引用本文： 徐榮偉, 樊雪強, 潘琳, 溫見燕, 王謙, 田宇, 劉鵬. 頸動脈粥樣硬化狹窄患者的斑塊特征及斑塊中內臟脂肪素的表達. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(4): 434-438. doi: 10.7507/1007-9424.20150113 復制
頸動脈粥樣硬化狹窄是導致腦部缺血性疾病的主要原因之一。頸動脈的狹窄程度與患者的臨床結局密切相關，可以從完全無癥狀到嚴重的腦梗塞。目前，頸動脈狹窄率是評價與界定患者治療方式的主要依據。而近年來發現, 斑塊的組成和形態學變化也是引起缺血性腦卒中的關鍵環節[1]，可能比管腔狹窄具有更高的臨床價值，故在決定治療策略時應予以考慮。不穩定性斑塊易破裂、脫落、形成血栓、栓塞，從而引起腦血管事件的發生[2-3], 具有極大的危害性。然而，導致斑塊不穩定性的機理及影響因素目前仍未完全明確。本研究探討了頸動脈粥樣硬化狹窄患者的斑塊所致狹窄率及斑塊性質與臨床癥狀之間的關系，并初步研究了影響斑塊穩定性的病理學因素，這對腦血管疾病的防治具有重要的臨床意義。
內臟脂肪素(visfatin)作為新發現的脂肪細胞因子，其與動脈粥樣硬化關系日益受到重視。visfatin已被證實可促進泡沫細胞的形成而參與粥樣硬化斑塊的形成[4]。visfatin對于心血管疾病的影響，特別是對粥樣硬化斑塊穩定性的作用正受到高度關注。本研究通過檢測visfatin在頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達，探討其與斑塊穩定性之間的關系，為頸動脈狹窄的早期防治、改善預后提供一些臨床參考依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
2013年2月至2014年6月期間在中日友好醫院血管外科接受頸動脈內膜剝脫術（CEA）治療頸動脈粥樣硬化狹窄的患者共56例，其中男39例，女17例；年齡（63.7±6.59）歲（52～79歲）；根據患者的臨床表現及發作時間分為有癥狀組和無癥狀組2組。有癥狀組：31例，入院前6個月之內有明顯的腦缺血事件發生如短暫性腦缺血（包括一過性黑矇、突發肢體無力、輕度感覺減退或異常、失語等癥狀）和或腦梗塞；無癥狀組：25例，無明顯臨床癥狀及定位體征，10例于常規查體時發現頸動脈狹窄，15例于動脈造影時發現。56例患者中, 合并高血壓32例, 糖尿病34例, 高脂血癥28例, 吸煙42例。術前通過頸動脈超聲、CT血管造影（CTA）或數字減影血管造影（DSA）對患者的頸內動脈狹窄率進行測量。
1.2 方法
1.2.1 標本采集
所有患者術前均簽署知情同意書，術中收集距頸動脈分叉上方3～5 mm處的頸內動脈斑塊。斑塊取下后立即用10%中性甲醛液固定，脫水包埋，石蠟切片，厚度4μm。同一標本平行切片3張，分別行HE、Masson和免疫組化染色。
1.2.2 頸動脈斑塊的病理學觀察
①常規HE染色。②Masson三色法染色：石蠟切片脫蠟至水，水洗
5 min；3%氯化汞飽和苦味酸固定40 min，流水沖洗10 min；0.5%冰醋酸浸洗1 s，酸性品紅+麗春紅2R（1：2）工作液染色10 min；0.5%冰醋酸浸洗1 s，1%磷鉬酸分化2 s，1%亮綠復染3 min；0.5%冰醋酸浸洗2 s×2次，無水乙醇脫水2 s×3次，二甲苯透明10 min×2次，中性樹膠封片。上述染色試劑由中日友好臨床醫學研究所中心實驗室提供。于光鏡下觀察斑塊的形態：纖維帽的連續性及厚度、脂質壞死核心的大小、斑塊內出血、膽固醇結晶、炎性細胞浸潤及鈣化程度。每張切片隨機選擇6個互不重疊的視野，應用Image-Pro Plus（IPP）5.1版圖像分析軟件進行斑塊纖維帽厚度及脂質壞死核心大小數值測算。
