏈。50μL PCR反應體系：1μL DNA模板，5μL 10×PCR緩沖液，1μL dNTP mixture（各濃度均為2.5 mmol/L），上、下游引物各1μL（10 pmol/L），0.5μL Taq聚合酶（Taq-Polymerase，5 U/μL），40.5μL滅菌水。使用PCR儀進行PCR擴增（聚合酶鏈式反應）。94℃初始變性5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s（每個循環降低0.5℃），68℃延伸30 s，共20個循環。再加10個如下循環：94℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s, 最后68℃延伸7 min。每次進行PCR擴增，其中有1管不加入任何DNA模板，只加入1μL無菌水做陰性對照。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳〔1.5 g瓊脂糖，100 mL 1×TAE溶液（加入10μL溴化乙錠溶液）〕。在1×TAE溶液里，電壓設置110 V，電泳15 min，并用Bio-Rad紫外照相儀記錄結果。40%聚丙烯酰胺溶液〔丙烯酰胺/雙丙烯酰胺為37.5/1（W/V）〕。變性梯度凝膠母液（8%），變性梯度為35%～52.5%（100%變性劑為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺），PCR產物的上樣量為10μL（樣品：50μL糞便DNA擴增后產物+20μL 6×上樣緩沖液混勻）。使用變形梯度凝膠電泳儀在1×TAE緩沖液內200 V電泳10 min，再120 V電泳7.5 h，水浴恒溫60℃。電泳結束后，凝膠在SYBR GreenΙ核酸染料中染色。（1×TAE 1 : 100稀釋）染色30 min，1×TAE洗1遍以后，在紫外照相機（BIO-R AD）下拍照。
1.4 數據分析
使用Adobe Photoshop CS5，根據每張凝膠圖片兩端的Marker泳道來拼接3張凝膠照片為1張圖片，再用Quantity One software（version 4.6）打開并分析該圖片。自動識別圖片上的每一條泳道，以及泳道上的每一個條帶，選擇配對容許度為0.5%。然后再手動識別使其中條帶選擇更加合理。細菌的數量對應此條帶的亮暗強度占所在泳道所有條帶強度總和的百分比。每個樣品中的每個條帶的條帶相對強度構成1個二維矩陣。Quantity One（version 4.6）使用上述矩陣，運用Dice Coefficient計算樣品的相似性。使用非加權配對算術平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）進行聚類分析構建聚類簇。用ImageJ軟件對DGGE膠圖進行采點計算，然后使用Canoco（version 4.5）軟件做主成分分析。香農多樣性指數（Shannon's diversity index）H=-∑（Pi）（lnPi）其中H：樣品的多樣性指數，Pi=樣品中第i種細菌的數量占總細菌數量的比例，如樣品中細菌總個數為N，第i種細菌個數為ni，Pi=ni/N。
1.5 統計學方法
分析使用SPSS（version 19.0）軟件。每組的菌種數、均勻性和多樣性的數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 DGGE指紋圖譜
在DGGE圖譜中，每一個垂直的泳道表示單個樣品的總的菌群結構，而每一個泳道里的每一個條帶都代表了一種結構細菌，條帶的亮暗強度表示該細菌的總的菌量。在同一水平方向的不同樣本的條我們認為是同一種類細菌。如圖 1所示，圖中1～10為正常對照組，11～20為輕度阻塞性黃疸組，21～30為中度阻塞性黃疸組，A1代表 1例患者的結腸菌群結構，D3、E3各代表 1種細菌，E3的強度明顯高于D3，說明E3對應的細菌數量明顯多于D3，D3與E3在同一水平，故認為D3與E3是同一種細菌。
