引用本文： 歐琴, 趙宗彬, 王耕, 李文仿. 人異黏蛋白在乙肝相關性肝癌組織中的表達及其臨床病理意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(3): 301-306. doi: 10.7507/1007-9424.20150081 復制
肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界第三大癌癥死因，其最常見的病因是慢性乙肝及乙醇性肝病；有90.0%的HCC繼發于肝硬變，且與慢性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝疾病等有關，但是目前有關其病因及發病的分子機理仍不清楚[1]。臨床上由于其臨床表現的異質性及缺乏有效的分子診斷指標和治療策略，使得HCC的治療尤為困難[2]。通過藥物誘導HCC細胞向良性細胞及正常細胞分化是有效的抗腫瘤治療方向，且癌蛋白靶向治療在乙肝相關性HCC的治療中具有一定的治療前景[3]。人異黏蛋白（metaherin，MTDH）基因定位于8q22，首先從星形膠質瘤細胞中克隆出來；此外，由于HIV感染后星形膠質瘤細胞中其表達水平升高，故其也被稱為膠質瘤升高基因（astrocyte elevated gene 1，AEG-1） [4]。MTDH基因調節著眾多信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、三磷酸酰肌醇蛋白激酶（PI3K/AKT）信號通路及轉錄激活蛋白-1（AP-1）信號通路，在促進腫瘤細胞的增殖、轉移及侵襲中發揮重要作用[5]。目前研究發現，在乳腺癌[6]、膀胱癌[7]等眾多惡性腫瘤中，MTDH基因的表達上調。然而，在乙肝相關性HCC組織中MTDH基因及其蛋白的表達情況，以及其表達對預后判斷的價值如何，研究得較少。本研究檢測了乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織中MTDH mRNA及其蛋白的表達情況，同時探討了乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白表達與患者臨床病理特征的關系。
1 資料和方法
1.1 研究對象
回顧性收集2012年7月至2013年10月期間湖北醫藥學院附屬太和醫院保存的72例乙肝相關性HCC患者的標本。乙肝相關性HCC定義為患者在診斷HCC時具有明確的10年以上的乙肝病毒感染史，且血清HbsAg或標本HBV cDNA呈陽性[8]。72例患者術前均未接受化療或者放療，包括男35例，女37例；年齡25～63歲、（50.8±12.8）歲；腫瘤直徑≤5 cm 36例，>5 cm 36例；腫瘤為單發結節37例，多發結節35例；包膜完整35例，包膜不完整37例；Edmondson分級[9]為Ⅰ級7例，Ⅱ級47例，Ⅲ級18例；巴塞羅納分期（BCLC分期） [10]為0期10例，A期23例，B期30例，C期9例；存在微血管浸潤34例，無微血管浸潤38例；有淋巴結轉移40例，無淋巴結轉移32例。其中10例標本同時具有癌組織和癌旁組織，取癌灶中央組織作為癌組織，取距離腫瘤邊緣以遠2 cm的組織作為癌旁組織。所有組織標本立即凍存于液氮罐中，以備用于后續檢測。
1.2 主要試劑和設備
RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物有限公司，逆轉錄試劑盒及熒光定量核苷酸膠體染料（SYBR）購自大連Takara生物有限公司，免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福建中杉金橋生物有限公司，Western blot配膠試劑盒及蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物有限公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體及鼠抗兔單克隆二抗均購自武漢博士德生物有限公司，兔抗人MTDH蛋白單克隆抗體購自美國Abcam公司。設備：Western blot顯色儀和T100 PCR儀（美國Bio Rad公司）、BioPhotometer plus核酸蛋白檢測儀（德國Eppendorf公司）及MML1500顯微鏡（德國Kruess公司）。Western blot條帶的灰度分析采用Image J 1.46軟件（美國National Institutes of Health公司）。
1.3 方法
1.3.1 RNA提取及逆轉錄熒光定量檢測
