引用本文： 胡超華, 丁佑銘. Fas/FasL在肝癌細胞中的表達與肝癌浸潤轉移關系相關性研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(1): 99-101. doi: 10.7507/1007-9424.20150025 復制
Fas/Fas-L系統是介導機體細胞凋亡的重要調節機理，與腫瘤的免疫逃避密切相關[1]。Fas/Fas-L系統中Fas與Fas-L結合，可誘導靶細胞凋亡[2]。本研究應用免疫組織化學方法檢測了20例有浸潤轉移和40例無浸潤轉移肝細胞癌組織及10例肝良性腫瘤（肝血管瘤、肝囊腫）組織中Fas和Fas-L蛋白的表達，并分析其與肝細胞癌浸潤轉移的關系。
1 資料與方法
1.1 標本來源
60例肝細胞癌及10例肝良性腫瘤病變均來自2008～2013年期間湖北省孝感市中心醫院病理科手術切除的標本。60例肝細胞癌患者中腫瘤浸潤周圍肝實質或肝內轉移20例，無浸潤且無肝內轉移40例。
1.2 主要試劑
一抗：兔抗人Fas（C-20）：sc-715多克隆抗體和兔抗人Fas-L(N-20)：sc-834多克隆抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。通用型二抗試劑盒購自中杉金橋PV-6000-G。
1.3 檢測指標及方法
采用免疫組織化學方法檢測納入本研究的組織標本中Fas和Fas-L蛋白的表達，染色過程按照試劑盒說明操作，用PBS代替一抗作陰性對照，Fas和Fas-L一抗的工作液濃度均為1︰100。結果判定按照許良中等[3]的方法，對染色結果即染色強度和陽性細胞所占百分比采用統一標準和雙盲法判斷。先對細胞染色強度評分：無染色為0分，染淺黃色為1分，染棕黃色為2分，染棕褐色為3分；再對陽性細胞所占百分比評分：0分，陰性；1分，陽性細胞所占百分比為10%；2分，陽性細胞所占百分比為11%～50%；3分，陽性細胞所占百分比為51%～75%；4分，陽性細胞所占百分比為> 75%。再根據染色強度分值與陽性細胞所占百分比分值的乘積結果分為4個等級：（-），0～2分；（+），3～4分；（++），6～8分；（+++），9～12分。≥3分為陽性。
1.4 統計學方法
實驗結果用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，各組間樣本率差異的比較采用χ2檢驗；若頻數有較小值（≤5），2組間比較則采用連續性校正χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Fas和Fas-L蛋白表達檢測結果
Fas蛋白在肝細胞癌及肝良性腫瘤組織中均有表達，在肝良性腫瘤組織主要表達于腫瘤細胞膜，呈棕黃色，部分呈棕褐色，以網格狀分布；而在肝細胞癌組織則可見細胞膜和細胞漿兩種表達，并以細胞漿表達為主，呈顆粒狀分布。Fas-L蛋白在肝細胞癌及肝良性腫瘤細胞中也均有表達，且均表達于細胞漿，呈棕黃色或棕褐色，以片狀分布為主，有散在的顆粒狀分布（圖 1～4）。
圖1
示Fas在肝細胞癌細胞漿表達(免疫組化染色×400)??圖 2示Fas-L在肝細胞癌細胞漿表達(免疫組化染色×400)??圖 3示Fas在肝良性病變細胞膜表達(免疫組化染色×200)??圖 4示Fas-L在肝良性病變細胞漿表達(免疫組化染色×200)