圖1
示阻塞性黃疸患者和對照組健康人結腸菌群糞便標本的DGGE條帶。A1～A10：正常對照組；B1～B10：輕度阻塞性黃疸組；C1～C10：中度阻塞性黃疸組??圖 2??示阻塞性黃疸患者和正常對照組人群結腸菌群相似性分析結果。1～10：正常對照組；11～20：輕度阻塞性黃疸組；21～30：中度阻塞性黃疸組；上方標尺表示DGGE條帶間的相似性
2.2 相似性分析結果
運用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行數字化處理，對菌群結構運用Dice coefficient計算其相似性和UPGMA構建聚類樹，進行相似性分析，其結果見圖 2。如圖 2所示，其中標尺長度代表泳道相似程度，線段長度代表相鄰的樣品或者聚類簇內的樣品相似性。所有條帶分為3大組（C、E、F組），F組中有10個條帶，為正常對照組的條帶；E組有9個條帶，全部是輕度阻塞性黃疸組的條帶，由此可以看出，輕度阻塞性黃疸患者和健康人群的結腸菌群存在一定的相似性；C組有10個條帶，均為中度阻塞性黃疸組的條帶。
相似性分析顯示：全圖主要有3個聚類簇即C、E、F。最上端有1個單獨聚成的A簇，說明這個樣本的菌群與其他所有樣本均不一樣（A簇與B簇間相似性為37%）。B簇由C、D 2個主要的簇組成（C簇與D簇間相似性為41%），D簇由E、F 2個主要的簇組成，說明E、F 2個簇之間存在一定的相似性（E簇與F簇間相似性為51%）。
綜上，阻塞性黃疸患者結腸菌群輕度阻塞性黃疸組與正常對照組之間存在一定的相似性，而中度阻塞性黃疸組與正常對照組和輕度阻塞性黃疸組存在一定差異，隨著梗阻時間延長及程度的加重，結腸菌群存在明顯的改變，梗阻時間越長，部分條帶的顏色加深及數量的減少，即結腸菌群的多樣性、豐富度發生改變。
2.3 主成分分析結果
上述UPGMA聚類分析法能比較直觀地反映幾簇菌群結構的相似性，但也存在局限性，它僅僅能夠說明聚類圖上相鄰的菌群或者相近的聚類簇整體的相似性。對最終的實驗結果的詮釋存在一定誤差。因此，本研究又進行了主成分分析（PCA），30個彩色圖標對應30個實驗樣本的菌群結構，任意2個圖標之間的直線距離說明菌群間的差異程度，值越大，差異程度越大。這樣就可以反映所有樣本菌群間的相似程度。
如圖 3所示，PCA分析結果也同樣驗證了聚類分析的結果：正常對照組1～9，這幾個圖標相對集中；輕度阻塞性黃疸組10～20，這幾個圖標距離這個區域較近；中度阻塞性黃疸組21～30，這幾個圖標距離這個區域較近，其他的條帶都遠離這個區域。與前面相似性分析的結果大致相同，說明輕度阻塞性黃疸組、中度阻塞性黃疸組與正常對照組之間均存在明顯差異。
圖3
示阻塞性黃疸患者與健康對照組人結腸菌群主成分分析結果。■：健康對照組；▲：輕度阻塞性黃疸組；2.4 多樣性分析結果
阻塞性黃疸可導致患者結腸菌群多樣性降低，正常對照組香濃指數（Shannon's diversity index）為3.34±0.23，輕度阻塞性黃疸患者組香濃指數為2.77±0.28，中度阻塞性黃疸組香濃指數為2.26±0.25，提示：輕、中度阻塞性黃疸患者結腸菌群多樣性明顯小于正常對照組（P < 0.01），這個趨勢和菌群數（species richness）的變化規律是一致的。
3 討論
消化液是重塑腸道菌群的主要因素，而膽汁酸作為膽汁的主要成分在調節腸道菌群結構中起到了的決定性的作用[4]，尤其是在高蛋白、高脂飲食中，這些發現為我們研究腸道菌群與疾病提供了一個新的視角，以了解部分代謝性疾病（包括肥胖）、炎癥性腸病、結腸直腸癌、慢性肝病等的病因與生態失調之間的關系[5]。膽汁酸不僅能夠乳化經胃腸道吸收的脂性物質促進脂質的消化和吸收，防止膽固醇結石的形成[6]，膽汁酸的另外一個重要特征是具有較強的抗菌活性，可以通過與微生物細胞膜上的磷脂成分作用破壞細胞膜的完整性，從而起到抑菌的作用[7]。雙歧桿菌與乳酸菌對膽汁酸相對敏感，然而大腸桿菌卻可以耐受高濃度的膽汁酸，所以膽汁酸的缺乏勢必會影響整個腸道微生物的結構變化，由此可見益生菌必須克服對人體腸道內膽汁酸的敏感性和抗性，才能補充人體優勢菌群，才能從真正意義上促進益生菌在日常乳品產業的生產及利用[8]。