分別取已經凍存于液氮罐的乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織100 mg，提取RNA（操作按試劑盒說明書進行）。本實驗提取的RNA的濃度和純度均符合要求，其260 nm和280 nm處的紫外吸光度值（A值）比值在1.80～2.00之間。取2 μg RNA行逆轉錄，逆轉錄步驟按試劑盒說明進行。MTDH基因的引物序列：上游，5′-AAGAGGAAAACTGAGCCATCTG-3′；下游，5′-CGGCTAACATCCCACTGATAAT-3′（擴增長度為200 bp）。內參GAPDH基因的引物序列：上游，5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′；下游，5′-AG-AGGCAGGGATGATGTTCTG-3′（擴增長度為210 bp）。MTDH基因及GAPDH基因引物均由廣州瑞博生物有限公司合成。取2 μL逆轉錄產物DNA行熒光定量PCR（Q-PCR），反應體系同試劑盒說明書；反應條件：95 ℃ 1 min（預變性），94 ℃ 30 s（解聚模板DNA），60 ℃ 30 s（使引物與模板DNA結合），68 ℃ 1 min（擴增模板DNA），反應共計35個循環；70 ℃條件下延伸10 min后結束反應。通過溶解曲線判斷產物的特異性后，根據循環閾值（Ct）結果，采用2-ΔCt法計算MTDH mRNA的相對表達水平，其中ΔCt=CtMTDH-CtGAPDH。實驗重復3次，每一例組織MTDH mRNA的表達水平為3次實驗的均值。
1.3.2 Western blot檢測
分別取已經凍存于液氮罐的乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織100 mg，提取總蛋白（操作按試劑盒說明書進行）。取100 μg提取蛋白行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉膜至硝酸纖維薄膜上，以PBS溶液清洗3次，每次15 min；用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入兔抗人MTDH蛋白單克隆抗體（1∶1 000） 4 ℃過夜后，以PBS溶液清洗3次，每次5 min；加入辣根過氧化酶標記的鼠抗兔單克隆二抗（1∶2 000）孵育1 h后，以PBS溶液清洗3次，每次10 min；加入顯色劑進行顯色，再以X光機讀片。采用Image J 1.46軟件測定MTDH蛋白和GAPDH條帶的灰度值，以MTDH蛋白條帶和GAPDH條帶灰度值的比值作為MTDH蛋白的相對表達水平。
1.3.3 免疫組化染色
將HCC石蠟標本行4 μm厚切片后，置入二甲苯溶液中60 min脫蠟；以梯度乙醇水化后，置入pH值為6的0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液中進行抗原修復15 min（95 ℃）；加入1∶100兔抗人MTDH蛋白單克隆抗體，4 ℃過夜孵育后，以PBS溶液清洗3次，每次5 min；加入辣根過氧化物標記的羊抗兔二抗（1∶2 000）后，于室溫下作用30 min；滴加DAB溶液進行顯色，以蘇木精復染，再以二甲苯溶液透明，最后以中性樹膠封片。通過染色強度及染色百分比結果評價免疫組化結果[11]。染色強度評分定義為：0分，陰性；1分，弱表達；2分，中等表達；3分，強表達。染色百分比定義為：0分，小于21.0%；1分，21.0%～40.0%；2分，41.0%～60.0%；3分，61.0%～80.0%；4分，81.0%～100%。最終染色得分為染色強度評分和染色百分比評分的乘積，7～12分為陽性表達，0～6分為陰性表達。采用PBS溶液代替一抗作為陰性對照，陽性對照采用已知MTDH蛋白呈陽性表達的乳腺癌組織切片。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織中MTDH mRNA及其蛋白表達水平的比較采用配對t檢驗。在乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達與患者臨床病理特征間關系的單因素分析時，計量資料采用兩獨立樣本比較的t檢驗，計數資料采用成組χ2檢驗或確切概率法；多因素分析采用非條件logistic回歸分析，其中α入=0.10，α出=0.15。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 乙肝相關性HCC組織和癌旁組織中MTDH mRNA及其蛋白的表達