本組60例肝細胞癌患者中Fas及Fas-L蛋白表達陽性率分別為70.00%和68.33%，10例肝臟良性腫瘤患者Fas及Fas-L蛋白表達陽性率均為30.00%。Fas和Fas-L蛋白在肝細胞癌中的表達陽性率高于肝良性腫瘤者，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
Fas及Fas-L蛋白在肝細胞癌和肝良性腫瘤組織中的表達
2.2 Fas及Fas-L蛋白的表達與肝細胞癌浸潤或轉移的關系
Fas和Fas-L蛋白在肝細胞癌組織中的表達與腫瘤的浸潤和轉移有關（P < 0.01），且在20例有浸潤或轉移的肝細胞癌組織中，Fas及Fas-L蛋白表達陽性率均為95.00%（19/20）。見表 2。
表2
有或無浸潤轉移的肝細胞癌中Fas及Fas-L蛋白的表達
3 討論
Fas/Fas-L系統介導的細胞凋亡與腫瘤的發生發展、浸潤及轉移密切相關[4-5]。肝細胞癌組織高表達Fas-L，可與表達Fas的浸潤活化型T淋巴細胞結合導致T淋巴細胞凋亡而避免自身凋亡，從而逃避免疫系統的攻擊，反向促進肝癌細胞增殖，生長。Hammam等[6]的研究證實了這一點。并且李海民等[7]研究發現，在肝癌癌旁組織中Fas-L呈現高表達，可誘導浸潤淋巴細胞發現凋亡，使肝癌細胞逃脫機體的免疫殺傷。本研究結果顯示：肝細胞癌組織中Fas-L表達陽性率為68.33%，明顯高于肝臟良性腫瘤組織的30.00%。與Hammam等研究結果一致。
Fas在肝癌組織中的表達情況有研究[8-9]結果顯示：肝癌細胞Fas表達下調，從而逃避Fas/Fas-L系統介導的靶細胞凋亡，使肝癌細胞獲得不斷增殖的能力。本研究結果與之相悖，在肝細胞癌組織中，Fas和Fas-L均呈高表達，且Fas和Fas-L高表達發生在相同區域；Fas和Fas-L在肝細胞癌組織中的表達陽性率均較肝臟良性腫瘤組織明顯升高。Wang等[10]的研究有相同的發現。
肝細胞癌組織中Fas高表達發生Fas/Fas-L系統介導的靶細胞凋亡抵抗，其解釋是多方面的。首先，肝癌細胞中胞漿型Fas可以以胞吐的分泌方式釋放到外周血，形成可溶性Fas（sFas），sFas可競爭性選擇與外周免疫細胞Fas-L結合，干擾全身免疫系統，下調、抑制腫瘤免疫反應，使肝癌細胞免于腫瘤免疫殺傷；并且sFas競爭性阻斷免疫細胞Fas-L與腫瘤細胞胞膜型Fas結合，導致表達Fas的腫瘤細胞逃避Fas/Fas-L系統介導的靶細胞凋亡。Hammam等[6]研究發現，肝癌患者血清常高表達sFas，促成肝癌逃避腫瘤免疫監視，加速肝癌癌變過程。Fabregat等[11]的研究也證實了這一點。王平等[12]研究顯示：可溶性Fas可阻斷肝癌細胞通過Fas/Fas-L途徑觸發淋巴細胞發生凋亡。其次，本研究發現肝癌細胞中有部分胞膜型Fas，考慮可能為無功能性Fas或者Fas蛋白功能區決定域被截斷，導致凋亡信號內傳導障礙，耐受了Fas/Fas-L系統介導的靶細胞凋亡。這種可能仍待進一步研究證實。