1.2.3 免疫組化染色EnVision法檢測斑塊中visf-atin的表達
石蠟切片脫蠟至水后，0.3%H2O2氧化15 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS洗5 min共3次，滴加稀釋的一抗（兔抗人visfatin多克隆抗體，1：200稀釋，SANTA CURZE公司），4℃過夜，PBS洗5 min共3次，滴加兔/鼠通用型二抗（EnVision二抗，Gene Tech公司），室溫孵育3 h。PBS洗5 min共3次，即用型DAB顯色5 min，PBS終止顯色，Mayer蘇木精復染細胞核，常規脫水、透明、封片。在光鏡下觀察visfatin的著色情況，陽性部位呈棕黃色或黃褐色染色。每張切片隨機選擇6個互不重疊視野，應用Image-Pro Plus 5.1版圖像分析軟件進行陽性反應區的積分光密度（IOD）測量，經平均后代表該標本的染色強度。
1.3 統計學方法
應用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用均數±標準差（
2 結果
2.1 2組患者一般臨床資料比較結果
有癥狀組患者短暫性腦缺血（TIA）發作者21例（67.74%），CT檢查后提示有陳舊性腦梗塞者10例（32.26%），與無癥狀組比較，差異有統計學意義（P < 0.001，P < 0.01）；其他臨床參數2組患者間的差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
2組患者一般臨床資料比較
2.2 斑塊的病理學特征觀察結果
光鏡下見標本呈典型的動脈粥樣硬化性改變：內膜中可見大量的泡沫細胞、炎性細胞聚集、膽固醇結晶、脂質壞死核心、鈣鹽沉積、玻璃樣變、斑塊內出血等（圖 1～圖 5）。應用IPP 5.1軟件測量斑塊的纖維帽厚度和脂質壞死核心大小，將纖維帽厚度< 65μm且脂質壞死核心面積> 40%斑塊面積者定義為不穩定性斑塊[1, 5]，共30例（有癥狀組21例，無癥狀組9例），其余為穩定性斑塊，共26例（有癥狀組10例，無癥狀組16例）。有癥狀組患者中不穩定性斑塊所占比例高于無癥狀組（P < 0.05），見表 2。在斑塊的病理學特征方面，與穩定性斑塊相比，不穩定性斑塊的纖維帽較薄，含較大的脂質壞死核心，發生出血者比例較高，兩者間比較其差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 3。
圖1
示斑塊內出血壞死(HE×100)??圖 2示斑塊內出血壞死, 膽固醇結晶(Masson×100)??圖 3示斑塊內鈣化, 壞死, 膽固醇結晶(HE×400)??圖 4示斑塊內大的脂質壞死核心, 出血, 膽固醇結晶(Masson×100)??圖 5示斑塊內大量炎性細胞浸潤(HE×200)??圖 6示不穩定性斑塊中visfatin的表達(免疫組化染色EnVision法×400)??圖 7示穩定性斑塊中visfatin的表達(免疫組化染色EnVision法×400)??圖 8示2組visfatin表達的IOD值
表2
2組患者的斑塊性質比較〔例（%）〕
表3
穩定性斑塊和不穩定性斑塊的病理學特征
2.3 斑塊中visfatin表達檢測結果
免疫組化染色結果顯示，visfatin在穩定性斑塊和不穩定性斑塊中均有表達，陽性區域成黃褐色或棕黃色（圖 6及圖 7）。應用IPP 5.1圖像分析軟件進行陽性反應區的IOD測量, 結果不穩定性斑塊visfatin表達的IOD值明顯高于穩定性斑塊（84 165.47±9 183.12比55 694.08±4 818.57），差異有統計學意義（P < 0.001），見圖 8。
3 討論