Q-PCR結果顯示，乙肝相關性HCC組織中MTDH mRNA的表達水平為8.50±0.84，癌旁組織為4.55±0.81，前者較高（t=10.797，P=0.000）。Western blot檢測結果顯示，乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達水平為0.65±0.24，癌旁組織為0.25±0.16，前者較高（t=6.375，P=0.013），見圖 1。
圖1
示乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織中MTDH蛋白的電泳結果。1：乙肝相關性HCC組織；2：癌旁組織 ? ?圖 2 示乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的免疫組化染色結果（SP ×200）。2A：陰性表達；2B：陽性表達
2.2 乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的免疫組化染色結果
顯微鏡下見乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白主要表達于胞漿，部分表達于細胞核。有42例（58.3%）乙肝相關性HCC組織其MTDH蛋白呈陽性表達，30例（41.7%）呈陰性表達（圖 2）。
2.3 乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白表達與患者臨床病理特征的關系
2.3.1 單因素分析結果
單因素分析結果顯示，在乙肝相關性HCC患者中，年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤結節數目、包膜完整情況及Edmondson分級均與乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達情況無關（P>0.05），而BCLC分期、微血管浸潤和淋巴結轉移情況均與MTDH蛋白的表達相關（P<0.05），BCLC分期為C期、有微血管浸潤及有淋巴結轉移者其MTDH蛋白的表達陽性率較高（表 1）。
表1
乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白表達與患者臨床病理特征關系的單因素分析結果
2.3.2 多因素分析結果
多因素回歸分析時納入因素的賦值情況見表 2。將表 2中的所有變量納入logistic回歸模型（變量篩選方法為向前法）。結果顯示，Edmondson分級為Ⅲ級（OR=4.783，95% CI：2.663～11.918，P=0.020）、有微血管浸潤（OR=37.790，95% CI：2.227～99.434，P=0.005）及有淋巴結轉移者（OR=7.332，95% CI：3.325～30.669，P=0.023）其MTDH蛋白的表達陽性率更高（表 3）。
表2
乙肝相關性HCC患者中MTDH蛋白表達及其影響因素的賦值情況
表3
乙肝相關性HCC患者中MTDH蛋白表達影響因素的logistic回歸分析結果
3 討論
3.1 乙肝病毒感染促進HCC的發生與發展
HCC是世界第五大腫瘤，其發生是多因素相互作用的結果，且其病因復雜，發病人數逐漸增多[12]。據估計，僅有約10.0%～20.0%的HCC患者在診斷時尚可耐受手術，但術后5年生存率為28.6%，且術后復發率高達75.0% [13-14]。故研究HCC的發生機理對其預防和治療均具有一定的價值。目前認為，病毒感染與HCC的發生有一定關系。已有研究[15]表明，丙肝病毒的Core蛋白可上調DNA甲基化酶1（DNMT1）的表達，并通過甲基化啟動子而抑制p16蛋白的表達，從而發揮抑制腫瘤生長的作用。此外，我國的慢性乙肝患病率較高，而長期的乙肝病毒感染被認為是HCC高發的重要因素，在乙肝相關性HCC的發病機理中占據重要地位[16-17]。乙肝病毒感染在我國是HCC發生的重要影響因素，其在促進HCC表型轉換及惡性進展中均發揮重要作用，且其逆轉錄區核苷酸基因的多態性及其HbsAg在HCC的發生過程中均具有一定的作用[18-19]。目前已經明確，乙肝病毒感染是原發性HCC的首要病因，約占50.0% [20-21]。研究[22]表明，乙肝病毒及其編碼蛋白對宿主基因（尤其是腫瘤相關調控轉錄基因）的影響在癌癥的發生過程中發揮重要作用。因此，研究乙肝相關性HCC的發病機理及其基因靶向治療均具有一定的價值。
3.2 MTDH基因及其蛋白在乙肝相關性HCC組織中的表達上調