本研究結果顯示：60例肝細胞癌患者中Fas和Fas-L蛋白的表達陽性率分別為70.00%及68.33%，10例肝臟良性腫瘤患者中Fas及Fas-L蛋白的表達陽性率均為30.00%，Fas蛋白在肝細胞癌中的表達陽性率明顯高于肝臟良性腫瘤組織。提示肝細胞發展成肝癌細胞的過程中，肝細胞表面Fas的表達升高，促使肝癌細胞易于被效應細胞識別殺傷。關壇等[13]的研究支持這一觀點。Fas-L蛋白在肝細胞癌中的表達率高于肝良性病變。該結果提示可能存在在肝癌病變中癌細胞通過Fas/Fas-L誘導浸潤淋巴細胞發生凋亡，其淋巴細胞凋亡的活躍與否與腫瘤的惡變及轉移有密切相關性。可以認為，Fas-L在肝癌的發生發展過程中，充當了促癌因子，同時對于Fas所介導的腫瘤免疫細胞也同樣存在促凋亡作用。而肝良性病變組織Fas-L呈低表達，提示肝良性病變組織細胞存在較低異常腫瘤免疫介導損傷。黎洪浩等[14]的研究有類似的發現，其結果顯示：Fas-L在肝癌標本中呈高表達，而在正常肝臟組織中其表達顯著降低。
本研究結果還顯示：肝細胞癌組織中Fas及Fas-L的表達與腫瘤的浸潤和轉移有相關性，20例有浸潤和轉移的肝細胞癌患者Fas和Fas-L表達陽性率均為95.00%（19/20），明顯高于無浸潤和無轉移者，提示Fas及Fas-L高表達的腫瘤細胞具有更強的浸潤轉移能力。Lee等[15]的研究報道，用免疫組化的方法檢測肝細胞癌組織中Fas-L的表達并分析其與患者預后的關系，發現表達Fas-L的肝細胞癌患者術后生存時間為（10.83±1.90）個月，不表達Fas-L的肝細胞癌患者術后生存時間為（43.51±7.02）個月，差異有統計學意義，認為Fas-L的表達可以作為肝細胞癌患者預后的獨立危險因素，進一步支持本研究的觀點。故筆者認為，肝細胞癌組織中Fas和Fas-L的表達很有可能作為判斷腫瘤浸潤轉移能力的指標。
本研究結果提示，浸潤轉移的肝細胞癌組織中Fas和Fas-L呈現高表達，進一步研究Fas及Fas-L在肝癌浸潤轉移的具體作用機理，將有望針對Fas及Fas-L的靶向治療為肝癌免疫治療提供新思路和理論依據。
Fas/Fas-L系統是介導機體細胞凋亡的重要調節機理，與腫瘤的免疫逃避密切相關[1]。Fas/Fas-L系統中Fas與Fas-L結合，可誘導靶細胞凋亡[2]。本研究應用免疫組織化學方法檢測了20例有浸潤轉移和40例無浸潤轉移肝細胞癌組織及10例肝良性腫瘤（肝血管瘤、肝囊腫）組織中Fas和Fas-L蛋白的表達，并分析其與肝細胞癌浸潤轉移的關系。
1 資料與方法
1.1 標本來源
60例肝細胞癌及10例肝良性腫瘤病變均來自2008～2013年期間湖北省孝感市中心醫院病理科手術切除的標本。60例肝細胞癌患者中腫瘤浸潤周圍肝實質或肝內轉移20例，無浸潤且無肝內轉移40例。
1.2 主要試劑
一抗：兔抗人Fas（C-20）：sc-715多克隆抗體和兔抗人Fas-L(N-20)：sc-834多克隆抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。通用型二抗試劑盒購自中杉金橋PV-6000-G。
1.3 檢測指標及方法
采用免疫組織化學方法檢測納入本研究的組織標本中Fas和Fas-L蛋白的表達，染色過程按照試劑盒說明操作，用PBS代替一抗作陰性對照，Fas和Fas-L一抗的工作液濃度均為1︰100。結果判定按照許良中等[3]的方法，對染色結果即染色強度和陽性細胞所占百分比采用統一標準和雙盲法判斷。先對細胞染色強度評分：無染色為0分，染淺黃色為1分，染棕黃色為2分，染棕褐色為3分；再對陽性細胞所占百分比評分：0分，陰性；1分，陽性細胞所占百分比為10%；2分，陽性細胞所占百分比為11%～50%；3分，陽性細胞所占百分比為51%～75%；4分，陽性細胞所占百分比為> 75%。再根據染色強度分值與陽性細胞所占百分比分值的乘積結果分為4個等級：（-），0～2分；（+），3～4分；（++），6～8分；（+++），9～12分。≥3分為陽性。