動脈粥樣硬化性疾病是一種慢性、全身性疾病，但卻可以導致急性心腦血管事件的發生。過去一直認為，動脈粥樣硬化斑塊的增大造成管腔狹窄，血流動力學改變，進而導致心腦血管事件的發生[6]。然而有研究[7-8]發現，較之斑塊體積，斑塊的組成成分和形態學變化與心腦血管事件的發生具有更直接的關系。頸動脈斑塊最大的危害在于不穩定性斑塊出血、破裂、脫落，形成血栓，造成腦梗塞，引起失語、失明、偏癱等癥狀，甚至危及生命，所以臨床上盡早發現頸動脈斑塊、盡早判斷斑塊的穩定性、盡早施以合理的干預治療，對預防缺血性腦病具有重要的意義。本研究根據患者的臨床表現及發作時間，將患者分為有癥狀組和無癥狀組，通過比較2組患者的一般臨床資料及斑塊的病理學特征發現：有癥狀組患者中不穩定性斑塊的比例明顯高于無癥狀組患者，提示斑塊的不穩定性與患者臨床癥狀的發生相關；與穩定性斑塊相比，不穩定性斑塊的纖維帽厚度較薄、脂質壞死核心較大及發生出血者比例較高，提示三者在斑塊的穩定性中發揮了重要作用。
visfatin是2005年Fukuhara等[9]從人和小鼠的內臟脂肪中發現并分離出來的一種由脂肪組織分泌的細胞因子。visfatin可與胰島素受體結合模擬胰島素作用, 與肥胖、糖尿病、代謝綜合征及炎癥性疾病密切相關[10]。目前研究[11]表明，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥過程，其發生、進展和斑塊的破裂均與炎癥有關。炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化從脂紋形成到斑塊、斑塊破裂和血栓形成的全過程，在一定程度上決定斑塊的穩定性和自然進程。visfatin在動脈粥樣硬化斑塊中的發現，表明其可能作為一種炎癥介質在動脈粥樣硬化形成機理中起重要作用。Dahl等[12]在研究冠狀動脈和頸動脈不穩定粥樣硬化病變中，發現visfatin集中出現在富含脂質的巨噬細胞聚集區域，由于巨噬細胞是參與炎癥反應的主要細胞之一，因此visfatin可能是一個重要的前炎性因子。Moschen等[13]認為，visfatin對炎癥細胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6具有誘導作用，誘發炎癥反應，而炎癥反應可能與斑塊的不穩定性相關；國外研究[14-15]表明，visfatin可能參與了與斑塊的不穩定性。本研究發現，不穩定性斑塊visfatin的表達明顯高于穩定性斑塊，提示visfatin在動脈粥樣硬化形成和斑塊的不穩定性中起一定作用，這與國外研究的結論相符。國內孔慶霞等[16]發現，血清visfatin水平與動脈粥樣硬化顯著相關，visfatin含量越高患動脈粥樣硬化的可能性越大。Dahl等[12]還發現，visfatin可使人單核細胞THP-1中的基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）活性增強，并使外周血單核細胞中炎癥細胞因子TNF-α及IL-8水平升高。MMP-9能夠降解細胞外基質，促進平滑肌細胞的增殖和遷移，促進粥樣斑塊纖維帽的降解，從而加速動脈粥樣硬化進程并降低斑塊的穩定性[17]。研究[18]表明，MMP-9在動脈粥樣硬化不穩定性斑塊中的表達水平明顯高于穩定性斑塊。基質金屬蛋白酶、炎癥細胞因子及其交互作用在動脈粥樣硬化形成和斑塊的不穩定中起重要作用，visfatin對這些介質的顯著誘導作用與動脈粥樣硬化損傷有關，表明visfatin可能是這些過程的重要中介，參與動脈粥樣硬化的發生發展。
綜上所述，斑塊的穩定性主要取決于斑塊自身的內在特性，如纖維帽的厚度、脂質壞死核心大小等，而炎癥因子及各種酶類則是斑塊穩定性的重要參與因素。盡管目前對動脈粥樣硬化斑塊穩定性的研究已取得了較大進展，但目前仍未找出能夠識別不穩定性斑塊和預測斑塊破裂的確切標志物。本研究通過對斑塊病理學特征的研究及visfatin與斑塊穩定性關系的探討，為進一步對斑塊穩定性進行有利調控提供了新思路。因此，加強動脈粥樣硬化斑塊穩定性的基礎和臨床研究，能有效防止斑塊的進展和破裂，從而減少心腦血管疾病的發生，為我們治療該類疾病展示了良好的前景。