MTDH調節著眾多信號通路，包括MAPK/細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路和PI3K/AKT信號通路[5]。MTDH基因及其蛋白的高表達可促進癌細胞增殖、抑制凋亡、促進上皮-間質轉換及促進侵襲和轉移[23]。抑制MTDH基因及其蛋白的表達對一些惡性腫瘤具有一定的治療價值，如敲除MTDH基因能明顯抑制非小細胞肺癌的侵襲和轉移，誘導細胞凋亡[24]。研究[25]表明，MTDH蛋白與HCC的發生密切相關，HCC組織中高表達MTDH蛋白是患者預后較差的指標之一。Gong等[26]報道，MTDH蛋白在正常肝組織、乙肝病毒感染肝組織及乙肝相關性HCC組織中的表達陽性率分別為0、46.7%和64.4%。MTDH蛋白在乙肝相關性HCC組織中的表達陽性率明顯高于乙肝病毒感染肝組織及正常肝組織，提示MTDH蛋白參與了乙肝相關性HCC的發生與發展，表明乙肝病毒感染可能導致肝細胞中MTDH基因的表達水平異常增高，從而導致腫瘤進展，但具體作用機理目前并不清楚。本研究結果表明，乙肝相關性HCC患者的MTDH mRNA及其蛋白的表達水平均高于癌旁組織，且在乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白陽性表達者占58.3%，提示MTDH可能與乙肝相關性HCC的發生有關。
3.3 MTDH蛋白促進乙肝相關性HCC組織的生長、侵襲和轉移
有研究[27]表明，HCC患者的諸多臨床病理特征，包括區域淋巴結轉移、腫瘤分期、微血管浸潤情況等均與HCC患者的預后密切相關。本研究通過免疫組化染色方法檢測了72例乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達情況，并探索了其表達與患者臨床病理特征的關系。結果發現，在乙肝相關性HCC患者中，Edmondson分級、微血管浸潤及淋巴結轉移均與MTDH蛋白的表達相關（P<0.05）。這表明，MTDH蛋白可能在預測乙肝相關性HCC患者的預后方面具有重要的意義；乙肝病毒感染可能促進乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達，從而促進乙肝相關性HCC組織的生長、侵襲和轉移。
總之，本研究結果表明，乙肝相關性HCC組織中存在MTDH mRNA及其蛋白的異常表達；而且在乙肝相關性HCC患者中，Edmondson分級、淋巴結轉移及微血管浸潤情況均與MTDH蛋白的表達相關。該結果提示，MTDH mRNA及其蛋白的高表達可能是乙肝相關性HCC發生的重要機理之一，這對進一步研究乙肝相關性HCC發生的分子機理具有一定的價值。然而，本研究的樣本量較小，乙肝病毒感染是否可以促進MTDH基因及其蛋白的表達及其具體作用機理尚需要大樣本研究進一步探討。
肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界第三大癌癥死因，其最常見的病因是慢性乙肝及乙醇性肝病；有90.0%的HCC繼發于肝硬變，且與慢性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝疾病等有關，但是目前有關其病因及發病的分子機理仍不清楚[1]。臨床上由于其臨床表現的異質性及缺乏有效的分子診斷指標和治療策略，使得HCC的治療尤為困難[2]。通過藥物誘導HCC細胞向良性細胞及正常細胞分化是有效的抗腫瘤治療方向，且癌蛋白靶向治療在乙肝相關性HCC的治療中具有一定的治療前景[3]。人異黏蛋白（metaherin，MTDH）基因定位于8q22，首先從星形膠質瘤細胞中克隆出來；此外，由于HIV感染后星形膠質瘤細胞中其表達水平升高，故其也被稱為膠質瘤升高基因（astrocyte elevated gene 1，AEG-1） [4]。MTDH基因調節著眾多信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、三磷酸酰肌醇蛋白激酶（PI3K/AKT）信號通路及轉錄激活蛋白-1（AP-1）信號通路，在促進腫瘤細胞的增殖、轉移及侵襲中發揮重要作用[5]。目前研究發現，在乳腺癌[6]、膀胱癌[7]等眾多惡性腫瘤中，MTDH基因的表達上調。然而，在乙肝相關性HCC組織中MTDH基因及其蛋白的表達情況，以及其表達對預后判斷的價值如何，研究得較少。本研究檢測了乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織中MTDH mRNA及其蛋白的表達情況，同時探討了乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白表達與患者臨床病理特征的關系。
1 資料和方法
1.1 研究對象