1.4 統計學方法
實驗結果用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，各組間樣本率差異的比較采用χ2檢驗；若頻數有較小值（≤5），2組間比較則采用連續性校正χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Fas和Fas-L蛋白表達檢測結果
Fas蛋白在肝細胞癌及肝良性腫瘤組織中均有表達，在肝良性腫瘤組織主要表達于腫瘤細胞膜，呈棕黃色，部分呈棕褐色，以網格狀分布；而在肝細胞癌組織則可見細胞膜和細胞漿兩種表達，并以細胞漿表達為主，呈顆粒狀分布。Fas-L蛋白在肝細胞癌及肝良性腫瘤細胞中也均有表達，且均表達于細胞漿，呈棕黃色或棕褐色，以片狀分布為主，有散在的顆粒狀分布（圖 1～4）。
圖1
示Fas在肝細胞癌細胞漿表達(免疫組化染色×400)??圖 2示Fas-L在肝細胞癌細胞漿表達(免疫組化染色×400)??圖 3示Fas在肝良性病變細胞膜表達(免疫組化染色×200)??圖 4示Fas-L在肝良性病變細胞漿表達(免疫組化染色×200)
本組60例肝細胞癌患者中Fas及Fas-L蛋白表達陽性率分別為70.00%和68.33%，10例肝臟良性腫瘤患者Fas及Fas-L蛋白表達陽性率均為30.00%。Fas和Fas-L蛋白在肝細胞癌中的表達陽性率高于肝良性腫瘤者，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
Fas及Fas-L蛋白在肝細胞癌和肝良性腫瘤組織中的表達
2.2 Fas及Fas-L蛋白的表達與肝細胞癌浸潤或轉移的關系
Fas和Fas-L蛋白在肝細胞癌組織中的表達與腫瘤的浸潤和轉移有關（P < 0.01），且在20例有浸潤或轉移的肝細胞癌組織中，Fas及Fas-L蛋白表達陽性率均為95.00%（19/20）。見表 2。
表2
有或無浸潤轉移的肝細胞癌中Fas及Fas-L蛋白的表達
3 討論
Fas/Fas-L系統介導的細胞凋亡與腫瘤的發生發展、浸潤及轉移密切相關[4-5]。肝細胞癌組織高表達Fas-L，可與表達Fas的浸潤活化型T淋巴細胞結合導致T淋巴細胞凋亡而避免自身凋亡，從而逃避免疫系統的攻擊，反向促進肝癌細胞增殖，生長。Hammam等[6]的研究證實了這一點。并且李海民等[7]研究發現，在肝癌癌旁組織中Fas-L呈現高表達，可誘導浸潤淋巴細胞發現凋亡，使肝癌細胞逃脫機體的免疫殺傷。本研究結果顯示：肝細胞癌組織中Fas-L表達陽性率為68.33%，明顯高于肝臟良性腫瘤組織的30.00%。與Hammam等研究結果一致。
Fas在肝癌組織中的表達情況有研究[8-9]結果顯示：肝癌細胞Fas表達下調，從而逃避Fas/Fas-L系統介導的靶細胞凋亡，使肝癌細胞獲得不斷增殖的能力。本研究結果與之相悖，在肝細胞癌組織中，Fas和Fas-L均呈高表達，且Fas和Fas-L高表達發生在相同區域；Fas和Fas-L在肝細胞癌組織中的表達陽性率均較肝臟良性腫瘤組織明顯升高。Wang等[10]的研究有相同的發現。