頸動脈粥樣硬化狹窄是導致腦部缺血性疾病的主要原因之一。頸動脈的狹窄程度與患者的臨床結局密切相關，可以從完全無癥狀到嚴重的腦梗塞。目前，頸動脈狹窄率是評價與界定患者治療方式的主要依據。而近年來發現, 斑塊的組成和形態學變化也是引起缺血性腦卒中的關鍵環節[1]，可能比管腔狹窄具有更高的臨床價值，故在決定治療策略時應予以考慮。不穩定性斑塊易破裂、脫落、形成血栓、栓塞，從而引起腦血管事件的發生[2-3], 具有極大的危害性。然而，導致斑塊不穩定性的機理及影響因素目前仍未完全明確。本研究探討了頸動脈粥樣硬化狹窄患者的斑塊所致狹窄率及斑塊性質與臨床癥狀之間的關系，并初步研究了影響斑塊穩定性的病理學因素，這對腦血管疾病的防治具有重要的臨床意義。
內臟脂肪素(visfatin)作為新發現的脂肪細胞因子，其與動脈粥樣硬化關系日益受到重視。visfatin已被證實可促進泡沫細胞的形成而參與粥樣硬化斑塊的形成[4]。visfatin對于心血管疾病的影響，特別是對粥樣硬化斑塊穩定性的作用正受到高度關注。本研究通過檢測visfatin在頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達，探討其與斑塊穩定性之間的關系，為頸動脈狹窄的早期防治、改善預后提供一些臨床參考依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
2013年2月至2014年6月期間在中日友好醫院血管外科接受頸動脈內膜剝脫術（CEA）治療頸動脈粥樣硬化狹窄的患者共56例，其中男39例，女17例；年齡（63.7±6.59）歲（52～79歲）；根據患者的臨床表現及發作時間分為有癥狀組和無癥狀組2組。有癥狀組：31例，入院前6個月之內有明顯的腦缺血事件發生如短暫性腦缺血（包括一過性黑矇、突發肢體無力、輕度感覺減退或異常、失語等癥狀）和或腦梗塞；無癥狀組：25例，無明顯臨床癥狀及定位體征，10例于常規查體時發現頸動脈狹窄，15例于動脈造影時發現。56例患者中, 合并高血壓32例, 糖尿病34例, 高脂血癥28例, 吸煙42例。術前通過頸動脈超聲、CT血管造影（CTA）或數字減影血管造影（DSA）對患者的頸內動脈狹窄率進行測量。
1.2 方法
1.2.1 標本采集
所有患者術前均簽署知情同意書，術中收集距頸動脈分叉上方3～5 mm處的頸內動脈斑塊。斑塊取下后立即用10%中性甲醛液固定，脫水包埋，石蠟切片，厚度4μm。同一標本平行切片3張，分別行HE、Masson和免疫組化染色。
1.2.2 頸動脈斑塊的病理學觀察
①常規HE染色。②Masson三色法染色：石蠟切片脫蠟至水，水洗
5 min；3%氯化汞飽和苦味酸固定40 min，流水沖洗10 min；0.5%冰醋酸浸洗1 s，酸性品紅+麗春紅2R（1：2）工作液染色10 min；0.5%冰醋酸浸洗1 s，1%磷鉬酸分化2 s，1%亮綠復染3 min；0.5%冰醋酸浸洗2 s×2次，無水乙醇脫水2 s×3次，二甲苯透明10 min×2次，中性樹膠封片。上述染色試劑由中日友好臨床醫學研究所中心實驗室提供。于光鏡下觀察斑塊的形態：纖維帽的連續性及厚度、脂質壞死核心的大小、斑塊內出血、膽固醇結晶、炎性細胞浸潤及鈣化程度。每張切片隨機選擇6個互不重疊的視野，應用Image-Pro Plus（IPP）5.1版圖像分析軟件進行斑塊纖維帽厚度及脂質壞死核心大小數值測算。
1.2.3 免疫組化染色EnVision法檢測斑塊中visf-atin的表達