回顧性收集2012年7月至2013年10月期間湖北醫藥學院附屬太和醫院保存的72例乙肝相關性HCC患者的標本。乙肝相關性HCC定義為患者在診斷HCC時具有明確的10年以上的乙肝病毒感染史，且血清HbsAg或標本HBV cDNA呈陽性[8]。72例患者術前均未接受化療或者放療，包括男35例，女37例；年齡25～63歲、（50.8±12.8）歲；腫瘤直徑≤5 cm 36例，>5 cm 36例；腫瘤為單發結節37例，多發結節35例；包膜完整35例，包膜不完整37例；Edmondson分級[9]為Ⅰ級7例，Ⅱ級47例，Ⅲ級18例；巴塞羅納分期（BCLC分期） [10]為0期10例，A期23例，B期30例，C期9例；存在微血管浸潤34例，無微血管浸潤38例；有淋巴結轉移40例，無淋巴結轉移32例。其中10例標本同時具有癌組織和癌旁組織，取癌灶中央組織作為癌組織，取距離腫瘤邊緣以遠2 cm的組織作為癌旁組織。所有組織標本立即凍存于液氮罐中，以備用于后續檢測。
1.2 主要試劑和設備
RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物有限公司，逆轉錄試劑盒及熒光定量核苷酸膠體染料（SYBR）購自大連Takara生物有限公司，免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福建中杉金橋生物有限公司，Western blot配膠試劑盒及蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物有限公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體及鼠抗兔單克隆二抗均購自武漢博士德生物有限公司，兔抗人MTDH蛋白單克隆抗體購自美國Abcam公司。設備：Western blot顯色儀和T100 PCR儀（美國Bio Rad公司）、BioPhotometer plus核酸蛋白檢測儀（德國Eppendorf公司）及MML1500顯微鏡（德國Kruess公司）。Western blot條帶的灰度分析采用Image J 1.46軟件（美國National Institutes of Health公司）。
1.3 方法
1.3.1 RNA提取及逆轉錄熒光定量檢測
分別取已經凍存于液氮罐的乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織100 mg，提取RNA（操作按試劑盒說明書進行）。本實驗提取的RNA的濃度和純度均符合要求，其260 nm和280 nm處的紫外吸光度值（A值）比值在1.80～2.00之間。取2 μg RNA行逆轉錄，逆轉錄步驟按試劑盒說明進行。MTDH基因的引物序列：上游，5′-AAGAGGAAAACTGAGCCATCTG-3′；下游，5′-CGGCTAACATCCCACTGATAAT-3′（擴增長度為200 bp）。內參GAPDH基因的引物序列：上游，5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′；下游，5′-AG-AGGCAGGGATGATGTTCTG-3′（擴增長度為210 bp）。MTDH基因及GAPDH基因引物均由廣州瑞博生物有限公司合成。取2 μL逆轉錄產物DNA行熒光定量PCR（Q-PCR），反應體系同試劑盒說明書；反應條件：95 ℃ 1 min（預變性），94 ℃ 30 s（解聚模板DNA），60 ℃ 30 s（使引物與模板DNA結合），68 ℃ 1 min（擴增模板DNA），反應共計35個循環；70 ℃條件下延伸10 min后結束反應。通過溶解曲線判斷產物的特異性后，根據循環閾值（Ct）結果，采用2-ΔCt法計算MTDH mRNA的相對表達水平，其中ΔCt=CtMTDH-CtGAPDH。實驗重復3次，每一例組織MTDH mRNA的表達水平為3次實驗的均值。
1.3.2 Western blot檢測
分別取已經凍存于液氮罐的乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織100 mg，提取總蛋白（操作按試劑盒說明書進行）。取100 μg提取蛋白行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉膜至硝酸纖維薄膜上，以PBS溶液清洗3次，每次15 min；用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入兔抗人MTDH蛋白單克隆抗體（1∶1 000） 4 ℃過夜后，以PBS溶液清洗3次，每次5 min；加入辣根過氧化酶標記的鼠抗兔單克隆二抗（1∶2 000）孵育1 h后，以PBS溶液清洗3次，每次10 min；加入顯色劑進行顯色，再以X光機讀片。采用Image J 1.46軟件測定MTDH蛋白和GAPDH條帶的灰度值，以MTDH蛋白條帶和GAPDH條帶灰度值的比值作為MTDH蛋白的相對表達水平。