肝細胞癌組織中Fas高表達發生Fas/Fas-L系統介導的靶細胞凋亡抵抗，其解釋是多方面的。首先，肝癌細胞中胞漿型Fas可以以胞吐的分泌方式釋放到外周血，形成可溶性Fas（sFas），sFas可競爭性選擇與外周免疫細胞Fas-L結合，干擾全身免疫系統，下調、抑制腫瘤免疫反應，使肝癌細胞免于腫瘤免疫殺傷；并且sFas競爭性阻斷免疫細胞Fas-L與腫瘤細胞胞膜型Fas結合，導致表達Fas的腫瘤細胞逃避Fas/Fas-L系統介導的靶細胞凋亡。Hammam等[6]研究發現，肝癌患者血清常高表達sFas，促成肝癌逃避腫瘤免疫監視，加速肝癌癌變過程。Fabregat等[11]的研究也證實了這一點。王平等[12]研究顯示：可溶性Fas可阻斷肝癌細胞通過Fas/Fas-L途徑觸發淋巴細胞發生凋亡。其次，本研究發現肝癌細胞中有部分胞膜型Fas，考慮可能為無功能性Fas或者Fas蛋白功能區決定域被截斷，導致凋亡信號內傳導障礙，耐受了Fas/Fas-L系統介導的靶細胞凋亡。這種可能仍待進一步研究證實。
本研究結果顯示：60例肝細胞癌患者中Fas和Fas-L蛋白的表達陽性率分別為70.00%及68.33%，10例肝臟良性腫瘤患者中Fas及Fas-L蛋白的表達陽性率均為30.00%，Fas蛋白在肝細胞癌中的表達陽性率明顯高于肝臟良性腫瘤組織。提示肝細胞發展成肝癌細胞的過程中，肝細胞表面Fas的表達升高，促使肝癌細胞易于被效應細胞識別殺傷。關壇等[13]的研究支持這一觀點。Fas-L蛋白在肝細胞癌中的表達率高于肝良性病變。該結果提示可能存在在肝癌病變中癌細胞通過Fas/Fas-L誘導浸潤淋巴細胞發生凋亡，其淋巴細胞凋亡的活躍與否與腫瘤的惡變及轉移有密切相關性。可以認為，Fas-L在肝癌的發生發展過程中，充當了促癌因子，同時對于Fas所介導的腫瘤免疫細胞也同樣存在促凋亡作用。而肝良性病變組織Fas-L呈低表達，提示肝良性病變組織細胞存在較低異常腫瘤免疫介導損傷。黎洪浩等[14]的研究有類似的發現，其結果顯示：Fas-L在肝癌標本中呈高表達，而在正常肝臟組織中其表達顯著降低。
本研究結果還顯示：肝細胞癌組織中Fas及Fas-L的表達與腫瘤的浸潤和轉移有相關性，20例有浸潤和轉移的肝細胞癌患者Fas和Fas-L表達陽性率均為95.00%（19/20），明顯高于無浸潤和無轉移者，提示Fas及Fas-L高表達的腫瘤細胞具有更強的浸潤轉移能力。Lee等[15]的研究報道，用免疫組化的方法檢測肝細胞癌組織中Fas-L的表達并分析其與患者預后的關系，發現表達Fas-L的肝細胞癌患者術后生存時間為（10.83±1.90）個月，不表達Fas-L的肝細胞癌患者術后生存時間為（43.51±7.02）個月，差異有統計學意義，認為Fas-L的表達可以作為肝細胞癌患者預后的獨立危險因素，進一步支持本研究的觀點。故筆者認為，肝細胞癌組織中Fas和Fas-L的表達很有可能作為判斷腫瘤浸潤轉移能力的指標。
本研究結果提示，浸潤轉移的肝細胞癌組織中Fas和Fas-L呈現高表達，進一步研究Fas及Fas-L在肝癌浸潤轉移的具體作用機理，將有望針對Fas及Fas-L的靶向治療為肝癌免疫治療提供新思路和理論依據。