膽汁能刺激腸道蠕動[9]，缺乏膽汁會引起腸道蠕動減弱，使食物停滯在腸道內，這樣就給腸道微生物營造了一個良好的時間與空間進行增殖，進而導致原有優勢菌群多樣性減少、細菌密度減少，就會出現另外一種菌群結構。另外膽紅素、膽汁酸鹽、經腸道吸收的內毒素等入血影響微循環及腸黏膜的通透性，進一步加重了腸道的負擔及肝功能的損害[10]。國外研究[11]報道，肥胖會影響腸道菌群的多樣性，肥胖者刻意的調節菌群結果可能有利于調節能量平衡。飲食干預可以部分抵消腸道致癌基因的敏感性[12]。膽汁酸與腸道微生物相互作用，調節機體的病理生理。國內文獻[13]報道，在部分肝臟疾病患者糞便中，膽汁酸含量及膽素原較健康人明顯減少, 溶血磷脂酰膽堿反而明顯增高, 進一步實驗研究發現膽汁酸下降水平與肝臟疾病程度呈一定線性關系，以肝癌病患中含量為最低, 降低最顯著, 肝硬變次之。肝臟與腸道作為人體兩大器官，在解剖結構和生理功能上存在著密切關聯[14]。腸道疾病和肝臟疾病共患的現象及其相互關聯的發病機理使我們對于腸道和肝臟之間的密切關系有了新的認識，而不應該僅僅只是關注靶器官本身的疾病防治[15]。關注腸道治療也可以使肝臟疾病的治療有所獲益；反過來關注肝臟疾病治療也可能使腸道疾病的治療獲得更多有益進展。消化道是人體和外界環境交換的直接場所，正常生理功能的腸黏膜上皮細胞及細胞間緊密連接、胃腸道消化系統及肝臟免疫防御系統和胃腸道微生物的組成在維持“腸-肝軸”的內環境穩態和平衡中起了舉足輕重的作用[16]，一些因素誘發的肝臟疾病（如肝炎、肝硬變、肝癌、肝內外膽管結石等）可以引起腸到黏膜屏障的破壞，促進腸道內微生物發生易位并誘發感染等，進一步加重肝臟損傷[17]。人體消化道內，微生物較集聚且爭奪資源激烈，很小的敏感差異都有可能破壞整個平衡[18]。
近年來，對不同程度的阻塞性黃疸患者進行分析發現，隨著血清膽紅素水平的增高，術后感染及出血等并發癥的發生率也有增高趨勢[19]。有學者[20]指出，術前膽道引流并不影響阻塞性黃疸患者術后死亡率，但阻塞性黃疸患者的腸源性感染及胃腸道出血率明顯高于無阻塞性黃疸者。
高膽紅素血癥、手術創傷、內毒素血癥、手術麻醉、術中大出血和輸血等是造成患者術后腸黏膜缺血再灌注損傷及腸黏膜功能紊亂的主要原因，但其系統變化規律還不清楚[21]。但是，高膽紅素水平仍然是導致阻塞性黃疸患者圍手術期感染的重要危險因素之一[22]，因此圍手術期通過檢測阻塞性黃疸患者腸道功能的變化，及時發現患者各種腸道菌群的異常并迅速補充膽汁酸鹽及優勢菌，改善其腸道功能是降低患者圍手術期感染的主要舉措[23]。
4 結論
本研究通過糞便樣本中特定菌群的分析，探討膽汁酸在重塑人腸道菌群中的重要性[24]。本研究運用PCR-DGGE對不同程度阻塞性黃疸患者和健康人群結腸菌群進行分析，評估了不同程度的阻塞性黃疸患者腸道菌群結構的紊亂特征，從相似性分析和主成分分析的結果可以看出：黃疸患者結腸菌群存在結構的紊亂及優勢菌群的改變，輕、中度黃疸患者與正常對照組有明顯差異，輕、中度阻塞性黃疸組患者結腸優勢菌群多樣性較正常對照組明顯降低, 說明正常與病理狀態下的腸道菌群結構有截然不同的特點及區分度。
膽汁酸實際上作為一個重要的決定因素重塑了腸道菌群[25]，尤其是在阻塞性黃疸發生時。本研究描述了輕、中度阻塞性黃疸患者結腸菌群結構的變化特征，黃疸患者優勢菌群結構的改變提示結腸菌群可能在黃疸患者圍手術期感染的發生發展中起到一定的作用。為黃疸在圍手術期感染的發生和發展中起到的作用提供了新的認識，并可能給阻塞性黃疸圍手術期感染的預防與治療提供新的方向。