石蠟切片脫蠟至水后，0.3%H2O2氧化15 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS洗5 min共3次，滴加稀釋的一抗（兔抗人visfatin多克隆抗體，1：200稀釋，SANTA CURZE公司），4℃過夜，PBS洗5 min共3次，滴加兔/鼠通用型二抗（EnVision二抗，Gene Tech公司），室溫孵育3 h。PBS洗5 min共3次，即用型DAB顯色5 min，PBS終止顯色，Mayer蘇木精復染細胞核，常規脫水、透明、封片。在光鏡下觀察visfatin的著色情況，陽性部位呈棕黃色或黃褐色染色。每張切片隨機選擇6個互不重疊視野，應用Image-Pro Plus 5.1版圖像分析軟件進行陽性反應區的積分光密度（IOD）測量，經平均后代表該標本的染色強度。
1.3 統計學方法
應用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用均數±標準差（
2 結果
2.1 2組患者一般臨床資料比較結果
有癥狀組患者短暫性腦缺血（TIA）發作者21例（67.74%），CT檢查后提示有陳舊性腦梗塞者10例（32.26%），與無癥狀組比較，差異有統計學意義（P < 0.001，P < 0.01）；其他臨床參數2組患者間的差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
2組患者一般臨床資料比較
2.2 斑塊的病理學特征觀察結果
光鏡下見標本呈典型的動脈粥樣硬化性改變：內膜中可見大量的泡沫細胞、炎性細胞聚集、膽固醇結晶、脂質壞死核心、鈣鹽沉積、玻璃樣變、斑塊內出血等（圖 1～圖 5）。應用IPP 5.1軟件測量斑塊的纖維帽厚度和脂質壞死核心大小，將纖維帽厚度< 65μm且脂質壞死核心面積> 40%斑塊面積者定義為不穩定性斑塊[1, 5]，共30例（有癥狀組21例，無癥狀組9例），其余為穩定性斑塊，共26例（有癥狀組10例，無癥狀組16例）。有癥狀組患者中不穩定性斑塊所占比例高于無癥狀組（P < 0.05），見表 2。在斑塊的病理學特征方面，與穩定性斑塊相比，不穩定性斑塊的纖維帽較薄，含較大的脂質壞死核心，發生出血者比例較高，兩者間比較其差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 3。
圖1
示斑塊內出血壞死(HE×100)??圖 2示斑塊內出血壞死, 膽固醇結晶(Masson×100)??圖 3示斑塊內鈣化, 壞死, 膽固醇結晶(HE×400)??圖 4示斑塊內大的脂質壞死核心, 出血, 膽固醇結晶(Masson×100)??圖 5示斑塊內大量炎性細胞浸潤(HE×200)??圖 6示不穩定性斑塊中visfatin的表達(免疫組化染色EnVision法×400)??圖 7示穩定性斑塊中visfatin的表達(免疫組化染色EnVision法×400)??圖 8示2組visfatin表達的IOD值
表2
2組患者的斑塊性質比較〔例（%）〕
表3
穩定性斑塊和不穩定性斑塊的病理學特征
2.3 斑塊中visfatin表達檢測結果
免疫組化染色結果顯示，visfatin在穩定性斑塊和不穩定性斑塊中均有表達，陽性區域成黃褐色或棕黃色（圖 6及圖 7）。應用IPP 5.1圖像分析軟件進行陽性反應區的IOD測量, 結果不穩定性斑塊visfatin表達的IOD值明顯高于穩定性斑塊（84 165.47±9 183.12比55 694.08±4 818.57），差異有統計學意義（P < 0.001），見圖 8。
3 討論