1.3.3 免疫組化染色
將HCC石蠟標本行4 μm厚切片后，置入二甲苯溶液中60 min脫蠟；以梯度乙醇水化后，置入pH值為6的0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液中進行抗原修復15 min（95 ℃）；加入1∶100兔抗人MTDH蛋白單克隆抗體，4 ℃過夜孵育后，以PBS溶液清洗3次，每次5 min；加入辣根過氧化物標記的羊抗兔二抗（1∶2 000）后，于室溫下作用30 min；滴加DAB溶液進行顯色，以蘇木精復染，再以二甲苯溶液透明，最后以中性樹膠封片。通過染色強度及染色百分比結果評價免疫組化結果[11]。染色強度評分定義為：0分，陰性；1分，弱表達；2分，中等表達；3分，強表達。染色百分比定義為：0分，小于21.0%；1分，21.0%～40.0%；2分，41.0%～60.0%；3分，61.0%～80.0%；4分，81.0%～100%。最終染色得分為染色強度評分和染色百分比評分的乘積，7～12分為陽性表達，0～6分為陰性表達。采用PBS溶液代替一抗作為陰性對照，陽性對照采用已知MTDH蛋白呈陽性表達的乳腺癌組織切片。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織中MTDH mRNA及其蛋白表達水平的比較采用配對t檢驗。在乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達與患者臨床病理特征間關系的單因素分析時，計量資料采用兩獨立樣本比較的t檢驗，計數資料采用成組χ2檢驗或確切概率法；多因素分析采用非條件logistic回歸分析，其中α入=0.10，α出=0.15。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 乙肝相關性HCC組織和癌旁組織中MTDH mRNA及其蛋白的表達
Q-PCR結果顯示，乙肝相關性HCC組織中MTDH mRNA的表達水平為8.50±0.84，癌旁組織為4.55±0.81，前者較高（t=10.797，P=0.000）。Western blot檢測結果顯示，乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達水平為0.65±0.24，癌旁組織為0.25±0.16，前者較高（t=6.375，P=0.013），見圖 1。
圖1
示乙肝相關性HCC組織及其癌旁組織中MTDH蛋白的電泳結果。1：乙肝相關性HCC組織；2：癌旁組織 ? ?圖 2 示乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的免疫組化染色結果（SP ×200）。2A：陰性表達；2B：陽性表達
2.2 乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的免疫組化染色結果
顯微鏡下見乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白主要表達于胞漿，部分表達于細胞核。有42例（58.3%）乙肝相關性HCC組織其MTDH蛋白呈陽性表達，30例（41.7%）呈陰性表達（圖 2）。
2.3 乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白表達與患者臨床病理特征的關系
2.3.1 單因素分析結果
單因素分析結果顯示，在乙肝相關性HCC患者中，年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤結節數目、包膜完整情況及Edmondson分級均與乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達情況無關（P>0.05），而BCLC分期、微血管浸潤和淋巴結轉移情況均與MTDH蛋白的表達相關（P<0.05），BCLC分期為C期、有微血管浸潤及有淋巴結轉移者其MTDH蛋白的表達陽性率較高（表 1）。
表1
乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白表達與患者臨床病理特征關系的單因素分析結果
2.3.2 多因素分析結果
多因素回歸分析時納入因素的賦值情況見表 2。將表 2中的所有變量納入logistic回歸模型（變量篩選方法為向前法）。結果顯示，Edmondson分級為Ⅲ級（OR=4.783，95% CI：2.663～11.918，P=0.020）、有微血管浸潤（OR=37.790，95% CI：2.227～99.434，P=0.005）及有淋巴結轉移者（OR=7.332，95% CI：3.325～30.669，P=0.023）其MTDH蛋白的表達陽性率更高（表 3）。
表2
乙肝相關性HCC患者中MTDH蛋白表達及其影響因素的賦值情況
表3
乙肝相關性HCC患者中MTDH蛋白表達影響因素的logistic回歸分析結果
3 討論
3.1 乙肝病毒感染促進HCC的發生與發展
HCC是世界第五大腫瘤，其發生是多因素相互作用的結果，且其病因復雜，發病人數逐漸增多[12]。據估計，僅有約10.0%～20.0%的HCC患者在診斷時尚可耐受手術，但術后5年生存率為28.6%，且術后復發率高達75.0% [13-14]。故研究HCC的發生機理對其預防和治療均具有一定的價值。目前認為，病毒感染與HCC的發生有一定關系。已有研究[15]表明，丙肝病毒的Core蛋白可上調DNA甲基化酶1（DNMT1）的表達，并通過甲基化啟動子而抑制p16蛋白的表達，從而發揮抑制腫瘤生長的作用。此外，我國的慢性乙肝患病率較高，而長期的乙肝病毒感染被認為是HCC高發的重要因素，在乙肝相關性HCC的發病機理中占據重要地位[16-17]。乙肝病毒感染在我國是HCC發生的重要影響因素，其在促進HCC表型轉換及惡性進展中均發揮重要作用，且其逆轉錄區核苷酸基因的多態性及其HbsAg在HCC的發生過程中均具有一定的作用[18-19]。目前已經明確，乙肝病毒感染是原發性HCC的首要病因，約占50.0% [20-21]。研究[22]表明，乙肝病毒及其編碼蛋白對宿主基因（尤其是腫瘤相關調控轉錄基因）的影響在癌癥的發生過程中發揮重要作用。因此，研究乙肝相關性HCC的發病機理及其基因靶向治療均具有一定的價值。
3.2 MTDH基因及其蛋白在乙肝相關性HCC組織中的表達上調
MTDH調節著眾多信號通路，包括MAPK/細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路和PI3K/AKT信號通路[5]。MTDH基因及其蛋白的高表達可促進癌細胞增殖、抑制凋亡、促進上皮-間質轉換及促進侵襲和轉移[23]。抑制MTDH基因及其蛋白的表達對一些惡性腫瘤具有一定的治療價值，如敲除MTDH基因能明顯抑制非小細胞肺癌的侵襲和轉移，誘導細胞凋亡[24]。研究[25]表明，MTDH蛋白與HCC的發生密切相關，HCC組織中高表達MTDH蛋白是患者預后較差的指標之一。Gong等[26]報道，MTDH蛋白在正常肝組織、乙肝病毒感染肝組織及乙肝相關性HCC組織中的表達陽性率分別為0、46.7%和64.4%。MTDH蛋白在乙肝相關性HCC組織中的表達陽性率明顯高于乙肝病毒感染肝組織及正常肝組織，提示MTDH蛋白參與了乙肝相關性HCC的發生與發展，表明乙肝病毒感染可能導致肝細胞中MTDH基因的表達水平異常增高，從而導致腫瘤進展，但具體作用機理目前并不清楚。本研究結果表明，乙肝相關性HCC患者的MTDH mRNA及其蛋白的表達水平均高于癌旁組織，且在乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白陽性表達者占58.3%，提示MTDH可能與乙肝相關性HCC的發生有關。
3.3 MTDH蛋白促進乙肝相關性HCC組織的生長、侵襲和轉移
有研究[27]表明，HCC患者的諸多臨床病理特征，包括區域淋巴結轉移、腫瘤分期、微血管浸潤情況等均與HCC患者的預后密切相關。本研究通過免疫組化染色方法檢測了72例乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達情況，并探索了其表達與患者臨床病理特征的關系。結果發現，在乙肝相關性HCC患者中，Edmondson分級、微血管浸潤及淋巴結轉移均與MTDH蛋白的表達相關（P<0.05）。這表明，MTDH蛋白可能在預測乙肝相關性HCC患者的預后方面具有重要的意義；乙肝病毒感染可能促進乙肝相關性HCC組織中MTDH蛋白的表達，從而促進乙肝相關性HCC組織的生長、侵襲和轉移。
總之，本研究結果表明，乙肝相關性HCC組織中存在MTDH mRNA及其蛋白的異常表達；而且在乙肝相關性HCC患者中，Edmondson分級、淋巴結轉移及微血管浸潤情況均與MTDH蛋白的表達相關。該結果提示，MTDH mRNA及其蛋白的高表達可能是乙肝相關性HCC發生的重要機理之一，這對進一步研究乙肝相關性HCC發生的分子機理具有一定的價值。然而，本研究的樣本量較小，乙肝病毒感染是否可以促進MTDH基因及其蛋白的表達及其具體作用機理尚需要大樣本研究進一步探討。