動脈粥樣硬化性疾病是一種慢性、全身性疾病，但卻可以導致急性心腦血管事件的發生。過去一直認為，動脈粥樣硬化斑塊的增大造成管腔狹窄，血流動力學改變，進而導致心腦血管事件的發生[6]。然而有研究[7-8]發現，較之斑塊體積，斑塊的組成成分和形態學變化與心腦血管事件的發生具有更直接的關系。頸動脈斑塊最大的危害在于不穩定性斑塊出血、破裂、脫落，形成血栓，造成腦梗塞，引起失語、失明、偏癱等癥狀，甚至危及生命，所以臨床上盡早發現頸動脈斑塊、盡早判斷斑塊的穩定性、盡早施以合理的干預治療，對預防缺血性腦病具有重要的意義。本研究根據患者的臨床表現及發作時間，將患者分為有癥狀組和無癥狀組，通過比較2組患者的一般臨床資料及斑塊的病理學特征發現：有癥狀組患者中不穩定性斑塊的比例明顯高于無癥狀組患者，提示斑塊的不穩定性與患者臨床癥狀的發生相關；與穩定性斑塊相比，不穩定性斑塊的纖維帽厚度較薄、脂質壞死核心較大及發生出血者比例較高，提示三者在斑塊的穩定性中發揮了重要作用。
visfatin是2005年Fukuhara等[9]從人和小鼠的內臟脂肪中發現并分離出來的一種由脂肪組織分泌的細胞因子。visfatin可與胰島素受體結合模擬胰島素作用, 與肥胖、糖尿病、代謝綜合征及炎癥性疾病密切相關[10]。目前研究[11]表明，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥過程，其發生、進展和斑塊的破裂均與炎癥有關。炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化從脂紋形成到斑塊、斑塊破裂和血栓形成的全過程，在一定程度上決定斑塊的穩定性和自然進程。visfatin在動脈粥樣硬化斑塊中的發現，表明其可能作為一種炎癥介質在動脈粥樣硬化形成機理中起重要作用。Dahl等[12]在研究冠狀動脈和頸動脈不穩定粥樣硬化病變中，發現visfatin集中出現在富含脂質的巨噬細胞聚集區域，由于巨噬細胞是參與炎癥反應的主要細胞之一，因此visfatin可能是一個重要的前炎性因子。Moschen等[13]認為，visfatin對炎癥細胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6具有誘導作用，誘發炎癥反應，而炎癥反應可能與斑塊的不穩定性相關；國外研究[14-15]表明，visfatin可能參與了與斑塊的不穩定性。本研究發現，不穩定性斑塊visfatin的表達明顯高于穩定性斑塊，提示visfatin在動脈粥樣硬化形成和斑塊的不穩定性中起一定作用，這與國外研究的結論相符。國內孔慶霞等[16]發現，血清visfatin水平與動脈粥樣硬化顯著相關，visfatin含量越高患動脈粥樣硬化的可能性越大。Dahl等[12]還發現，visfatin可使人單核細胞THP-1中的基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）活性增強，并使外周血單核細胞中炎癥細胞因子TNF-α及IL-8水平升高。MMP-9能夠降解細胞外基質，促進平滑肌細胞的增殖和遷移，促進粥樣斑塊纖維帽的降解，從而加速動脈粥樣硬化進程并降低斑塊的穩定性[17]。研究[18]表明，MMP-9在動脈粥樣硬化不穩定性斑塊中的表達水平明顯高于穩定性斑塊。基質金屬蛋白酶、炎癥細胞因子及其交互作用在動脈粥樣硬化形成和斑塊的不穩定中起重要作用，visfatin對這些介質的顯著誘導作用與動脈粥樣硬化損傷有關，表明visfatin可能是這些過程的重要中介，參與動脈粥樣硬化的發生發展。
綜上所述，斑塊的穩定性主要取決于斑塊自身的內在特性，如纖維帽的厚度、脂質壞死核心大小等，而炎癥因子及各種酶類則是斑塊穩定性的重要參與因素。盡管目前對動脈粥樣硬化斑塊穩定性的研究已取得了較大進展，但目前仍未找出能夠識別不穩定性斑塊和預測斑塊破裂的確切標志物。本研究通過對斑塊病理學特征的研究及visfatin與斑塊穩定性關系的探討，為進一步對斑塊穩定性進行有利調控提供了新思路。因此，加強動脈粥樣硬化斑塊穩定性的基礎和臨床研究，能有效防止斑塊的進展和破裂，從而減少心腦血管疾病的發生，為我們治療該類疾病展示了良好的前景。
